鵝p21基因克隆、啟動子分析及轉錄調控研究

陳 哲，楊鵬霞，雷明明，陳佳彬，閆樂艷

(1.江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所，南京 210014；2.農業(yè)農村部長江中下游設施農業(yè)工程重點實驗室，南京 210014；3.泰州市金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，泰州 225319)

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，對維持機體組織、器官功能完整性具有關鍵作用。細胞周期受細胞周期素(Cyclin)、細胞周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)和細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CKIs)的共同調控。p21基因是最早被發(fā)現具有CKIs活性的轉錄因子，通過特異性失活CDKs調控細胞周期停滯，是抑制細胞增殖、調節(jié)細胞分化的中心事件[1]。研究證明，p21基因在家禽卵泡發(fā)育[2]、哺乳動物卵子成熟[3]和胚胎發(fā)育[4-5]過程中具有重要調節(jié)作用。

p21是多個信號通路的中間節(jié)點[6]，其基因功能及轉錄調控機制非常復雜，啟動子區(qū)多個調控元件(如Sp1、C/EBP、STATs等)參與p21基因的轉錄調控[7-8]。體外試驗發(fā)現，lncRNA SYISL可以通過與p21及肌肉特異性基因啟動子結合，沉默肌細胞生成素(myogenin，MyoG)和肌球蛋白重鏈4(myosin heavy chain 4，MYH4)的表達，促進成肌細胞增殖并抑制其分化[9]。p21基因發(fā)揮作用還受到p53和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的調控[10]。目前，關于p21基因與各轉錄調控因子的相互作用還不明確。p21基因在肌肉發(fā)育中的調控作用得到越來越多的關注，肌肉發(fā)生過程受到一系列轉錄因子的調控，這些因子在肌細胞的生長、分化、細胞周期運轉及細胞凋亡中都起到重要作用[11]。p21在多個信號通路中發(fā)揮作用，參與成肌細胞、肌管和肌纖維等多個階段的分化停滯，與生肌過程相關，參與調控小鼠肌肉衛(wèi)星細胞由靜息狀態(tài)轉向細胞激活和增殖[12]，p21基因敲除(p21-/-)小鼠表現出肌肉分化延遲的癥狀，同時生肌決定因子(myogenic determinant，MyoD)和MyoG在肌肉中的表達量顯著降低[1]。

中國是肉鵝生產和消費大國，鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪、低膽固醇的健康食品，近年來的消費量日趨上漲。目前，針對鵝肉的發(fā)育調控機制已經做了大量研究工作，胚胎期是畜禽肌纖維形成的關鍵時期，挖掘影響胚胎期肌肉發(fā)育的關鍵候選基因，從而更有效調控鵝肌肉發(fā)育是可行的方案。本研究對鵝p21基因全長及啟動子區(qū)序列進行克隆與分析，篩選核心啟動子區(qū)并初步明確核心轉錄調控因子，為進一步分析p21基因在鵝胚胎期肌肉發(fā)育中的作用、闡明鵝肌肉發(fā)育的遺傳機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 泰州鵝種蛋來自泰州金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，孵化第28天采集鵝胚腿肌組織樣，一部分置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?另一部分用于提取組織DNA。

1.1.2 主要試劑 SMARTer?RACE 5′/3′ Kit購自Clontech公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TksGflex DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自TaKaRa公司；限制性內切酶NheⅠ及XhoⅠ均購自NEB公司；動物組織DNA提取試劑盒和無內毒素質粒小量提取試劑盒均購自鼎國生物公司；熒光素酶報告質粒pGL3-Enhancer、pRL-TK、pGL3-Basic及Dual-luciferase Assay System試劑盒均購自Promega公司；DNA Marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mut Express?Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2定點突變試劑盒購自Vazyme公司；胎牛血清、PBS、胰蛋白酶及Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；Trizol Reagent和Lipofectamine LTX均購自Invitrogen公司；小鼠成肌細胞(C2C12)由農業(yè)農村部種養(yǎng)結合重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用Trizol法提取鵝胚腿肌總RNA，取1 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸分析儀測定總RNA的純度和濃度，選用D260 nm/D280 nm值為1.8～2.0的RNA為模板，按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉錄合成cDNA，按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit說明書反轉錄合成RACE所需cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鵝p21基因中間片段擴增 根據鴨(Anasplatyrhynchos)p21基因序列(GenBank登錄號:NW_004677468)信息查詢CDS區(qū)序列(453 bp，編碼151個氨基酸)，使用Oligo 7.0軟件設計巢式引物擴增p21基因中間片段，其中pF1和pR1為第一輪PCR引物，pF2和pR2為第二輪PCR引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 p21基因全長序列引物

第一輪PCR擴增體系50 μL：TksGflex DNA Polymerase 1 μL，2×Gflx PCR Buffer 25 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 22 μL。第一輪PCR擴增條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；9 ℃保存。以鑒定正確的第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增，反應條件與第一輪PCR一致，對第二輪PCR產物進行電泳檢測，回收純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 鵝p21基因3′-RACE 利用pF3和UPM Primer為上、下游引物進行Outer PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：cDNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，pF3(20 μmol/L)1 μL，UPM(10×) Primer 5 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將反應產物稀釋50倍作為模板，利用pF4和UPS Primer作為上、下游引物進行Inner PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：Outer PCR 反應液 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件同Outer PCR一致。2次PCR擴增3′-UTR序列，產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產物純化回收后使用引物pF4進行測序，測得3′-端出現套峰，進行TA克隆測序。將純化回收產物加A處理后，使用DNA Ligation連接到pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布平板過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 鵝p21基因5′-RACE 利用pR5和UPM Primer為上、下游引物進行Outer PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：cDNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，pR5(10 μmol/L)1 μL，UPM(10×) Primer 5 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將反應產物稀釋100倍作為模板，利用pR6和UPS Primer作為上、下游引物進行Inner PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：Outer PCR 反應液 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件同Outer PCR一致。2次PCR擴增5′-UTR序列，產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產物純化回收后使用引物pR6進行TA克隆測序。

1.2.5 鵝p21基因5′-側翼區(qū)片段PCR擴增 以泰州鵝胚腿肌cDNA為模板，結合已經獲得的鵝p21基因序列和鴨(Anasplatyrhynchos)p21基因(GenBank登錄號：NW_004677468)側翼區(qū)序列信息，設計引物p21F/R擴增p21基因5′-側翼區(qū)序列獲得P1片段，并進行生物信息學分析，針對轉錄因子結合位點存在區(qū)域設計5條上游引物(P1F、P2F、P3F、P4F、P5F)以及共同的下游引物PR，遞減擴增啟動子區(qū)片段，對所有上游引物引入NheⅠ限制性酶切位點及保護堿基，下游引物引入了XhoⅠ酶切位點及對應的保護堿基，引物序列見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 p21基因啟動子序列引物

PCR擴增體系50 μL：Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL，2×Gflx PCR Buffer 25 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產物回收純化后連接到pMD19-T載體上，重組質粒經NheⅠ和XhoⅠ酶切鑒定正確后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6 生物信息學分析 對所獲片段進行克隆、測序和拼接，得到鵝p21基因全序列，采用NCBI的ORF Finder程序分析開放基因閱讀框(ORF)及所編碼的氨基酸序列；利用ClustalX軟件與鴨(登錄號：XP_038024143)、原雞(登錄號：NP_989727)、火雞(登錄號：XP_010722537)、家豬(登錄號：XP_013833312)、犬(XP_038539267)、馬(登錄號：XP_023480611)、獼猴(登錄號：NP_001181651)、黑猩猩(登錄號：XP_003950875)、人(登錄號：NP_000380)、小鼠(登錄號：NP_031695)、大鼠(登錄號：NP_542960)、倉鼠(登錄號：XP_035312869)和斑馬魚(登錄號：NP_001121892)p21基因氨基酸序列進行相似性比對；采用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

使用Primer Premier 6.0軟件中的motif模塊對鵝p21基因5′-側翼區(qū)序列進行TATA-box、CAAT-box和GC-box元件分析；采用GPMiner在線軟件(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測p21基因5′-端轉錄起始位點(TSS)；使用TFSEARCH在線軟件(http:∥mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)預測p21基因啟動子區(qū)內潛在轉錄因子結合位點。

1.2.7 鵝p21基因啟動子報告基因載體構建及鑒定 利用表2所列引物進行PCR擴增鵝p21基因遞減長度的啟動子片段，對擴增片段進行NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳回收、T4 DNA連接酶連接后，定向克隆到同樣雙酶切的pGL3-Enhancer載體中，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆菌落進一步測序鑒定。 利用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序驗證，篩選構建正確的鵝p21基因pGL3-P1(-1 114～+96 bp)、pGL3-P2(-723～+96 bp)、pGL3-P3(-444～+96 bp)、pGL3-P4(-292～+96 bp)、pGL3-P5(-35～+96 bp)和pGL3-P6(+37～+96 bp)重組雙熒光素酶報告基因質粒。將啟動子報告載體及對照質粒pGL3-Basic分別轉染至C2C12細胞，檢測啟動子活性。

1.2.8 鵝p21基因突變位點報告基因載體的構建 結合啟動子活性檢測結果，對啟動子核心區(qū)轉錄因子結合位點進行預測。 利用點突變技術對轉錄因子結合位點進行敲除，設計并合成引物MutF/R，引物序列見表2。 點突變試驗以pGL3-P5(-35～+96)質粒為模板，突變引物PCR擴增整個質粒，回收擴增片段，加入DpnⅠ酶，去除模板質粒后再次回收，回收產物加T4 DNA Ligase連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布平板過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行PCR鑒定，對鑒定正確的菌液測序后挑選序列正確的質粒進行克隆，構建突變位點報告基因載體pGL3-MyoD-p21。

1.2.9 細胞培養(yǎng)、轉染和雙熒光素酶活性檢測 C2C12細胞復蘇后，均勻等量接種于24孔板中，當細胞生長至匯合度達70%～80%時，將構建的重組雙熒光素酶報告載體轉染到細胞內作為試驗組，轉染pGL3-Basic為陰性對照組，pRL-TK為內參質粒。質粒瞬時轉染后連續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞裂解，檢測雙報告基因熒光素酶活性。

1.2.10 數據分析 運用GraphPad Prism軟件進行單因素方差分析，使用SPSS 17.0軟件對數據進行Duncan’s多重比較，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 鵝p21基因的擴增

鵝胚腿肌總RNA樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，可滿足試驗要求。鵝p21基因cDNA全長擴增結果見圖1。由圖1可知，分別得到中間片段(313 bp)、5′-RACE(438 bp)和3′-RACE(1 618 bp)產物，序列長度與預期片段大小相符。利用DNAMAN軟件對所有片段的測序結果進行拼接，最終獲得鵝p21基因全長序列1 943 bp，其中CDS區(qū)為453 bp，5′-UTR為125 bp，3′-UTR為1 365 bp。

M，DL2000 DNA Marker；1，部分CDS區(qū)PCR產物(313 bp)；2，3′-RACE Outer PCR產物；3，3′-RACE Outer PCR產物稀釋10倍；4，3′-RACE Inner PCR產物(1 618 bp)；5，5′-RACE Outer PCR產物；6，5′-RACE Inner PCR產物(438 bp)

2.2 鵝p21基因5′-側翼區(qū)PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，鵝p21基因5′-側翼區(qū)擴增片段P21長1 210 bp(圖2A)，系列缺失啟動子片段P1、P2、P3、P4、P5和P6分別長1 242、851、572、420、163和92 bp(圖2B)，均符合預期長度。利用DNAMAN將p21基因5′-側翼區(qū)測序結果與鵝p21基因全長cDNA序列進行拼接，獲得鵝p21基因編碼啟動子ATG前約1 100 bp的側翼區(qū)序列。

M，DL2000 DNA Marker；1～7，p21(1 210 bp)、P1(1 242 bp)、P2(851 bp)、P3(572 bp)、P4(420 bp)、P5(163 bp)和P6(92 bp)引物片段

2.3 生物信息學分析

2.3.1 鵝p21基因序列分析 ORF Finder程序分析顯示，鵝p21基因全長序列存有符合Kozak規(guī)則的完整開放閱讀框，編碼區(qū)位于126-578 bp，長453 bp，編碼151個氨基酸。利用NCBI Conserved Domains在線工具進行結構域分析發(fā)現，p21基因編碼蛋白具有CDI(cyclin-dependent kinase inhibitor)家族的保守結構域，位于21-66位氨基酸處。不同物種p21蛋白的氨基酸序列相似性比對發(fā)現，鵝p21基因與鴨的相似性達到93.4%，與雞和火雞的相似性均為75.5%，與其他物種相似性均較低(圖3)，說明p21作用機制在禽類中相對保守。

圖3 不同物種p21蛋白的氨基酸序列比對

2.3.2 系統(tǒng)進化樹構建 根據不同物種的p21蛋白氨基酸序列，利用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，鵝與鴨的親緣關系最近，且與同綱的雞、火雞成簇，豬、人等哺乳動物成簇，斑馬魚單獨成簇，最后3個物種相聚成簇(圖4)。

圖4 p21氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3.3 鵝p21基因5′-側翼區(qū)序列分析 對鵝p21基因5′-側翼區(qū)序列進行啟動子元件分析，結果顯示，5′-側翼區(qū)序列存在1個CAAT box和1個GC box，無TATA box，BDGP在線預測鵝p21基因轉錄起始位點(TSS)位于-11 bp處。利用TFSEARCH預測轉錄因子結合位點，結果顯示，鵝p21基因啟動子區(qū)存在多個潛在轉錄因子結合位點，包括C/EBP、Sp1和MyoD等(圖5)。表明鵝p21基因上游1.1 kb序列是啟動子區(qū)，具有調控基因轉錄活性的潛在功能。

圖5 鵝p21基因啟動子區(qū)轉錄因子結合位點預測

2.4 雙熒光素酶報告載體構建及活性分析

雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，不同長度啟動子在C2C12細胞均具有活性，6個啟動子片段的活性依次呈現先增高后降低的趨勢，以pGL3-P4(-292～+96 bp)的熒光素酶相對活性最高，當缺失p21基因啟動子區(qū)-35/+37 bp序列后，雙熒光素酶報告載體pGL3-P6(+37～+96 bp)較pGL3-P4(-292～+96 bp)、pGL3-P5(-35～+96 bp)活性極顯著降低(P<0.01)，分別下降了88.89%和83.58%(圖6)。推測-35～+96 bp是鵝p21基因核心啟動子區(qū)，在-35～+37 bp啟動子區(qū)域存在核心順式調控元件。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.5 突變載體構建及核心調控元件驗證

以pGL3-P5(-35～+96 bp)為模板，對核心啟動子區(qū)潛在轉錄因子結合位點MyoD(+25～+36 bp)進行點突變擴增，擴增產物加T4 DNA Ligase連接、克隆，挑取單克隆提取質粒進行測序驗證，結果表明，試驗成功構建轉錄因子結合位點突變載體pGL3-MyoD-p21(圖7A)。將構建好的突變位點報告基因載體pGL3-MyoD-p21和對照載體pGL3-P5(-35～+96 bp)分別轉染至C2C12細胞，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，突變位點報告基因在C2C12細胞中有活性，突變位點報告基因的熒光素酶相對活性極顯著低于pGL3-P5(-35～+96 bp)(P<0.01)(圖7B)。推測MyoD是調控鵝p21基因啟動子活性的核心順式調控元件。

方框內表示轉錄因子結合位點突變比對

3 討 論

家禽肌肉的形成起始于胚胎期，由肌祖細胞定向增殖、分化成成肌細胞，成肌細胞進一步分化、融合形成肌管，最終形成肌纖維[13]。肌纖維的數量在出雛前已經固定，后期肌肉量的增加主要依靠肌纖維的肥大[14]。肌肉含量是家禽關鍵經濟性狀之一，因此挖掘影響禽胚胎期肌纖維發(fā)育的關鍵基因具有重要的經濟價值。

3.1 鵝p21基因序列克隆及分析

肌肉發(fā)育過程需要許多調控因子的參與，研究表明，細胞周期調控基因在鴨胚孵化中期表達下調，減緩胸肌細胞的增殖，為孵化后期肌細胞融合和分化提供必要條件[15]。對雞胚研究發(fā)現，p21基因mRNA在孵化期的表達模式與成肌細胞增殖、分化規(guī)律一致[16-17]，推測細胞周期調控基因(如p21基因)在調控禽胚胎期肌肉發(fā)育中具有重要作用。本研究獲得了鵝p21基因全長序列和部分5′-側翼區(qū)序列，生物信息學分析表明，鵝p21基因編碼蛋白含有高度保守的CDI家族結合位點。系統(tǒng)進化樹分析表明，p21蛋白在不同物種間具有較高的保守性，與禽類相似性較高，與鴨進化關系最近，推測其在功能上也存在一定的相似性。

鵝p21基因啟動子區(qū)包含CAAT box和GC box等典型的真核生物轉錄調控元件，但缺失TATA box。TATA box是基因轉錄起始調控開關，主要功能是保證轉錄的正確定位[18]。研究發(fā)現，人分泌成分(secretory component，SC)基因啟動子區(qū)缺少TATA box，但位于編碼區(qū)(+8～+21 bp)的IRF-E元件補償了TATA box缺失效應，通過構建起始前復合物可激活基因轉錄[19]。這與生肌調節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族調控機制相似，MyoD通常以二聚體形式與E-box元件結合[20]，進而激活基因轉錄，推測MyoD(+25～+36 bp)元件可能同樣具有補償TATA box缺失效應的作用，還需要進一步試驗驗證。

3.2 鵝p21基因啟動子活性及調控元件分析

本研究構建了6個不同長度啟動子片段的報告基因載體，雙熒光素酶檢測結果顯示，-35～+96 bp區(qū)域是鵝p21基因核心啟動子區(qū)，在-35～+37 bp啟動子區(qū)域存在核心順式調控元件。MatInspector分析發(fā)現，-35～+37 bp區(qū)域內存在MyoD(+25～+36 bp)結合位點，利用點突變技術對該位點進行敲除，構建雙熒光素酶重組載體，轉染至C2C12細胞，對突變位點報告基因載體進行活性檢測，結果顯示，MyoD轉錄因子突變載體pGL3-MyoD-p21的活性極顯著下降，推測MyoD是鵝p21基因的核心轉錄調控因子。轉錄調控元件一般位于啟動子區(qū)，但一些重要的調控元件也存在于編碼區(qū)內，小鼠多個組蛋白基因的轉錄調控元件位于編碼區(qū)[21]，人Pax5基因關鍵轉錄調控元件位于第1外顯子[22]，本研究結果表明，鵝p21基因轉錄調控也存在同樣相似的機制。

MyoD是MRFs家族一員，是成肌分化的決定因子[23]。在動物胚胎期，MyoD可以誘導肌祖細胞向生肌細胞系轉變[24]，體外試驗也發(fā)現，MyoD可以將其他類型的細胞轉變?yōu)榧〖毎鸞25]。胚胎期肌細胞的分化需要肌肉特異性基因的表達和細胞周期終止共同調節(jié)[20]，研究表明，MyoD和p21基因在此過程中發(fā)揮重要作用，一方面，MyoD誘導前成肌細胞分化發(fā)育形成肌纖維；另一方面，通過誘導p21基因表達上升，進而實現細胞周期終止在G0階段[26]。

肌肉特異性基因啟動子區(qū)大都存在E-box元件，MRFs的二聚體可與之結合，以調節(jié)下游基因的轉錄[27-28]。本研究結果發(fā)現，p21基因啟動子區(qū)含有E-box元件，且位于MyoD轉錄因子結合位點內，核心序列為CAGGTG，MyoD可直接調控p21基因轉錄活性，這是首次在分子水平揭示MyoD對p21基因的轉錄調控作用。下一步可以通過染色質免疫共沉淀(EMSA)和凝膠阻滯分析試驗等方法驗證MyoD調控鵝p21基因轉錄活性的功能，并進一步研究其作用機制。

4 結 論

本試驗成功克隆泰州鵝p21基因全長及啟動子序列，鵝p21基因與鴨進化關系最近。啟動子活性檢測發(fā)現，-35～+96 bp區(qū)域是核心啟動子區(qū)，-35～+37 bp區(qū)域存在核心順式調控元件。對核心區(qū)轉錄因子進行定點突變，構建轉錄因子突變表達載體后測定活性，表明MyoD是啟動子核心順式調控因子。