金銀花、連翹及其藥對對馬鏈球菌馬亞種耐藥基因和毒力基因的影響

買占海，盧亞賓，李建龍,趙 璐，孫丹嵐，佟盼盼，況 玲

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.昌吉州動物疾病預防控制中心，昌吉 831100)

馬鏈球菌(Streptococcusequi，S.equi)屬于β溶血鏈球菌，包括獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus，SEZ)、馬亞種(Streptococcusequisubsp.equi，SEE)和類馬亞種(Streptococcusequisubsp.ruminatorum，SER)3個不同的亞種[1]。馬腺疫屬于三類動物疫病，通常由SEE感染引起，是馬屬動物的急性接觸性傳染病[2]。帶菌馬已被認為是維持病原體長期存在和暴發(fā)感染的重要因素[3]，其發(fā)病率可達100%，死亡率達10%[4]。病原菌隨病馬咳嗽、膿腫破潰及噴嚏排出體外，經(jīng)扁桃體、受損皮膚、上呼吸道黏膜或消化道感染健康馬匹，患病幼年馬也能將細菌傳染給母馬，可通過吮吸乳汁引發(fā)母馬乳房炎或者敗血癥[5-6]。馬鏈球菌的致病性與耐藥性在國內(nèi)研究較少，常見的毒力基因為fneB[7]，臨床常用青霉素、四環(huán)素和磺胺類藥物等進行治療[8]，同時，耐藥鏈球菌的出現(xiàn)也導致馬場遭受很大經(jīng)濟損失，臨床用藥亟需新的思路。

金銀花(LoniceraejaponicaeThunb.)作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥，具有散熱、清火和解毒的功效[9]，可用于治療喉痹、丹毒、熱毒血痢、溫病發(fā)熱、癰腫疔瘡和風熱感冒等[10]，含有有機酸類、揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類和三萜皂苷類等多種成分[11-14]。王清等[15]研究報道，金銀花對金黃色葡萄菌、溶血性鏈球菌、肺炎桿菌、腦膜炎雙球菌等多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抑菌作用。 連翹(ForsythiasuspensaThunb.Vahl)具散熱解毒、消腫散結的功能，可用于治療發(fā)熱、炎癥、淋病、膿腫和丹毒，是廣譜抗菌藥，對多種革蘭氏陽性菌有抑制作用。連翹屬植物中的咖啡酰糖苷類成分也有很強的抗菌活性，其水煮液在體外有抑菌作用，可抑制鏈球菌、大腸桿菌、葡萄球菌、痢疾桿菌和霍亂弧菌等，且未見耐藥性形成[16-18]。在治療馬腺疫的大多數(shù)清熱解毒方中均有金銀花和連翹，如五味消毒飲、托里透膿散等，孔憲琴等[19]將五味消毒飲用于豬鏈球菌病的治療，結果表明該方對鏈球菌有一定抑制作用。前期研究已經(jīng)確定了所保存24株SSE菌的耐藥基因和毒力基因[20]。根據(jù)中藥金銀花、連翹相須為用的特點，本試驗通過金銀花、連翹及其藥對與SEE菌株共培養(yǎng)，探究其對SEE菌株耐藥基因和毒力基因的影響，并接種至小鼠體內(nèi)，觀察金銀花、連翹及其藥對與SEE菌共培養(yǎng)能否有效地抑制SEE的耐藥基因和毒力基因，為今后臨床治療馬腺疫新藥的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶fneB毒力基因的3株馬鏈球菌馬亞種菌株L1菌株(fneB基因)、D1菌株(lytA+fneB+ply基因)和Y1菌株(qnrA+blaTEM+fneB基因)均由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院中獸醫(yī)實驗室分離鑒定并保存。192只SPF級健康昆明系小鼠，體重(20±3)g購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：SYXK(新)2018-0003)。

1.2 主要試劑及儀器

金銀花、連翹均購自新疆烏魯木齊市同濟堂大藥房；DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O均購自天根生化科技(北京)有限公司；快速革蘭氏染液購自新疆鼎楓生物科技有限公司；THB培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)醫(yī)海博生物技術有限公司。

自動高壓滅菌器(MODEL：HVE-50)、離心機(Eppendorf AG 22331 Hamburg)、TPro fessional PCR儀(Biometra)、DYY-6 C型電泳儀均購自北京市六一儀器廠；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)、恒溫水浴鍋(DZKW-D-2)均購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；雙人雙面垂直潔凈工作臺(SW-CJ-2F)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 中藥制備 分別將10 g金銀花、連翹原藥研磨粉碎后，置500 mL圓底燒杯中。參考陳士林等[21]方法進行煎煮。金銀花加12倍蒸餾水、連翹加入7倍蒸餾水，浸泡30 min后放置電熱套上煎煮，220 ℃武火煮沸后調(diào)至120 ℃文火冷凝回流煎煮15 min；煎煮結束后放置離心機中4 000 r/min離心5 min去除藥渣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮即得到1 g/mL水提取物；金銀花-連翹1∶1(各5 g)混合制成金銀花-連翹藥對組，將3份中藥105 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，無菌分裝備用。

1.3.2 SEE與中藥共培養(yǎng)濃度的測定 在無菌狀態(tài)下，吸取100 μL甘油保存的SEE菌株L1、D1和Y1菌株原液，加入100 mL THB培養(yǎng)液中，在恒溫振蕩器中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，在THB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取單個菌落于THB培養(yǎng)液中，在恒溫震蕩器中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，測定其D600 nm值為0.6時備用。吸取經(jīng)高壓滅菌后的金銀花、連翹、金銀花-連翹1∶1的3組中藥提取物按表1中的比例分別與3種SEE菌液混合，共分9組(L1+金銀花、L1+連翹、L1+金銀花-連翹1∶1、D1+金銀花、D1+連翹、D1+金銀花-連翹1∶1、Y1+金銀花、Y1+連翹和Y1+金銀花-連翹1∶1)在恒溫振蕩器中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 h后，觀察細菌菌落形態(tài)。待SEE與中藥共培養(yǎng)后能夠被檢出為準。配比濃度梯度見表1。

表1 中藥配比濃度梯度

1.3.3 SEE菌株形態(tài)檢查 挑取與中藥混合培養(yǎng)的3株SEE菌株的單菌落進行革蘭氏染色，在油鏡(1 000×)下觀察其形態(tài)特征并拍照。

1.3.4 菌株耐藥基因及毒力基因的PCR檢測 本試驗進行檢測的耐藥基因及毒力基因引物均參照文獻[20]進行，耐藥基因包括耐β-內(nèi)酰胺類(blaTEM基因)和耐喹諾酮類(qnrA基因)2種；毒力基因包括ply和fneB2種，具體信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反應體系20 μL：2×TaqPCR Green Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至20 μL[22]。PCR擴增程序：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 引物信息

1.3.5 小鼠體內(nèi)抑菌試驗 試驗設為空白對照組、中藥陽性對照組(金銀花水提取物、連翹水提取物和金銀花-連翹1∶1配伍水提取物)、陰性對照組(SEE菌株Y1、L1、D1組)、試驗組(Y1、L1、D1菌株分別與金銀花、連翹和金銀花-連翹1∶1共培養(yǎng)組：即Y1+金銀花、Y1+連翹、Y1+金銀花-連翹1∶1、L1+金銀花、L1+連翹、L1+金銀花-連翹1∶1、D1+金銀花、D1+連翹、D1+金銀花-連翹1∶1)。每組12只，雄雌各半。相同飼養(yǎng)條件下，斷食不斷水24 h后，各組小鼠分別腹腔注射對應藥物或菌液，空白對照組小鼠注射滅菌生理鹽水，各組劑量均為0.5 mL/只。接種后每隔4 h觀察1次小鼠狀態(tài)，連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計各組小鼠存活率發(fā)現(xiàn)死亡小鼠后及時解剖，觀察肝臟有無病理變化，并在無菌狀態(tài)下采取肝臟組織，用于檢測不同組fneB毒力基因。

1.3.6 小鼠體內(nèi)SEE菌株的分離及fneB毒力基因檢測 試驗結束后處死剩余小鼠，無菌采集肝臟組織涂抹于THB培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于THB培養(yǎng)液中進行增菌培養(yǎng)，并通過PCR和1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠體內(nèi)分離菌，檢測其fneB毒力基因的變化，方法同1.3.4。

2 結 果

2.1 藥菌濃度配比結果

金銀花、連翹、金銀花-連翹1∶1與SEE菌株混合培養(yǎng)12 h后，接種于THB瓊脂培養(yǎng)基中檢測細菌存活情況。通過觀察共培養(yǎng)細菌存活量發(fā)現(xiàn)，以細菌D600 nm值達到0.6時的培養(yǎng)條件為最適培養(yǎng)條件，最終確定適配濃度比例為：中藥∶THB培養(yǎng)基∶待測菌液=1000∶500∶20。

2.2 SEE形態(tài)學觀察結果

與金銀花、連翹、金連1∶1共培養(yǎng)的3株SEE菌株在THB固體培養(yǎng)基中均能夠正常生長且形態(tài)顏色未出現(xiàn)明顯變化(圖1A)。 革蘭氏染色顯示Y1+金銀花-連翹1∶1呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，直徑為0.6～1.0 μm，菌體似矛頭狀排列單個或多個排列成鏈狀，無芽孢，無菌毛，與正常SEE相比無明顯變化(圖1B)。

A，與中藥共培養(yǎng)的Y1鏈球菌落形態(tài)；B，Y1鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結果(1 000×)

2.3 耐藥基因及毒力基因檢測結果

2.3.1 耐藥基因qnrA和blaTEM檢測結果 Y1菌株與金銀花、連翹、金銀花-連翹1∶1共培養(yǎng)后，PCR未檢測到qnrA和blaTEM耐藥基因目的條帶(圖2)。

①A，qnrA基因；B，blaTEM基因。②M，DL2000 DNA Marker；1、15，D1菌株；2、3、10、11，Y1+金銀花；4、5、12、13，Y1+連翹；6、14，Y1+金銀花-連翹1∶1；7～9，Y1菌

2.3.2 毒力基因fneB和ply檢測結果 3株SEE菌與連翹共培養(yǎng)后，PCR均未檢測到fneB毒力基因(圖3A)。 D1菌株與金銀花、連翹、金銀花-連翹1∶1 共培養(yǎng)后，PCR未檢測出ply毒力基因(圖3B)。

M，DL2000 DNA Marker；1，L1+連翹；2、8，D1+連翹；3、6，D1菌株；4、10，陰性對照；5，Y1+連翹；7，D1+金銀花；9，D1+金銀花-連翹1∶1

2.4 小鼠致病性試驗結果

空白對照組和中藥陽性對照組小鼠的存活率均為100%，陰性對照組(SEE菌株原液)Y1、D1和L1的小鼠存活率分別為16.7%(2/12)、8.3%(1/12)和0(0/12)，注射Y1+金銀花、Y1+連翹、Y1+金銀花-連翹1∶1的小鼠存活率分別為50.0%(6/12)、58.3%(7/12)、41.7%(5/12)；注射D1+金銀花、D1+連翹、D1+金銀花-連翹1∶1的小鼠存活率分別為58.3%(7/12)、66.7%(8/12)、16.7%(2/12)；注射L1+金銀花、L1+連翹、L1+金銀花-連翹1∶1的小鼠存活率分別為75.0%(9/12)、83.0%(10/12)、50.0%(6/12)(表3)。

表3 不同中藥與3株SEE菌共培養(yǎng)接種小鼠死亡率

2.5 小鼠肝臟病理變化

解剖死亡的小鼠,將其肝臟與金銀花組、連翹組、金銀花-連翹1∶1組及空白對照組小鼠的肝臟進行對比，可以明顯看出死亡小鼠肝臟出現(xiàn)腫大淤血、邊緣鈍圓，呈深紅色，其余組小鼠肝臟均無明顯變化。

2.6 小鼠fneB毒力基因檢測結果

檢測3株與金銀花、連翹、金銀花-連翹1∶1共培養(yǎng)SEE菌株注射小鼠后其fneB毒力基因表達情況，結果有8株攜帶fneB基因，分別為Y1+金銀花、Y1+連翹、Y1+金銀花-連翹1∶1、L1+金銀花、L1+金銀花-連翹1∶1、D1+金銀花、D1+連翹、D1+金銀花-連翹組，而L1+連翹組未檢出fneB基因(圖4)。

M，DL2000 DNA Marker；1，Y1+金銀花；2，Y1+連翹；3，Y1+金銀花-連翹1∶1；4，L1+金銀花；5，L1+金銀花-連翹1∶1；6，D1+金銀花；7，D1+連翹；8，D1+金銀花-連翹；9，L1+連翹

3 討 論

中草藥抗菌已經(jīng)逐漸被人們熟知，金銀花、連翹、黃連、黃芪、板藍根、蒲公英、苦參等均具有抗菌作用[23]。本試驗選取廣泛應用于各類方劑中具有清熱解毒、消腫散結的中藥金銀花和連翹，且金銀花、連翹作為相須為用的藥對具有較強的抑菌效果，故作為本試驗的研究對象。而SEE菌株作為引起馬腺疫的強毒株，在本試驗中選取3株攜帶fneB毒力基因的SEE菌株作為試驗菌株，主要探究其與金銀花、連翹共培養(yǎng)后對小鼠的致病性與SEE原菌株對小鼠致病性的差異，并初步探究金銀花和連翹水提取物的抑菌作用在基因?qū)用嫔蠈EE菌株的影響。

在進行耐藥基因和毒力基因的檢測中，中藥共培養(yǎng)待測菌株中耐藥基因qnrA、blaTEM和毒力基因fneB和ply毒力基因均未被檢出，表明金銀花、連翹可在基因?qū)用嬗绊懠毦哪退幮院椭虏⌒?。陶飛[24]研究表明，雙花連翹提取物、黃芩苷、硫酸黃連素和天蠶素提取物與肺炎克雷伯菌、糞腸球菌和腸道沙門氏菌共培養(yǎng)，能夠抑制細菌的生長，且在一定的時間內(nèi)共培養(yǎng)對肺炎克雷伯菌的acc(3)-Ⅱ耐藥基因、糞腸球菌的erm(B)耐藥基因以及腸道沙門氏菌的SUL1耐藥基因有影響，這與本試驗結果一致。陳儉清等[25]認為，豬鏈球菌耐藥性與生物被膜的形成有關，而連翹等中藥對其生物被膜的形成有抑制作用，本試驗探究的耐藥基因可能與控制菌體生物被膜的形成有關，結果與陳儉清等研究結果一致。本試驗在現(xiàn)有的條件下，實現(xiàn)了體外中藥與細菌共培養(yǎng)，初步在基因?qū)用嫣骄苛酥兴幍囊志饔脤毦虏×Φ挠绊憽?/p>

通過不同中藥與3株SEE菌株共培養(yǎng)并接種小鼠，試驗結果表明3株菌均有一定的致病性。與連翹水提取物共培養(yǎng)的SEE菌株注射的小鼠成活率比原菌株陰性組高，表明連翹與SEE菌株共培養(yǎng)后其毒性明顯降低，從而提高了小鼠的存活率；與金銀花水提取物共培養(yǎng)的SEE注射的小鼠成活率均高于注射原SEE菌株小鼠，表明3株SEE菌株的毒性明顯下降，但比連翹SEE菌株共培養(yǎng)組成活率要略低；金銀花-連翹1∶1藥對與原SEE菌株共培養(yǎng)菌注射的小鼠成活率略高于原SEE菌株組。體內(nèi)抑菌結果表明，連翹水提取物的抑菌效果最好，明顯降低細菌毒性，金銀花水提取物次之，而金銀花-連翹藥對1∶1水提取物效果較差但也具有一定作用，接種原菌液的小鼠(陰性對照組)的存活率明顯低于接種與中藥水提取物共培養(yǎng)菌液的小鼠的存活率。說明中草藥金銀花、連翹與SEE菌共培養(yǎng)能夠有效減弱SEE菌的毒性，同時表明SEE菌也存在致病性，該結果與王嵩[25]報道結果一致，揭示了中藥抑菌作用的復雜性。魏振裝[26]表明中藥能夠有效增強或調(diào)整細胞免疫和體液免疫，在體外對耐藥菌有較強的抑菌作用，而且在體內(nèi)通過提高機體的免疫力，具有抗病原微生物或直接或間接地滅活細菌內(nèi)毒素，或能加速毒素的代謝等作用。

本研究對小鼠進行無菌解剖，從肝臟的病理變化可以明顯看到除了接種原SEE菌株的小鼠肝臟腫大淤血、邊緣鈍圓以外其余各組均正常。肝臟的損傷程度證明了與金銀花、連翹水提取物共培養(yǎng)后的SEE菌株的毒力明顯降低，而連翹水提取物組與正常小鼠肝臟幾乎無差別，說明連翹水提取物組對SEE菌株抑制效果最好。在王雨朦等[7]進行的相同研究中，小鼠肝臟僅發(fā)生非特異性炎癥反應，病理切片中未出現(xiàn)典型病變，而本試驗中小鼠肝臟病理變化與之相同。

小鼠體內(nèi)分離菌株的耐藥及毒力基因檢測結果顯示，與金銀花、連翹及金銀花-連翹藥對水提取物共培養(yǎng)的待檢菌株(共9株)中除去L1+連翹組感染鼠之外，其余8組均檢出fneB毒力基因。小鼠體內(nèi)分離菌株fneB毒力基因的檢測結果表明，在小鼠體內(nèi)分離的SEE菌株能夠重新獲得fneB毒力基因，出現(xiàn)菌種反毒復壯的現(xiàn)象，其機制有待進一步研究。小鼠致病性試驗結果顯示，雖然從小鼠體內(nèi)分離的SEE菌株的fneB毒力基因得以表達，但接種與連翹水提取物共培養(yǎng)SEE菌株的小鼠仍然有很高的存活率，表明中藥水提取物抑制細菌致病性不僅是通過抑制其毒力基因表達的方式進行，比如抑制其蛋白表達，從而阻止其進行生物膜合成，還有可能是通過抑制其他毒力基因的表達來提高小鼠的存活率[28-29]。

4 結 論

本試驗研究結果表明，金銀花、連翹及其藥對不會影響SEE菌株的形態(tài)，但能夠減弱SEE菌株的fneB、ply毒力基因和qnrA、blaTEM耐藥基因的表達，連翹水提物的抑菌效果要優(yōu)于金銀花水提物。SEE菌株在小鼠體內(nèi)具有重新恢復攜帶fneB毒力基因的能力。