大腸桿菌噬菌體BP16對雞大腸桿菌病的防治效果

李 敏，趙尊福，陽亭亭，張煥容

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

禽致病性大腸桿菌是腸道外致病性大腸桿菌的一個亞群，可引起雞的大腸桿菌病，導(dǎo)致局部或全身性的感染[1]，被感染后的家禽出現(xiàn)敗血癥、心包炎、腹膜炎、輸卵管炎等多種不同的臨床癥狀和病理變化，感染后痊愈的家禽大多消瘦[2-3]，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥譜變寬、耐藥性增強(qiáng)等一系列問題，使細(xì)菌性疾病治療變得困難，養(yǎng)殖成本增加[4]。噬菌體在環(huán)境中廣泛存在，具有宿主特異性，可以靶向感染宿主菌，從而裂解相應(yīng)的致病菌，且不會影響其他正常菌群[5-8]。目前噬菌體已成功用于人類和動物細(xì)菌性疾病的靶向治療[9]。由于抗生素耐藥性越來越嚴(yán)重，噬菌體可部分替代抗生素，用于治療細(xì)菌性疾病[10]。噬菌體治療與抗生素一樣，也存在藥代動力學(xué)，故噬菌體的滴度及其在體內(nèi)作用的有效治療時間是有限的[11-13]，因此，探究噬菌體的最佳治療劑量非常必要。本研究為評價一株寬裂解譜大腸桿菌噬菌體BP16防治雞大腸桿菌病的效果，在雛雞攻毒前后不同時間腹腔注射大腸桿菌噬菌體BP16，并探究該噬菌體的最佳治療劑量，以期為后續(xù)研究雞大腸桿菌噬菌體制劑提供思路。

1 材料與方法

1.1 噬菌體、細(xì)菌及試驗動物

噬菌體BP16和O2血清型禽致病性大腸桿菌均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室分離鑒定并保存[14]。 1日齡羅曼灰公雛雞購自成都某蛋雞孵化場。

1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母提取物購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；NaCl購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；SM緩沖液購自上海信帆生物科技有限公司。電熱恒溫水浴鍋購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海和呈儀器制造有限公司；超凈工作臺購自浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)購自賽默飛世爾科技有限公司；0.22 μm無菌一次性針頭式濾器購自北京索萊寶科技有限公司；恒溫?fù)u床購自上海世平實驗設(shè)備有限公司。

1.3 大腸桿菌半數(shù)致死量(LD50)測定

將O2血清型禽致病性大腸桿菌新鮮培養(yǎng)物菌液稀釋成5×1010、5×109、5×108、5×107和5×106CFU/mL 5個濃度梯度；30只7日齡雛雞隨機(jī)分為6組，每組5只，5個試驗組采用腹腔注射的方式分別接種0.2 mL上述不同濃度的菌液，對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水；飼養(yǎng)觀察7 d并記錄各組死亡數(shù)量，采用Reed-Muench法測定LD50，剖檢病死雞觀察病理變化。

1.4 大腸桿菌藥敏試驗

為篩選用于防治試驗作為陽性對照的藥物，選取13種常用的對革蘭陰性菌有抑菌或殺菌作用的藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗。根據(jù)美國臨床檢驗委員會(NCCLS)推薦的藥敏試驗結(jié)果判定細(xì)菌對藥物的敏感程度[15]。

1.5 噬菌體BP16裂解液無菌檢驗

取20 μL經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌的噬菌體裂解液，滴加到LB固體培養(yǎng)基上，用滅菌后的涂布棒涂抹均勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察有無雜菌生長。

1.6 噬菌體BP16懸液安全性檢驗

選取20只健康的7日齡雛雞隨機(jī)分為2組，每組10只，第1組腹腔注射0.2 mL 3×109PFU/mL的噬菌體懸液，第2組腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為對照組，飼喂14 d觀察各組雞是否表現(xiàn)出臨床癥狀。

1.7 噬菌體BP16防治禽大腸桿菌病的效果評價試驗

將80只健康的7日齡雛雞隨機(jī)分為8組，每組10只，1～5組為試驗組，6～8組為對照組，除第8組外，其余各組均腹腔注射1.5×108CFU的菌液。5個試驗組分別在感染前6 h、感染前3 h、感染同時、感染后3 h、感染后6 h腹腔注射1.5×108PFU的噬菌體懸液；第6組為氟苯尼考治療組，給藥方案按說明書推薦劑量及次數(shù)進(jìn)行給藥(即將氟苯尼考注射液以純水稀釋10倍，按照0.7 mL/kg BW的劑量注射,并每隔48 h注射一次，連續(xù)給藥2次)；第7組腹腔注射1.5×108CFU菌液作為感染對照；第8組腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為空白對照，各組在同等條件下飼養(yǎng)觀察7 d，除氟苯尼考治療組外，治療療程均為給藥一次，并記錄各組雞死亡率。

1.8 最佳治療劑量試驗

選取60只健康的7日齡雛雞，隨機(jī)分為6組，每組10只，1～5組為試驗組，第6組為對照組。將全部雛雞腹腔接種1.5×108CFU的菌液，攻毒后第1～5組立即分別腹腔接種1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109和1.5×1010PFU的噬菌體裂解液，對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水，自由采食，飼養(yǎng)7 d，觀察并記錄雛雞的死亡率。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌LD50測定結(jié)果

采用Reed-Muench法，根據(jù)表1中數(shù)據(jù)算出O2血清型大腸桿菌LD50為1.5×108CFU/mL，剖檢死亡雞可見心臟和肝臟表面有纖維素性滲出，腺胃漿膜面和腸道黏膜面有出血點。

表1 大腸桿菌LD50測定結(jié)果

2.2 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果可知，該O2血清型大腸桿菌菌株對氨芐西林、阿莫西林、鏈霉素和四環(huán)素均耐藥，對沙星類藥物和氟苯尼考敏感(表2)，由于臨床常用氟苯尼考治療禽大腸桿菌病，所以選取氟苯尼考作為后續(xù)試驗陽性對照的藥物。

表2 藥敏試驗結(jié)果

續(xù)表

2.3 噬菌體裂解液無菌檢驗結(jié)果

BP16噬菌體裂解液涂布在LB固體培養(yǎng)基上經(jīng)24 h培養(yǎng)后，未發(fā)現(xiàn)任何菌落生長，說明裂解液中無雜菌，符合下一步試驗要求。

2.4 噬菌體裂解液安全性試驗結(jié)果

注射BP16噬菌體懸液的試驗組雞均正常飲水采食，未出現(xiàn)精神不振、腹瀉拉稀、被毛凌亂等臨床癥狀，剖檢后各組織器官未發(fā)現(xiàn)病理變化，說明噬菌體懸液安全。

2.5 噬菌體防治大腸桿菌病的效果

由表3可知，在雛雞感染大腸桿菌前6 h和前3 h接種噬菌體懸液，保護(hù)率均達(dá)到100%，與攻毒組相比，死亡率降低60%，在雛雞感染大腸桿菌同時、感染后3 h和感染后6 h接種噬菌體懸液，保護(hù)率分別為80%、80%和70%。抗生素治療組的保護(hù)率為70%，除第5組與抗生素治療組的保護(hù)率相同之外，其余試驗組的保護(hù)率均高于抗生素治療組。結(jié)果表明，雛雞在感染大腸桿菌前6 h接種噬菌體能有效預(yù)防大腸桿菌病，在感染同時至感染后6 h內(nèi)接種噬菌體，能有效治療大腸桿菌病，且治療效果優(yōu)于該病原菌敏感的抗生素。

表3 噬菌體防治大腸桿菌病試驗結(jié)果

2.6 最佳治療劑量試驗結(jié)果

由表4可知，隨著噬菌體治療劑量的增加，雛雞的保護(hù)率也顯著提高，噬菌體治療劑量為1.5×109PFU時，雛雞的保護(hù)率能達(dá)到100%。所以，攻毒劑量為1.5×108CFU時，噬菌體治療劑量為1.5×109PFU才能達(dá)到最佳的治療效果。

表4 最佳治療劑量試驗結(jié)果

3 討 論

Lau等[16]報道宿主在被大腸桿菌入侵后，會在被感染的部位釋放出炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致血管通透性增加，此時會有纖維素性滲出，說明大腸桿菌已隨血液感染至全身，傳播到其他器官。本研究通過腹腔接種途徑測定O2血清型禽致病性大腸桿菌的LD50，剖檢病死雞可見肝臟、心臟表面有纖維素性滲出，成功建立了大腸桿菌雛雞腹腔感染模型。禽致病性大腸桿菌是腸道外致病性大腸桿菌中的一種，因此，本研究通過腹腔接種人工感染禽致病性大腸桿菌，而非常用的經(jīng)口感染途徑。已有研究證實，噬菌體不同接種途徑對大腸桿菌病的防治效果有差異[17]，噬菌體注射與氣溶膠吸入相比，注射途徑動物體內(nèi)的噬菌體水平更高且更持久[18]，路建彪等[19]研究證明腹腔注射噬菌體的效果優(yōu)于口服的方式，本研究結(jié)果表明，通過腹腔注射接種禽大腸桿菌噬菌體可在一定程度上防治大腸桿菌病。

本研究在雛雞感染大腸桿菌前6 h和前3 h接種噬菌體，保護(hù)率均達(dá)到100%，說明腹腔注射大腸桿菌噬菌體對禽大腸桿菌病有預(yù)防的作用。由于注射了噬菌體裂解液，攻毒的菌液和噬菌體裂解液在腹腔相互作用，阻止了致病菌在體內(nèi)的擴(kuò)散，可有效預(yù)防和治療經(jīng)腹腔人工感染的大腸桿菌。噬菌體無毒副作用[20-21]，但只在致病菌感染部位復(fù)制增殖發(fā)揮作用，而抗生素會隨血液遍布全身，不局限在感染部位。本研究中噬菌體治療效果優(yōu)于抗生素治療，與杜新永等[22]和張博等[23]研究結(jié)果一致，但根據(jù)噬菌體的生長繁殖特性分析，噬菌體治療局部感染的效果可能要優(yōu)于治療全身感染。Payne等[24]在探究噬菌體的藥代動力學(xué)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌的密度足夠高時，感染細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)量超過噬菌體的數(shù)量，噬菌體才會達(dá)到有效的劑量。本研究中當(dāng)噬菌體治療劑量增加時，對雛雞的保護(hù)率也顯著提高，所以高劑量噬菌體有助于提高治療效果。

孫浩宇[25]以5×109CFU/mL的沙門菌攻毒1日齡雛雞，雛雞飲水中添加噬菌體飼喂8 d后，在肝臟、脾臟中均未檢出攻毒菌株，之后對50 000只新進(jìn)雛雞使用噬菌體飲水預(yù)防沙門菌病，后期花費的藥品成本極低，且最終出欄率達(dá)95%以上，這一實踐證明噬菌體防治在養(yǎng)殖業(yè)可得到廣泛應(yīng)用。在本試驗中，當(dāng)攻毒劑量為1.5×108CFU時，噬菌體治療劑量為1.5×109PFU達(dá)到最佳的治療效果。根據(jù)前期試驗結(jié)果[14]，噬菌體BP16最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，理論上噬菌體治療劑量為1.5×108PFU就可取得最佳的治療效果，而實際應(yīng)用中1.5×109PFU治療效果最佳，表明在實際生產(chǎn)中進(jìn)行體內(nèi)治療時，可根據(jù)體外測定的最佳感染復(fù)數(shù)，適當(dāng)提高其用量。

4 結(jié) 論

以禽致病性大腸桿菌為宿主菌分離鑒定的寬裂解譜噬菌體BP16可有效治療由O2血清型大腸桿菌感染引起的雛雞大腸桿菌病，本研究為開發(fā)大腸桿菌噬菌體防治制劑提供了參考。