桃金娘果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

銀慧慧，童艷梅，曾雪顏，盧光強，趙 武，姜源明，劉 偉

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005；3.廣西隆安縣動物疫病預防控制中心，南寧 532799)

目前，抗生素的不規(guī)范使用以及抗生素殘留和耐藥性問題日趨嚴重，一些抗生素能夠通過動物性食品轉移到人體中，對人類的健康造成了嚴重威脅[1-2]。研究顯示，從天然植物中分離的多糖具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)和抗糖尿病活性等，與抗生素作用性質相同，并且具有無污染、無殘留、無致癌、無致突變和無致畸作用等優(yōu)點，能夠作為一種綠色新型的免疫增強劑，成為近代畜牧養(yǎng)殖道路上新的方向[3-5]。

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.)為桃金娘科桃金娘屬常綠多花小灌木，是一種野生兼?zhèn)涫乘幑δ艿闹参镔Y源，果實中富含黃酮、多酚、多糖等多種活性成分[6-8]，中國南方地區(qū)民間常以其入藥，用于急、慢性腸胃炎、痢疾以及提高人體免疫等，也有農民在日常飼料中添加桃金娘作為輔食提高家畜和家禽的免疫力。隨著對多糖的不斷深入研究，桃金娘多糖得到了越來越多的重視[9-10]，而桃金娘多糖提高機體免疫作用機制的相關研究鮮有報道。本研究利用免疫抑制小鼠模型對桃金娘果多糖的免疫調節(jié)作用進行評價，為桃金娘的保健及藥用資源開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桃金娘果(產地：廣西玉林，經廣西獸醫(yī)研究所獸藥新技術研究開發(fā)中心鑒定為桃金娘果實)；桃金娘果多糖，由廣西壯族自治區(qū)獸藥新技術開發(fā)中心實驗室提供，為桃金娘的干果打粉經過水浴、醇沉(濃度為80%)、濃縮、過濾、干燥后獲得，多糖的含量為65.8%。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(CTX)購自上海源葉生物科技有限公司；小鼠白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)、過氧化物酶(POD)試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶(LZM)試劑盒購自上海聯(lián)酶生物科技有限公司；生理鹽水購自江西御醫(yī)堂實業(yè)有限公司；其余試劑均為國產分析純。

TECAN Infinite M200酶標儀購自瑞士帝肯公司；分析天平購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋購自江蘇金怡儀器科技有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗動物和飼料

SPF級昆明小鼠96只，雌雄各半，體重為(20±2)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。試驗期間動物房溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，小鼠自由攝食及飲水，適應性飼養(yǎng)4 d后進行正式試驗。SPF飼料由長沙市天勤生物技術有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分組、造模及給藥 對昆明小鼠進行腹腔注射環(huán)磷酰胺80 μg/g BW，1次/d，連續(xù)3 d，建立小鼠免疫抑制模型[9]。將造模成功的模型小鼠隨機分為5組(每組16只)：模型組、黃芪多糖組、桃金娘果多糖低、中、高劑量組。 另設16只健康小鼠為正常組。 黃芪多糖組每只小鼠按200 μg/g BW劑量腹腔注射黃芪多糖混懸液，桃金娘果多糖低、中、高劑量組分別按50、100、200 μg/g BW劑量腹腔注射桃金娘果多糖混懸液，正常組和模型組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水(0.02 mL/g BW)，1次/d，連續(xù)7 d。

1.4.2 小鼠臟器指數(shù)測定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對所有小鼠進行稱重。眼球采血，分離血清，置于-20 ℃保存待用；頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟洗凈、吸干后稱量，并計算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/小鼠體重×100%。

1.4.3 小鼠血清細胞因子含量測定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對所有小鼠進行稱重。眼球采血，分離血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明檢測血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、LZM、POD的含量。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 桃金娘果多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表1可知，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯偏低，均極顯著或顯著低于正常組(P<0.01；P<0.05)，提示模型組小鼠建模成功。與模型組相比，黃芪多糖組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，但胸腺指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；桃金娘果多糖不同劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度提高，尤以桃金娘果中劑量組最高(P<0.01)。

表1 各組小鼠免疫器官指數(shù)(n=8)

2.2 桃金娘果多糖對免疫抑制小鼠血清細胞因子的影響

由表2可見，模型組小鼠血清中細胞因子IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量極顯著或顯著低于正常組(P<0.01；P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖組小鼠血清IL-6和IL-1β含量極顯著或顯著升高(P<0.01；P<0.05)；桃金娘果多糖不同劑量組血清IL-6、IL-1β含量相較于模型組均極顯著升高(P<0.01)；黃芪多糖組和桃金娘果多糖低、中劑量組的血清IFN-γ、IL-2含量相較于模型組都有所提升，但差異均不顯著(P>0.05)，桃金娘果多糖高劑量組的IFN-γ、IL-2含量極顯著高于模型組(P<0.01)。

表2 各組小鼠細胞因子水平(n=6)

2.3 桃金娘果多糖對免疫抑制小鼠血清LZM含量和POD活性的影響

由表3可知，模型組POD活性和LZM含量均顯著低于正常組(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖組POD活性顯著升高(P<0.05)，LZM含量有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的POD活性和LZM含量均極顯著或顯著高于模型組(P<0.01；P<0.05)。

表3 各組小鼠POD活性和LZM含量(n=6)

3 討 論

植物多糖具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗菌和抗癌活性等。與傳統(tǒng)藥物相比，生物活性植物多糖的副作用相對較少，因此受到越來越多的學者青睞[10-11]。從桃金娘果實中提取的桃金娘多糖，已被發(fā)現(xiàn)能夠提高免疫功能，具有抗病毒和抗腫瘤等功效[12]。環(huán)磷酰胺是一種常用的治療惡性腫瘤的代表性藥物和免疫抑制劑，高劑量會引起免疫抑制作用和腸道潰瘍[9]?；谔医鹉镌诿庖呦到y(tǒng)方面的積極作用，本研究通過建立環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型，分別從胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、細胞因子水平變化等方面探討了桃金娘果多糖的免疫功能作用。

胸腺和脾臟是機體的重要免疫器官，其重量的變化能夠間接反映機體免疫水平的變化[13-14]。本研究結果顯示，桃金娘果多糖不同劑量組均能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，說明桃金娘果多糖對免疫器官有一定的恢復和促進作用。

IL-1β是一種重要的促炎細胞因子，參與了機體中多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動[15]。有研究顯示，黃芪多糖對大黃魚頭腎巨噬細胞IL-1β具有調節(jié)作用[16]。本研究表明，桃金娘果多糖不同劑量組均能極顯著提高小鼠血清中IL-1β水平，發(fā)揮免疫調節(jié)作用。IL-2又稱為T細胞生長因子，在免疫系統(tǒng)的治療中起著核心作用[17]。 有報道指出人參莖葉多糖和海藻多糖分別對雞和豬的IL-2分泌有調節(jié)作用[18-19]。本研究中，桃金娘果多糖高劑量能夠極顯著增高IL-2水平，由此可見，桃金娘果多糖能通過調節(jié)IL-2水平從而發(fā)揮調節(jié)機體免疫功能的作用。IL-6能夠參與T細胞的早期激活，具有B細胞分化生物功能[20]。已有的研究表明，黨參多糖可調節(jié)豬血清中IL-6水平[21]。本研究中免疫抑制小鼠經過腹腔注射不同劑量的桃金娘果多糖后，血清IL-6含量極顯著增高，可能是隨著桃金娘果多糖含量的增加，刺激了Th2細胞分泌增強所致。 IFN-γ是免疫反應的主要調節(jié)劑，在抗感染的保護性免疫中發(fā)揮重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草多糖能明顯促進T淋巴細胞分泌IFN-γ[23]。本研究結果顯示，桃金娘果多糖能夠提高免疫抑制小鼠血清IFN-γ水平，說明桃金娘果多糖可調節(jié)免疫抑制小鼠的免疫功能，提高機體的體液免疫和細胞免疫。Th1細胞主要產生的細胞因子有IL-2、TNF-β和IFN-γ；而Th2細胞主要產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[24]。在正常情況下，機體中Th1/Th2細胞處于平衡狀態(tài)，而當機體發(fā)生功能異常時，Th1/Th2出現(xiàn)平衡偏移，通過調節(jié)Th1或Th2細胞在機體中的水平，能夠恢復機體正常功能。本試驗結果顯示，200 μg/g BW劑量的桃金娘果多糖能顯著提高小鼠的血清IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量，提示桃金娘果多糖可能從調節(jié)Th1/Th2的平衡方面對機體的免疫功能起到調節(jié)作用。

過氧化物酶POD是一類氧化還原酶，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[25]。溶菌酶LZM是一種糖苷水解酶，能夠催化破壞某些細菌細胞壁[26]。有研究顯示，山藥塊莖多糖和黃芪多糖分別對POD和LZM具有調節(jié)作用[27-28]。本研究結果顯示，不同劑量的桃金娘果多糖均能夠顯著提高POD活性和LZM含量，改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

4 結 論

在本試驗條件下，不同劑量的桃金娘果多糖對免疫抑制小鼠的胸腺、脾臟、以及血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、LZM含量和POD活性具有恢復和促進作用，其中桃金娘果多糖中劑量即100 μg/g BW對免疫抑制小鼠免疫功能恢復的效果最佳。這一結果為桃金娘果多糖作為免疫增強劑的深度開發(fā)和應用提供了一定的理論依據(jù)。