穩(wěn)定敲降Prx II基因?qū)SG-7701細(xì)胞系抗氧化作用的影響

賀鑫梅，王媛，馮耀元，毛瑩瑩，邢曉婭，向虹怡，郭曉宇，韓英浩，金美華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是一類含氧物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)十分活潑，并且具有很強(qiáng)的氧化能力，是細(xì)胞代謝中的一種不可避免的產(chǎn)物[1]，包括超氧陰離子自由基、羥基自由基以及過氧化氫等[2]。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及清除處在一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)一些外界的因素以及自身原因打破這一平衡時(shí)，大量的ROS積累，造成DNA的損傷、蛋白質(zhì)的氧化和脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[3]。根據(jù)ROS的來源、細(xì)胞類型以及組織環(huán)境不同，ROS信號(hào)可能導(dǎo)致代謝功能障礙和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病，如酒精性肝病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和中風(fēng)等的發(fā)生[4-8]。

肝臟是人體重要的解毒器官，是各種藥物、化學(xué)物質(zhì)代謝的場所，肝臟在代謝物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的過量ROS，損害肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成肝內(nèi)脂肪積累和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，嚴(yán)重危害人體健康。為了抵抗代謝過程中產(chǎn)生的過量ROS，肝臟內(nèi)有超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽等酶及維生素A和維生素C等抗氧化劑清除ROS[9]。除了以上經(jīng)典的抗氧化酶和抗氧化劑外，Peroxiredoxins（Prxs）蛋白是一類具有抗氧化作用的蛋白家族，廣泛存在于抗氧化防御和氧化還原信號(hào)通路中，此外在真核生物以及原核生物中普遍存在[10]。根據(jù)Cys殘基的位置和數(shù)目可分為2-Cys（Prx I-Prx IV）、非典型2-Cys（Prx V）和1-Cys（Prx VI）[11]。Prxs蛋白家族含有的活性半胱氨基位點(diǎn)能夠氧化H2O2，以此將細(xì)胞中多余的ROS清除，使細(xì)胞受到保護(hù)，不被損傷[12]。而PrxⅡ作為Prxs家族的一員，可將H2O2還原成水，并在氧化應(yīng)激的條件下表達(dá)上調(diào)以清除細(xì)胞內(nèi)多余的ROS[13-15]。

慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒改造而成，是一種高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，它能夠?qū)⑼庠椿蛐蛄蟹€(wěn)定導(dǎo)入分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，并可在宿主體內(nèi)長期表達(dá)，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，是基因功能研究和基因治療中一種不可多得的優(yōu)良的載體[16-18]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。它本身是生物進(jìn)化過程中細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，機(jī)體可因此避免外源性基因（如病毒、轉(zhuǎn)座子）在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，清除一些生命發(fā)育過程中出現(xiàn)的異常mRNA。如今，已經(jīng)把它作為沉默目的基因表達(dá)的一種有效手段。慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)與傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)相比，能夠獲得更加穩(wěn)定的基因敲降效果，是用于研究某個(gè)特定基因功能的理想方法[16-20]。

利用慢病毒載體將Prx II基因特異性ShRNA轉(zhuǎn)入人肝細(xì)胞系QSG-7701，利用嘌呤霉素進(jìn)行篩選獲得Prx II敲降的穩(wěn)定細(xì)胞系，并對細(xì)胞處理不同濃度的H2O2，以研究缺失Prx II后對肝臟細(xì)胞抗氧化性的影響。同時(shí)，Prx II敲降的穩(wěn)定細(xì)胞系的建立也為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人肝細(xì)胞系QSG-7701（由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)分子病理與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 藥品與試劑

DMEM（Hyclone公司），F(xiàn)BS（Gibico公司），P/S（Gibico公司），TE（北京Solarbio），Hank’s洗液（Hyclone公司），Prx II空白慢病毒載體（上海吉瑪基因），Prx II敲降慢病毒載體（上海吉瑪基因），puromycin dihydrochloride（Gene Operation），MTT（Amreso），DMSO（天津市富宇試劑），H2O2（西格瑪公司），PBS（Hyclone公司），Prx II抗體（Abfrontier），βactin抗體（博奧森生物）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

慢病毒載體是以國際通用的第三代載體為基礎(chǔ)，通過上海吉瑪基因的改建，構(gòu)成四質(zhì)粒體系，如圖1，將其刪除了全部HIV-1的編碼基因，所以在介導(dǎo)目的基因的表達(dá)時(shí)，沒有任何HIV-1蛋白的表達(dá)，而且對5’和3’LTR分別進(jìn)行了刪除改造，5’LTR缺失U3，換上RSV promoter，使載體的復(fù)制不再依賴Tat，3’LTR刪除U3，使其不再具有啟動(dòng)活性，成為自滅活（self-inactivating，SIN）載體。

圖1 慢病毒質(zhì)粒圖譜Fig.1 Lentivirus plasmid profile

1.2.2 病毒滴度測定

將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取10μL待測定的病毒原液，用含10%FBS培養(yǎng)液十倍稀釋3～5個(gè)梯度。次日，吸棄96孔板的培養(yǎng)液，每孔加入100μL稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對照組，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，吸棄96孔板中的病毒液，每孔加入100μL 10%FBS的DMEM培液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。期間每隔24 h進(jìn)行換液。通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度，用TU·ml-1（感染單位/毫升）表示。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞

將生長狀況良好的細(xì)胞，以每毫升3.5×105個(gè)的密度種到6孔板，分為3組（標(biāo)記為Blank，Scramble，Sh-Prx II）。第二天，對三組細(xì)胞進(jìn)行換液，并根據(jù)預(yù)先測定的MOI值（MOI值為4.6）向Scramble和Sh-Prx II里面分別加入適量的空白載體病毒液和慢病毒液，進(jìn)行培養(yǎng)。第三天，觀察生長狀況，將三組細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代，傳到六孔板，每組各種兩個(gè)孔板。第四天，棄去培養(yǎng)液，更換為新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，將種于六孔板中的三組細(xì)胞的兩個(gè)孔板合并，傳至6 cm培養(yǎng)皿。第六天，細(xì)胞量增多，將細(xì)胞傳到10 cm培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)。第七天，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。第八天，將三組細(xì)胞1∶2傳代至兩個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，進(jìn)行培養(yǎng)。第九天，三組細(xì)胞更換新培養(yǎng)液，使用2μL（10 mg·mL-1）嘌呤霉素處理，篩選出轉(zhuǎn)染細(xì)胞，當(dāng)Blank細(xì)胞全部死亡后，棄去培養(yǎng)液，更換為新的培養(yǎng)液。將細(xì)胞傳代至3.5 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率

將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞從培養(yǎng)皿中使用胰蛋白酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA，TE）處理后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，每個(gè)離心管加1 ml PBS，吹打混勻后，在BD公司的FACScalibur上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，作出結(jié)果圖。

1.2.5 熒光照相檢測轉(zhuǎn)染效率

將生長狀況良好的三組細(xì)胞TE處理后，離心，培養(yǎng)液吹打混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取三個(gè)1.5 mL的離心管，標(biāo)記為Blank、Scramble、Sh-Prx II，每個(gè)加入160 mL的培養(yǎng)液，20 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，20 mL對應(yīng)的細(xì)胞懸液，混勻后于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，Blank、Scramble、Sh-Prx II三組細(xì)胞分別為32個(gè)、21個(gè)、22個(gè)。每個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿中種3×105個(gè)細(xì)胞，根據(jù)公式：（細(xì)胞計(jì)數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（此處稀釋倍數(shù)為10），計(jì)算出每個(gè)培養(yǎng)皿所需細(xì)胞懸液體積，將其均勻種于培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，熒光顯微鏡下檢測發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測Prx II蛋白表達(dá)

①將Blank，Scramble，Sh-Prx II三組細(xì)胞用TE處理后，把細(xì)胞從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液后，PBS清洗一遍，3 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清。②在細(xì)胞球中加入120μL蛋白質(zhì)裂解液，將離心管置于冰上，每5 min敲打一次，30 min后將離心管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，12 000 r·min-1離心30 min。③離心結(jié)束后，將離心管轉(zhuǎn)移至冰上，用200μL的移液槍吸取上清液，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的離心管中。④取新的1.5 mL的離心管，向其中加入800μL的蒸餾水，200μL的考馬斯亮藍(lán)，1μL提取的總蛋白質(zhì)樣品后在震蕩器上混勻，并用1 mL的移液槍將其轉(zhuǎn)移至比色皿中，將比色皿放入分光光度計(jì)中，調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的波長為595 nm，檢測其OD值。⑤將檢測的OD值代入蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)公式，計(jì)算出總蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出配制樣品所需的蛋白、5×buffer、DDW所需體積，配制跑膠樣品。配制完成后，在沸水中煮樣5 min，煮完立即放進(jìn)4℃冰箱。⑥配制SDS-PAGE的下層分離膠，分離膠的濃度是12%，凝固后配置SDS-PAGE的上層濃縮膠，濃縮膠的濃度是5%，待凝固后將SDS-PAGE移入電泳槽中，并向其中加入電泳液。⑦從4℃中取出樣品，使用20μl的移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣，樣品每孔點(diǎn)15μL，蛋白maker每孔點(diǎn)2μL，電壓140 V，電泳80 min左右。⑧跑膠結(jié)束后，4℃條件下，電流110 A過夜轉(zhuǎn)膜，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜，1%的麗春紅進(jìn)行染色，蛋白條帶顯色后，剪下所需的條帶，TBST洗至液體沒有紅色。⑨5%的脫脂乳室溫封閉1 h，TBST洗5次，每次5 min，加入1∶1 000的一抗進(jìn)行目的蛋白的特異性免疫印跡，室溫下2 h，再用TBST洗5次，每次5 min，加入5%的脫脂乳室溫封閉10 min，1∶5 000的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。⑩ECL顯影，利用熒光成像系統(tǒng)獲得目的蛋白的條帶。

1.2.7 細(xì)胞毒性檢測

將生長狀況良好的Scramble和Sh-Prx II，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔104個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板，一 共 設(shè) 置6個(gè) 濃 度 梯 度（0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25 mmol·L-1），每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日，吸棄培養(yǎng)液，加入含1%血清的培養(yǎng)液，饑餓處理2 h后，加入配置好的H2O2，1μL·孔-1，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天，每孔加入10μLMTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL的DMSO，37℃下處理10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測其吸光度值。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染QSG-7701細(xì)胞的效率

為了確定慢病毒是否成功轉(zhuǎn)染了QSG-7701細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，Scramble組細(xì)胞、shPrx II組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為98.80%、99.48%，如圖2所示。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測慢病毒轉(zhuǎn)染QSG-7701細(xì)胞的效率Fig.2 FACSdetection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx II shRNA lentivirus

2.2 熒光照相檢測慢病毒轉(zhuǎn)染QSG-7701細(xì)胞的效率

為了進(jìn)一步確定慢病毒對QSG-7701細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，對三組細(xì)胞進(jìn)行了熒光照相，結(jié)果顯示，在熒光視野下，Blank組的細(xì)胞無任何細(xì)胞發(fā)綠色熒光，Scramble組和Sh-Prx II組發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量占同一區(qū)域明亮視野下細(xì)胞量90%以上，如圖3所示，表明90%的細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染。

圖3 熒光顯微鏡檢測慢病毒轉(zhuǎn)染QSG-7701細(xì)胞的效率Fig.3 Fluorescence microscope detection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx IIshRNA lentivirus

2.3 Prx II基因敲降結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證Prx II基因的敲降情況，將慢病毒轉(zhuǎn)染后的QSG-7701細(xì)胞進(jìn)行傳代，之后進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，分別檢測Blank，Scramble，Sh-Prx II三組的Prx II蛋白的表達(dá)情況，選用β-actin做內(nèi)參。結(jié)果圖4 A、B（**P＜0.01，*P＜0.05）顯示，Sh-Prx II組的Prx II蛋白水平明顯低于Blank組和Scramble組，表明成功構(gòu)建了Prx II敲降的細(xì)胞系。

圖4 蛋白免疫印跡檢測慢病毒敲降QSG-7701細(xì)胞中Prx II的效果Fig.4 Expression level of Prx II in QSG-7701 by western blot

2.4 Prx II敲降后細(xì)胞的抗氧化作用下降

為了探究Prx II敲降后對QSG-7701細(xì)胞抗氧化性的影響，利用MTT assay檢測不同濃度H2O2對Scramble組和Sh-Prx II組的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，在H2O2濃度大于0.15 mmol·L-1后，Sh-Prx II組的細(xì)胞存活率低于Scramble，如圖5（**P＜0.01，*P＜0.05），表明在Prx II敲降后，細(xì)胞的抗氧化作用下降。

圖5 MTT assay檢測H 2O2對QSG-7701細(xì)胞中Prx II敲降后的存活率Fig.5 Detection of survival rate of H2O2 process QSG-7701 cells after Prx II knockout by MTT assay

3 討論

Prx II是Prxs家族中的一員，具有抗氧化及清除自由基作用，參與細(xì)胞的增生和分化，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。并且隨著研究的深入，該蛋白家族的生理生化功能不斷被發(fā)現(xiàn)，Prxs家族在多種腫瘤細(xì)胞中都高表達(dá)，與腫瘤之間的關(guān)系值得進(jìn)一步探索[21-22]。近些年，Prxs家族在肝病中的保護(hù)作用被廣泛研究，肝病分為酒精性肝病和非酒精性肝病，初期表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為肝炎，肝纖維化，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝硬化或肝癌的發(fā)生，是威脅人類健康的一大隱患。肝細(xì)胞內(nèi)異常脂質(zhì)代謝和過量ROS的產(chǎn)生引起的脂肪過量堆積將造成非酒精性脂肪肝的形成，Prx V過表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞質(zhì)和線粒體ROS的產(chǎn)生，此外，Prx V調(diào)控AMP激活蛋白激酶通路和脂肪生成基因（固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1和脂肪酸合成酶）的表達(dá)，抑制脂質(zhì)積累，從而改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性[23]。ROS被認(rèn)為在酒精性脂肪性肝病中起重要作用，肝脂肪變性和隨后的脂肪性肝病是酒精攝入的反應(yīng)[24]。有研究表明酒精飼喂的小鼠中Prx I對ROS清除作用更強(qiáng)，Prx I對酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟具有保護(hù)作用[25]。酒精喂養(yǎng)的Prx II基因敲除的小鼠和野生型小鼠，Prx II基因敲除的小鼠肝脂肪變性更加嚴(yán)重，表明Prx II對小鼠肝臟也有保護(hù)作用[26]。另外也有研究表明，Prx III通過清除活性氧來調(diào)節(jié)10號(hào)染色體上缺失的張力同源物（PTEN）的氧化還原，對酒精暴露時(shí)的脂肪生成具有拮抗作用[24]。

利用慢病毒載體介導(dǎo)Prx II基因特異性shRNA侵染人肝細(xì)胞系QSG-7701，通過流式細(xì)胞術(shù)以及熒光顯微鏡檢測，結(jié)果顯示，Scramble組細(xì)胞、shPrx II組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為98.80%、99.48%，Scramble組和Sh-Prx II組發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量占同一區(qū)域明亮視野下細(xì)胞量90%以上，表明慢病毒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。之后對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，與Scramble組對比，Sh-Prx II組Prx II蛋白的表達(dá)明顯降低，表明獲得了Prx II敲降的穩(wěn)定細(xì)胞系。隨后使用不同濃度的H2O2處理Scramble和Sh-Prx II兩組細(xì)胞，MTT assay檢測細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞的存活率顯著下降，表明Prx II敲降后，QSG-7701細(xì)胞對H2O2的清除能力下降，即細(xì)胞的抗氧化作用受到了抑制。實(shí)驗(yàn)所采用的QSG-7701細(xì)胞系是目前與肝臟相關(guān)研究中運(yùn)用較廣泛的一種細(xì)胞系，因此構(gòu)建Prx II敲降的QSG-7701細(xì)胞系為肝臟疾病的治療提供技術(shù)支撐，并且初步探究Prx II對細(xì)胞抗氧化作用的影響，為后續(xù)闡明Prx II對肝細(xì)胞功能的調(diào)控作用提供新思路。