外泌體對動物腸道健康的影響及其研究方法

魏文焯，梁振華，吳 艷，劉靜波，皮勁松，張 昊

(1.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010)

外泌體是由細胞內多囊泡體分泌的富含生物活性物質的細胞外囊泡，其主要形成機制為分泌細胞質膜內陷形成早期核內體，早期核內體經體內分選復合物調控形成多囊泡體，多囊泡體與細胞膜融合形成外泌體[1-2]。外泌體中的生物活性物質主要包括核酸(mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)、蛋白質以及脂質等物質[3]，且外泌體不含線粒體、內質網等細胞器結構[4]。外泌體主要在細胞通訊、疾病診斷及機體免疫應答等方面發(fā)揮作用，已成為生命科學領域的研究熱點[5-6]。目前，外泌體的相關研究主要集中在模式動物和人類疾病方面，而與動物腸道健康相關的外泌體研究較少。為此，作者梳理了腸細胞源、非腸細胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響以及外泌體的研究方法，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 腸細胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸道細胞包括上皮細胞、潘氏細胞、巨噬細胞與淋巴細胞等，它們直接暴露于微生物、外來抗原與消化道內容物中，使維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)成為一個復雜且具有挑戰(zhàn)性的過程。腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，就會引發(fā)腸道炎癥等疾病，從而對機體造成損傷。腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡依賴于細胞外因子、細胞外囊泡和腸道屏障防御之間的共同作用[7]。細胞外囊泡主要包括外泌體、微粒、凋亡小體和癌小體，它們不僅負責細胞間的通訊工作，同時也是細胞與機體之間的通訊器[8]。因此，腸道菌群與腸道細胞之間的細胞外囊泡通過相互溝通，共同維護腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對機體健康至關重要[9]。

1.1 腸上皮細胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

小腸上皮細胞是腸道的重要組成部分，在腸道免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，盡管它們不是專業(yè)的抗原呈遞細胞，但它們具有主要組織相容性復合體(histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ[10]。有研究表明，小腸上皮細胞可分泌外泌體，且外泌體與親代細胞含有相同的免疫調節(jié)分子與MHCⅠ和MHCⅡ。小腸上皮細胞分泌的外泌體通常從細胞的頂部或基底外側釋放，可攜帶A33抗原，A33抗原被認為是小腸上皮細胞外泌體的標志物[10]。外泌體可與樹突狀細胞相互作用，通過免疫調節(jié)信號刺激具有耐受性的樹突狀細胞、調節(jié)T細胞和巨噬細胞成熟。Ayyar等[11]研究表明，小腸上皮細胞外泌體通過分泌膜聯(lián)蛋白A1、整合素、細胞因子和趨化因子幫助維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，誘導耐受性免疫反應，還可分泌髓過氧化物酶來保護腸道免疫屏障免受細菌入侵，髓過氧化物酶會產生抗細菌的氧化應激。綜上所述，腸上皮細胞源外泌體可攜帶生物活性物質或與樹突狀細胞相互作用等方式維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

1.2 腸道免疫細胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸道是機體的消化器官，也是機體重要的免疫器官，處于機體免疫防御的最前線。腸道內有多種免疫細胞，其中包括樹突狀細胞、腸道T細胞與先天淋巴樣細胞等[12]。據報道，腸道內多種免疫細胞均可分泌外泌體，在維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[13]。樹突狀細胞是腸道免疫系統(tǒng)的專職抗原呈遞細胞，可在感知抗原時啟動免疫反應，根據親本樹突狀細胞的階段和成熟，樹突狀細胞衍生的外泌體可能具有免疫刺激/抑制作用[14]。中性粒細胞源外泌體含有miR-23a、miR-155和髓過氧化物酶，被腸上皮細胞吸收后可誘導雙鏈斷裂并減緩結腸上皮的傷口愈合[15]。此外，Ayyar等[11]研究發(fā)現，腸道免疫細胞源的外泌體通過誘導免疫耐受和觸發(fā)調節(jié)性T細胞激活而抑制T輔助細胞來促進抗炎反應，經外泌體處理的免疫細胞可進一步分泌外泌體，從而促進抗炎反應。綜上所述，腸道免疫細胞源外泌體可通過分泌miRNA、髓過氧化物酶或激活調節(jié)性T細胞等途徑減緩腸道炎癥反應。

2 非腸源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸源外泌體主要通過細胞間的旁分泌，在腸細胞內部發(fā)揮作用。而非腸源外泌體主要通過外源添加等方式影響腸道細胞間通訊與相關基因表達。

2.1 外泌體與腸道菌群

腸道內微生物菌群構成機體腸道的微生物屏障。正常情況下，腸道微生態(tài)處于平衡狀態(tài)，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而腸道微生物穩(wěn)態(tài)打破會造成各種疾病發(fā)生，影響機體健康。外泌體是一種內源性的調節(jié)物質，可影響腸道菌群的組成與生長。Zhou等[14]研究表明，對C57BL/6型小鼠分別飼喂牛乳外泌體缺乏飼糧(exosome-and RNA-depleted，ERD)與牛乳外泌體充足飼糧(exosome-and RNA-sufficient，ERS)后，發(fā)現牛乳外泌體改變了小鼠盲腸中的微生物群落，喂食ERD與ERS的小鼠盲腸中，微生物菌群中3個門、7個科和52個操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)出現顯著差異。其中，15和47周齡飼喂ERS的小鼠腸道中軟壁菌門的豐度是飼喂ERD小鼠的3倍，7和47周齡飼喂ERS的小鼠腸道中毛螺菌科的4個OTUs豐度高于飼喂ERD小鼠的2倍。Teng等[16]研究發(fā)現，植物來源的外泌體納米顆?？梢员槐荒c道微生物群吸收，并含有改變微生物組成和宿主本身的RNA。此外，Yu等[17]用牛乳外泌體與大腸桿菌、乳酸菌混合培養(yǎng)，發(fā)現大腸桿菌與乳酸菌的生產速率得到了顯著提高。上述研究表明，外源外泌體可參與腸道菌群與機體間的相互作用，并改變機體腸道菌群的組成與豐度。

2.2 外泌體與腸道干細胞的增殖凋亡

外界環(huán)境的刺激可使動物發(fā)生應激反應，導致腸道上皮細胞發(fā)生凋亡，但腸上皮細胞凋亡失衡會導致腸道通透性和屏障功能障礙增加，導致多種急慢性腸道疾病[18]。因此，促進腸上皮細胞的增殖分化，對維持腸道屏障功能的完整性具有重要作用。外泌體中含有多種生物活性物質，可使腸道干細胞的增殖分化能力顯著提高。研究表明，腸肌成纖維細胞來源的外泌體中的miR-125a/b可通過靶向骨髓細胞白血病1基因(myeloid cell leukemia-1，MCL1)的3′-UTR區(qū)域，調節(jié)大鼠腸上皮細胞的增殖[19]。在缺氧條件下，牦牛乳源外泌體顯著促進小腸上皮細胞中氧敏感脯氨酸羥化酶-1(prolyl hydroxylase，PHD1)的表達，降低缺氧誘導因子-α及其下游靶血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，并降低p53蛋白的含量，從而促進缺氧狀態(tài)下小腸上皮細胞的增殖[20]。Zhou等[21]研究發(fā)現，人乳源外泌體可促進腸道發(fā)育，其機制可能為外泌體中的circRNA競爭性結合miRNA，調控VEGF信號通路，從而促進腸上皮細胞的增殖與遷移。趙偉[22]在研究腸神經系統(tǒng)發(fā)育異常時發(fā)現，大鼠腸神經嵴干細胞源的外泌體可抑制大鼠腸神經嵴干細胞的增殖，并誘導其凋亡，機制可能為外泌體中circCDR1as的表達下調，從而抑制大鼠腸神經嵴干細胞增殖與遷移，提示外泌體circRNA在維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色。Xie等[23]通過構建小鼠腸道損傷模型，在體內體外均證明豬乳源外泌體可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠腸道上皮細胞凋亡，提高腸道緊密連接蛋白的表達，降低TLR4/NF-κB信號通路激活，緩解小鼠的腸道損傷。Chen等[24]研究表明，豬乳源外泌體可顯著促進尾型同源盒轉錄因子2(CDX2)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，抑制參與腸道增殖的p53基因表達，并顯著提高小鼠腸道組織的絨毛高度、隱窩深度和絨毛長度與隱窩深度的比值。此外，Melnik等[25]研究發(fā)現，外泌體中miR-21可調控mTOR1通路，促進腸道干細胞的增殖。綜上所述，外泌體中豐富的生物活性物質可以調控機體中相關基因與蛋白質的表達，抑制腸道上皮細胞的凋亡，促進腸道干細胞的增殖，保護腸道屏障功能的完整性。

2.3 外泌體與腸道炎癥

炎癥是生物組織受到某種刺激如外傷、感染等損傷因子的刺激所發(fā)生的一種以防御反應為主的基本病理過程，涉及到多種類型的免疫和非免疫細胞的參與[26]?，F階段研究表明，外泌體對腸道炎癥具有顯著的抑制作用。Deng等[27]利用M2巨噬細胞源的外泌體，成功驗證了外泌體中miR-590-3p可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β和白細胞介素-6的誘導，并通過靶向大腫瘤抑制激酶1(large tumor suppressor kinase 1，LATS1)激活YAP/β-catenin調節(jié)的轉錄來減少小鼠炎癥信號并促進小鼠腸上皮細胞再生。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種特發(fā)性慢性疾病，其特點為腸道黏膜反應異常、腸道上皮細胞紊亂與腸道微生物環(huán)境破壞等[28]。Liu等[29]研究發(fā)現，人骨髓間充質基質細胞源的外泌體(mesenchymal stromal cells exosomes，MSC-Exos)可顯著減輕各種IBD模型的結腸炎，保持腸道屏障的完整性。其機制可能為MSC-Exos作用于結腸巨噬細胞，而MSC-Exos處理的小鼠與未處理的小鼠相比，來自結腸的巨噬細胞對炎癥再刺激具有明顯的抵抗力。Wang等[30]利用小鼠構建了葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導的IBD模型，發(fā)現人臍帶間充質干細胞衍生的外泌體(hucMSC-exosomes，hucMSC-Ex)可通過抑制miR-326的類泛素化修飾在小鼠IBD模型中緩解DSS誘導的IBD。此外，Miyake等[31]利用小鼠構建了壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)模型，在體內與體外均驗證了人乳源外泌體可減輕LPS誘導的NEC。在體外，驗證了人乳源外泌體可減輕缺氧與LPS處理所誘發(fā)的腸道炎癥；在體內，發(fā)現人乳源外泌體可顯著改善NEC誘導的腸道黏膜損傷、腸道炎癥反應與腸道黏液的產生。綜上所述，外泌體可通過調控體內基因、蛋白質與炎癥因子的表達，從而抑制相關炎癥信號通路，達到緩解動物腸道炎癥的目的，其中某些miRNA在外泌體緩解腸道炎癥的過程中扮演重要角色，未來可能成為治療動物腸道炎癥的切入點。

3 外泌體的研究方法

3.1 外泌體的分離方法

隨著外泌體相關研究的深入，其生物學功能的潛在應用價值被不斷挖掘。外泌體的分離過程對外泌體的研究至關重要，然而外泌體的異質性卻加大了分離外泌體的難度。此外，目前大多數的分離技術都無法將具有相似生物物理特性的脂蛋白和非內體途徑的細胞外囊泡完全分離出外泌體，導致外泌體純度低。因此,如何高效分離純化外泌體，是外泌體相關研究的關鍵。目前常用的分離方法共有5種，分別為超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色譜法與磁珠免疫法。

3.1.1 超速離心法 超速離心法是目前應用最廣泛的分離技術之一，超速離心法主要是根據原始溶液中各組分的大小和密度差異提取所需組分，適用于沉降系數差異較大的大劑量樣品組分的分離[32]。超速離心法主要分為3步：①低速離心去除死亡細胞與組織碎片：以300×g離心10 min，取上清；②中速離心去除大尺寸的細胞外囊泡：以2 000×g離心10 min，取上清；③高速離心分離外泌體：10 000×g離心30 min，取上清，100 000×g，在4 ℃下持續(xù)離心90 min，去掉上清，留下的沉淀PBS重懸后，再次以100 000×g離心90 min。超速離心法所提取的外泌體數量多，但耗時長，回收率不穩(wěn)定，且純度較低。因此，超速離心法多與密度梯度離心法聯(lián)合使用。Gu等[33]研究外泌體對造血功能的影響時利用超速離心法成功從細胞懸液中分離出外泌體。

3.1.2 密度梯度離心法 密度梯度離心法通常與超速離心法聯(lián)用，以提高外泌體的純度。在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13～1.19 g/mL的密度范圍富集[34]。 密度梯度離心法所提取的外泌體純度高，但蔗糖溶液的高黏度會降低外泌體的沉降速度，導致沉降時間延長。Liu等[35]利用密度梯度離心法與超速離心法結合，成功提取小鼠脂肪源外泌體。

3.1.3 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法通常以聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為介質，通過降低外泌體的溶解度，在離心條件下分離外泌體。聚合物沉淀法早期應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關[13]。聚合物沉淀法操作簡單，分析時間短，適用于大劑量樣品的處理，但純度和回收率較低，可能產生假陽性，產生的聚合物難以去除，不利于后續(xù)功能實驗分析。Tassetto等[36]利用聚合物沉淀法與超速離心法結合，成功提取果蠅血細胞外泌體，并利用納米顆粒示蹤分析與電子顯微鏡法對外泌體進行鑒定。

3.1.4 尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜(size-exclusion chromatography，SEC)是基于大小而非分子質量實現分離大分子。該技術應用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根據其直徑通過微球，半徑小的分子需要更長的時間才能通過色譜柱的孔隙遷移，而大分子則從色譜柱中更早地洗脫[37]。SEC的提取速度快、操作簡單、成本低廉。所分離出的外泌體結構完整，大小均勻，其生物學特性不會受到明顯的不利影響，但可能會摻雜其他類似大小的顆粒，導致純度降低。Tóth等[38]利用尺寸排阻色譜法成功從血漿中分離出外泌體。

3.1.5 磁珠免疫法 磁珠免疫法是利用外泌體表面的特異性標記物(如CD9、CD63、CD81蛋白)，用配體磁珠與之孵育結合，即可將外泌體吸附并分離出來[39]。磁珠法具有特異性強、純度高、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點，但磁珠免疫法不適合從大量樣品中提取外泌體，磁珠與抗體較為昂貴，保存條件苛刻，難以廣泛普及。

3.2 外泌體的鑒定方法

3.2.1 電子顯微鏡法 電子顯微鏡法是利用掃描電鏡或透射電鏡，觀察不同大小的外泌體的形態(tài)和結構[40]。掃描電鏡是用能量為1～30 kV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌的高分辨率信息。透射電鏡是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射，形成明暗不同的影像。電鏡法可直接觀察外泌體的形態(tài)與結構，用于鑒別不同類型、不同大小的外泌體，但樣品的處理與制備較為復雜。Chen等[41]研究種利用電子顯微鏡法對所分離的外泌體進行結構分析，觀察發(fā)現分離的外泌體均為盤狀和杯狀結構的橢圓形小泡，直徑為30～150 nm。

3.2.2 納米顆粒示蹤分析 納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)是一種快速發(fā)展的熱門光學粒子跟蹤技術，用于實時監(jiān)測粒子的粒徑分布和濃度[42]。其方法為將收集的外泌體樣品用PBS稀釋后，用注射器注入納米顆粒示蹤分析儀，激光照射外泌體中的粒子，通過粒子散射光并進行布朗運動，可以記錄每個粒子的運動軌跡，并可以確定粒子的擴散率和平均速度，利用相應的計算公式即可算出樣品的濃度與流體力學直徑[4]。該方法樣品制備簡單，檢測速度快且準確，但所測外泌體直徑大小的下限為70 nm。研究表明，腸源外泌體直徑主要集中在60～150 nm范圍內[43]，可結合蛋白質印跡法或電鏡法檢測直徑較小的腸源外泌體。Chen等[41]利用NTA鑒定滑膜組織外泌體時發(fā)現，外泌體主峰值均在100～120 nm，且濃度均>1×1010/mL。

3.2.3 Western blotting法 外泌體表面有許多特異性蛋白，利用相應的蛋白抗體與之結合，進行SDS-PAGE分離、轉膜，進行顯影檢測外泌體特異蛋白的表達量[44]。Western blotting法特異性高，操作技術成熟，在鑒定不同細胞來源的外泌體時，需要不同的蛋白抗體，腸源外泌體表面抗原與標志物主要有A33抗原、膜聯(lián)蛋白A1與CD63等[11]。Chen等[41]通過Western blotting方法檢測外泌體生物標志物蛋白CD9、CD63和Flotillin-1時發(fā)現，3種外泌體標志蛋白均在檢測樣品中高度表達。

3.2.4 流式細胞術 利用外泌體表面特異性標志物相應的抗體進行標記，通過流式細胞儀檢測其陽性表達，也可對外泌體進行驗證[45]。如染色后的外泌體溶液加入分支聚乙烯亞胺，37 ℃孵育15 min，之后超速離心去除分支聚乙烯亞胺，然后加入金納米顆粒，輕柔重懸后置于培養(yǎng)箱中60 min，加入別藻藍蛋白DNA染料，室溫孵育15 min后用流式細胞儀檢測，APC陽性的顆粒即為所需檢測的外泌體。此法檢測速度快，可分析外泌體的大小與體積，所需樣品濃度低，但不能分辨較小的外泌體。Teresa等[46]利用流式細胞術鑒定間充質基質細胞源外泌體時發(fā)現，樣品表面標志性蛋白CD90、CD34與CD63等均有表達。

3.3 外泌體研究的生物信息學工具

3.3.1 EVmiRNA數據庫 EVmiRNA數據庫(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA)是一個專用于細胞外囊泡的miRNA數據庫，里面包括miRNA表達譜、miRNA相關藥物、miRNA調控途徑、miRNA功能以及相關出版物。收錄了17種器官或疾病中的462個細胞外囊泡miRNA測序樣本及miRNA表達圖譜。EVmiRNA提供了3個功能模塊：①不同來源(如血液、母乳等)的miRNA表達譜和樣本信息；②在不同細胞外囊泡中特異表達的miRNA，有助于生物標志物的識別；③miRNA注釋，包括miRNA在EV中的表達，miRNA途徑的調控，以及miRNA的功能和出版物[47]。Zhang等[48]利用EVmiRNA數據庫對比B細胞源外泌體與K562白血病的外泌體中差異表達的miRNA，結果表明B細胞源外泌體中差異表達的miRNA數量為287個，K562白血病的外泌體中差異表達的miRNA為176個。

3.3.2 exoRBase數據庫 exoRBase數據庫(http:∥www.exorbase.org/exoRBaseV2/toIndex)是從人血液外泌體的RNA-seq數據分析得出的circRNA、lncRNA和mRNA的存儲庫。exoRBase數據庫旨在收集和表征人血外泌體中的所有長RNA種類來提供注釋，其中包括表達水平和可能的原始組織，識別血液外泌體中的分子標記，并將觸發(fā)新的循環(huán)生物標志物發(fā)現以及對人類疾病的功能預測[49]。

3.3.3 ExoCarta數據庫 ExoCarta數據庫(http:∥www.exocarta.org/)是外泌體標志物綜合數據庫，針對外泌體中鑒定出的蛋白質和RNA分子，收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊、豚鼠、果蠅、馬、穴兔、牛在內的幾個物種共286個研究結果。除此之外，ExoCarta數據庫的一個典型特點就是具有外泌體蛋白動態(tài)的蛋白與蛋白之間相互關系網以及生物學通路[50]。Haraszti等[51]的研究中利用ExoCarta數據庫預測并成功驗證外泌體標志物CD81與CD9。

3.3.4 Vesiclepedia數據庫 Vesiclepedia數據庫(http:∥www.microvesicles.org/)是一個EVs分子(脂質、核酸和蛋白質)的數據庫，目前包含來自于文獻中發(fā)表的341個獨立研究的35 264個蛋白，18 718個mRNAs，1 772個miRNAs、342個脂質條目，數據庫中的細胞外囊泡包括凋亡小泡、外泌體、微粒體與微囊泡等，還可以根據物種、囊泡、分子和樣品類型瀏覽和檢索[52]。

3.3.5 exRNA Atlas數據庫 exRNA Atlas數據庫(https:∥exrna-atlas.org/exat)是細胞外RNA通訊聯(lián)盟所開發(fā)的數據庫，該信息庫包括人類和小鼠生物流體的小分子RNA測序和實時熒光定量PCR衍生的exRNA圖譜。其中包括了腦脊液、唾液、血清、血漿和尿液來源的5 309例exRNA-seq以及實時熒光定量PCR數據，同時網站還提供了適用于exRNA研究的分析工具[53]。

4 展 望

近年來，由于外泌體具有來源廣泛、含有多種生物活性物質及可跨物種使用等優(yōu)點而成為生命科學領域的研究熱點。但當前外泌體相關研究也存在一些問題：①目前外泌體相關研究主要集中在人疾病方面，有關外泌體對動物腸道健康的研究較少；②目前研究外泌體所使用的主要是模式動物，而以畜禽作為動物模型的研究較少；③目前外泌體的分離方法基本無法獲得單一的外泌體，所分離的樣品中包含有其他細胞外囊泡，因此需要改進現有的分離方法，以便對外泌體進行獨立研究。

外泌體可在細胞通訊、機體免疫應答及細胞分化等過程中發(fā)揮作用，調節(jié)機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。鑒于外泌體的重要作用，進一步探索外泌體攜帶功能成分在腸屏障功能維持、腸黏膜損傷修復、腸道疾病中的作用及相關調控機制，可為畜禽腸道健康研究提供新思路，也為畜禽腸源性問題的有效解決提供新方案。