腸炎沙門菌sef 14基因缺失株生物學(xué)功能

顧宣強(qiáng),侯千禧,劉家奇,李雅倩,夏芃芃,段強(qiáng)德,朱國(guó)強(qiáng) （揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省重要?jiǎng)游飩魅静∨c人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009）

腸炎沙門菌表面具有多種菌毛,其中SEF14主要表達(dá)于腸炎沙門菌等D群沙門菌中[1]。SEF14菌毛的結(jié)構(gòu)纖細(xì),直徑小于3 nm,由大小為14.3 k Da的蛋白亞單位組成[2],沒(méi)有凝集紅細(xì)胞的能力[3]。

sef基因位于腸炎沙門菌染色體上一個(gè)較小的毒力島上。完整的sef基因操縱子包括sefA、sef B、sef C、sef D、sef R等5個(gè)基因。sef A編碼SEF14菌毛主要亞單位Sef A；sef B編碼伴侶蛋白,是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可以避免Sef A主要亞單位蛋白的非活性聚集及其組裝前的酶降解；sef C編碼推進(jìn)蛋白,推進(jìn)蛋白位于外膜中,負(fù)責(zé)組織和裝配菌毛亞單位并使其穿過(guò)外膜蛋白,以活性蛋白的形式表達(dá)于細(xì)菌的表面；sef D編碼SEF14菌毛的頂端結(jié)構(gòu),為一種假定黏附素；sef R基因是與sefD相連的反向調(diào)節(jié)基因,其編碼的AraC樣調(diào)節(jié)蛋白能夠激活sef操縱子基因的轉(zhuǎn)錄[4]。

SEF14的菌毛組裝分泌方式為典型的伴侶-推進(jìn)蛋白途徑[5],首先,Sef A蛋白和Sef D蛋白在沙門菌細(xì)胞質(zhì)中合成,在細(xì)胞質(zhì)中,輔助因子Sec A可以捕獲菌毛前蛋白或接收伴侶蛋白SecB轉(zhuǎn)運(yùn)的前蛋白；之后,前蛋白通過(guò)Sec YEG轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入周質(zhì),這也意味著SEF14蛋白的分泌還需要SecDF/YajC內(nèi)膜蛋白,這些蛋白需要Sec A催化ATP的水解來(lái)為轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。在細(xì)胞周質(zhì)中,伴侶蛋白SefB與菌毛亞單位Sef A互補(bǔ)結(jié)合,然后Sef B將Sef A與Sef D蛋白通過(guò)細(xì)菌外膜的孔道SefC運(yùn)送并組裝到細(xì)菌外膜上[6]。

沙門菌引起的各種動(dòng)物疾病稱為沙門菌病,其主要污染禽蛋肉產(chǎn)品而危害公共衛(wèi)生安全,其中腸炎沙門菌是引起沙門菌病和食物中毒的主要原因之一[7]。而腸炎沙門菌表面的SEF14菌毛對(duì)其生物學(xué)功能的影響不得而知。由此,我們選用腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株SE50336缺失sef14菌毛操縱子亞單位sef A基因,以探究腸炎沙門菌SEF14菌毛的生物學(xué)功能,以期對(duì)腸炎沙門菌的防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2為本實(shí)驗(yàn)室保存；腸炎沙門菌SE50336由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授惠贈(zèng)；p KD46、p KD3和p CP20均由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；p BR322質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡SPF BALB/c小鼠（雌、雄各半）購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物均購(gòu)自O(shè)xoid公司；氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、四環(huán)素（Tc）和Triton X-100均購(gòu)自上海生工公司；Green taq mix和質(zhì)粒小提試劑盒、2×AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix（Low ROX Premixed）試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊公司；DNA Marker Trans 2k購(gòu)自全式金生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根公司；DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購(gòu)自Ta Ka-Ra公司；其余常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3主要儀器超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)和移液器購(gòu)自Eppendorf公司；PCR儀、熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司；MicroPulser電轉(zhuǎn)化儀和DNA凝膠成像儀均購(gòu)自Bio-Rad公司；全波長(zhǎng)全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司；電熱干燥培養(yǎng)箱購(gòu)自南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和Nanodrop 2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4缺失株(SE50336Δsef A)的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建腸炎沙門菌SE50336Δsef A基因缺失株（SE50336Δsef A）。

1.4.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上發(fā)布的腸炎沙門菌SE50336的全基因測(cè)序中sef A的序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件oligo7分別設(shè)計(jì)sef A上、下游引物序列（表1）。其中,P1/P2為sef A基因鑒定引物,P3/P4為缺失引物,缺失引物中下劃線所示為氯霉素抗性基因cat兩側(cè)的互補(bǔ)序列。上述引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于構(gòu)建sef A基因缺失株的引物序列

1.4.2一次重組和p KD46質(zhì)粒的消除 采用煮沸法制備p KD3模板,以P3、P4為引物擴(kuò)增sef A和cat基因融合產(chǎn)物,產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]制備SE50336感受態(tài)細(xì)胞,將p KD46電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,獲得陽(yáng)性克隆后,制備陽(yáng)性克隆的感受態(tài)細(xì)胞,并轉(zhuǎn)化含cat基因同源臂的PCR產(chǎn)物。陽(yáng)性克隆接種于含Amp和Cm的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),取1 m L進(jìn)行保種,剩余菌液按照上述方法制備模板,以P1、P2為引物進(jìn)行一次重組菌株的PCR鑒定并送測(cè)序,結(jié)果正確后,將陽(yáng)性克隆在42℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代5次,篩選對(duì)Amp敏感而對(duì)Cm不敏感的陽(yáng)性菌株,將陽(yáng)性菌株命名為SE50336Δsef A::Cat。

1.4.3二次重組和pCP20質(zhì)粒的消除 與前述方法相同,制備感受態(tài)細(xì)胞,并將p CP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆后在42℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代5次；使用P1、P2進(jìn)行二次重組菌株的PCR鑒定。二次重組菌命名為SE50336Δsef A。

1.5生長(zhǎng)試驗(yàn)培養(yǎng)SE50336、SE50336Δsef A至D600＝1.0后,1∶100轉(zhuǎn)接至50 m L LB培養(yǎng)基中,37℃、230 r/min培養(yǎng)。之后每1 h取1次樣,連續(xù)記錄至D600值相對(duì)穩(wěn)定。重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.6生物被膜形成檢測(cè)

1.6.1生物被膜形成定性檢測(cè)試驗(yàn) 分別轉(zhuǎn)接SE50336、SE50336Δsef A至4 m L生物被膜誘導(dǎo)液[9]中30℃震蕩培養(yǎng)10 h后測(cè)D600處的吸光度,調(diào)節(jié)菌液至D600＝1.0后以1 100 r/min接至4 m L新鮮的生物被膜誘導(dǎo)液中培養(yǎng)24 h。然后用蒸餾水輕柔洗去菌液,并用1%的結(jié)晶紫染液染色20 min后觀察。

1.6.2生物被膜形成定量檢測(cè)試驗(yàn) 將上述調(diào)節(jié)至D600＝1.0的菌液稀釋100倍后以每孔150μL菌液加入96孔板中,每組設(shè)10個(gè)平行對(duì)照,30℃靜置培養(yǎng)24 h。次日棄掉菌液,用蒸餾水溫柔洗去菌液,然后用1%的結(jié)晶紫染液染色20 min,用蒸餾水溫柔清洗至沖洗液變?yōu)闊o(wú)色后加入95%的乙醇溶液將結(jié)晶紫溶解,用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于D600處檢測(cè)吸光度。

1.7剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基菌落表型試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[10]配置剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基（1 g蛋白胨；0.5 g酵母浸出物；4 mg剛果紅和2 mg考馬斯亮藍(lán)R-250加入100 m L水中）,細(xì)菌在該培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)可通過(guò)Curli菌毛和纖維素表達(dá)量的不同而出現(xiàn)不同的菌落表型。具體方法為:轉(zhuǎn)接SE50336、SE50336Δsef A至新鮮LB中,生長(zhǎng)至D600＝1.0,取2.5μL滴加于剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基上,在37℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)。

1.8生物被膜形成主要基因csg A、bcsA、pgaC、fimA的轉(zhuǎn)錄量測(cè)定

1.8.1RT-qPCR引物設(shè)計(jì) RT-qPCR引物序列見(jiàn)表2,其中g(shù)yr A為內(nèi)參基因。

表2 RT-qPCR引物序列

1.8.2cDNA制備 使用TRIzol法提取RNA。簡(jiǎn)言之,取SE50336、SE50336Δsef A過(guò)夜培養(yǎng)菌液,12 000 r/min離心10 min；棄去上清后加入300μL含1%溶菌酶的PBS,室溫裂解5 min；再加入1 m L TRIzol Universal試劑,孵育3 min；加入300μL氯仿孵育3 min,4℃12 000 r/min離心15 min；取上層水樣液體到新離心管,加入2倍體積異丙醇,—20℃沉淀20 min；4℃12 000 r/min離心10 min；棄上清,用75%乙醇洗滌沉淀；4℃12 000 r/min離心5 min；棄上清置室溫中自然干燥,用30μL無(wú)RNA酶水溶解。使用Ta KaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,制備cDNA。

1.8.3RT-qPCR反應(yīng) 目標(biāo)基因表達(dá)分析用DNA結(jié)合染料（SYBR Green）,RT-qPCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3,上機(jī)后反應(yīng)程序參照南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司2×AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix（Low ROX Premixed）試劑盒要求,將退火溫度時(shí)間修改為34 s,其余參數(shù)為ABI7500 software默認(rèn)。反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線以確保引物擴(kuò)增特異性,數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量方法（2—ΔΔCt）。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次以減少誤差,利用Graphpad Prism8軟件進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA）,并作圖。

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.9細(xì)胞黏附試驗(yàn)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）培養(yǎng)于含12%FBS的DMEM中。2 d左右用250μL 0.25%胰蛋白酶消化傳代1次,培養(yǎng)條件為37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中。前1 d晚上將Caco-2細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移至96孔板每孔100μL,可在次日鋪滿孔底。然后分別轉(zhuǎn)接SE50336、SE50336Δsef A至新鮮LB中培養(yǎng)至D600＝1.0,用PBS清洗菌液2次。菌液按MOI＝100∶1的比例加入細(xì)胞孔,每組8個(gè)重復(fù),37℃共孵育1 h。除去未黏附的細(xì)菌,裂解細(xì)胞30 min,通過(guò)10倍稀釋涂布于麥康凱平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.10小鼠體內(nèi)致病性試驗(yàn)將36只小鼠隨機(jī)分為3大組,每個(gè)大組再隨機(jī)分成3個(gè)小組（即4只/小組）,分組及攻毒劑量如表4所示。各組小鼠在相同條件下隔離飼養(yǎng)7 d。將p BR322質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入SE50336、SE50336Δsef A中,利用含氨芐青霉素及四環(huán)素的平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),并制成生理鹽水細(xì)菌懸液；3個(gè)小組分別腹腔注射10,102,103CFU/200μL的細(xì)菌；攻毒后,每隔12 h觀察1次小鼠狀態(tài),連續(xù)觀察7 d,記錄小鼠發(fā)病的癥狀,并用Karber法計(jì)算LD50；然后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,肉眼觀察其病理變化；采集死亡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、腎、脾、肺、盲腸、小腸進(jìn)行細(xì)菌分離。

表4 小鼠分組情況及攻毒劑量 只

1.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后用Graphpad Prism對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行P＜0.0500水平的顯著性方差分析。其中*代表顯著差異為0.010 0＜P＜0.050 0；**代表顯著差異為0.005 0＜P＜0.010 0；***代表顯著差異為0.001 0＜P＜0.005 0；****代表顯著差異為0.000 5＜P＜0.001 0。

2 結(jié)果

2.1sef A基因缺失株的構(gòu)建腸炎沙門菌SE50336Δsef A菌株的PCR產(chǎn)物核酸電泳鑒定結(jié)果如圖1所示。野生株sef A擴(kuò)增產(chǎn)物為498 bp；一次重組菌株SE50336Δsef A::cat擴(kuò)增產(chǎn)物為1 115 bp；以SE50336Δsef A::Cat基因組為模板,用鑒定引物進(jìn)行Sanger測(cè)序,利用DNA star軟件比對(duì),證明SE50336菌株上的sef A基因已被cat取代；二次重組菌SE50336Δsef A擴(kuò)增產(chǎn)物為306 bp。

圖1 sef A基因缺失株核酸電泳圖

2.2生長(zhǎng)曲線繪制將SE50336、SE50336Δsef A的生長(zhǎng)情況繪制成生長(zhǎng)曲線（取各組D600數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值）,如圖2所示。SE50336、SE50336Δsef A在遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期的生長(zhǎng)情況均無(wú)明顯差異,排除了生長(zhǎng)情況不同而對(duì)后續(xù)研究造成影響的可能,使試驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力。

圖2 SE50336、SE50336Δsef A的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

2.3生物被膜形成檢測(cè)SE50336、SE50336Δsef A生物被膜形成的定性和定量檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果一致（圖3,4）。與SE50336相比,SE50336Δsef A的生物被膜形成能力顯著降低（P＜0.05）。

圖3 SE50336、SE50336Δsef A生物被膜定性檢測(cè)

圖4 SE50336、SE50336Δsef A生物被膜定量檢測(cè)

2.4剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基菌落表型鑒定在37℃培養(yǎng)情況下,SE50336、SE50336Δsef A在剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基上的菌落表型如圖5所示。SE50336野生株表現(xiàn)出典型的rdar表型,而sef A缺失株表現(xiàn)出saw表型,暗示其Curli菌毛和纖維素表達(dá)量下降。

圖5 SE50336、SE50336Δsef A在剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基上的菌落表型

2.5生物被膜合成相關(guān)基因csg A、bcsA、pgaC、fimA的轉(zhuǎn)錄量測(cè)定缺失株SE50336Δsef A中csg A、bcsA、pgaC、fim A基因表達(dá)水平較野生株顯著降低,再次驗(yàn)證了缺失株SE50336Δsef A形成生物被膜能力降低（圖6）。

圖6 SE50336、SE50336Δsef A對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附情況

圖6 RT-qPCR檢測(cè)csg A、bcsA、pgaC、fimA的表達(dá)量

2.6細(xì)胞黏附試驗(yàn)SE50336、SE50336Δsef A對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2的體外黏附情況如圖7所示。與野生株相比,基因缺失株Δsef A對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.41）,但是黏附Caco-2細(xì)胞的比例由100%降至69.7%。

2.7小鼠體內(nèi)致病性試驗(yàn)細(xì)菌攻毒后,試驗(yàn)小鼠（除對(duì)照組外）均于24 h后陸續(xù)出現(xiàn)食欲、飲欲減退,扎堆、被毛逆亂、腹瀉等臨床癥狀,死亡多發(fā)于96 h后。以Karber法計(jì)算半數(shù)致死量,LD50＝lg—1[XM-I（∑P-0.5）],式中XM為最大劑量的對(duì)數(shù),P為各組動(dòng)物的病死率,以小數(shù)表示；∑P為各組動(dòng)物病死率之和,I為相鄰2組劑量對(duì)數(shù)之差。各細(xì)菌引起動(dòng)物的病死情況及其LD50見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠死亡數(shù)及LD50

剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有病死小鼠的肝、腎、脾、腸道充血腫大,肝臟表面具有明顯的黃色壞死灶,肺臟無(wú)明顯變化,部分小鼠腸道內(nèi)充滿氣體和液體,腸系膜部分水腫。

隨機(jī)采集各組死亡小鼠的肝臟、腎、脾、肺、盲腸、小腸置于亞硒酸鹽胱氨酸液體增菌培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后劃線于含有氨芐青霉素及四環(huán)素的木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂上,平板上均出現(xiàn)黑色菌落,對(duì)照組不產(chǎn)生任何菌落,表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡是由于攻毒實(shí)驗(yàn)菌株而造成,且人工感染后,腸炎沙門菌在臟器中分布廣泛,形成菌血癥。

3 討論

細(xì)菌可以通過(guò)形成生物被膜增加對(duì)環(huán)境的抵抗力,是細(xì)菌持續(xù)感染與反復(fù)感染的重要原因,但是尚未見(jiàn)SEF14菌毛對(duì)腸炎沙門菌生物被膜形成影響的相關(guān)研究報(bào)道。纖維素和Curli菌毛是生物被膜形成過(guò)程中重要的組成部分[11],細(xì)菌在剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的表型能夠反映纖維素和Curli菌毛生成量。本試驗(yàn)結(jié)果吧表明,sef A基因缺失使得在剛果紅-考馬斯亮藍(lán)無(wú)鹽培養(yǎng)基上表型為rdar的SE50336表現(xiàn)出saw表型,提示SEF14菌毛與纖維素和Curli菌毛表達(dá)成正相關(guān)。另一方面csg A、bcsA、pgaC、fim A的表達(dá)量影響了生物被膜的形成[12],因此本研究對(duì)缺失株上述基因的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行了RT-qPCR測(cè)定,再次驗(yàn)證缺失株生物被膜形成能力降低。

菌毛能夠介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞黏附侵襲毒力作用[13],但目前SEF14菌毛在腸炎沙門菌致病過(guò)程中的作用存在很大的爭(zhēng)議。THORNS等[14]報(bào)道,SEF14菌毛突變株較野生株更易被人中性粒細(xì)胞吞噬。EDWARDS等[15]構(gòu)建了關(guān)于sef A和sefD的相關(guān)突變株研究SEF14菌毛的作用,結(jié)果表明sef D是SEF14菌毛毒力的必要單位,并且SEF14菌毛能夠有效地幫助腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞中存活,有利于其長(zhǎng)期隱性感染。本試驗(yàn)結(jié)果表明,野生株與Δsef A缺失株在黏附Caco-2細(xì)胞能力上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這與本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)腸炎沙門菌野生株以及SEF14菌毛缺失株對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞以及Caco-2細(xì)胞的黏附測(cè)定結(jié)果相吻合[16],表明SEF14菌毛可能并不是腸炎沙門菌的主要黏附因子。然而,COLLIGHAN等[17]報(bào)道,SEF14菌毛能夠介導(dǎo)腸炎沙門菌特異性黏附于家禽的生殖道。也有人指出,SEF14菌毛單因子并不能發(fā)揮主要毒力作用,而是與其他毒力因子一起發(fā)揮協(xié)同作用,抑或是感染宿主不同,產(chǎn)生的毒力作用也不盡相同[18]。本研究利用腸炎沙門菌參考株SE50336以及其亞單位基因缺失株

SE50336Δsef A探究SEF14菌毛對(duì)腸炎沙門菌致病力的影響,結(jié)果顯示野生株的LD50低于突變株SE50336Δsef A,這一差異說(shuō)明SEF14菌毛與腸炎沙門菌致病力有關(guān),且缺失SEF14菌毛主要亞單位編碼基因sef A后,能夠降低腸炎沙門菌的毒力。

本試驗(yàn)探索了SEF14菌毛對(duì)腸炎沙門菌生長(zhǎng)、生物被膜形成以及對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力的影響,并探究了缺失株對(duì)小鼠致病力的影響。目前,對(duì)SEF14菌毛的致病機(jī)制存在爭(zhēng)議,其主要原因在于缺失該特定菌毛操縱子基因的體外克隆表達(dá)和功能性研究,以及相關(guān)基因缺失株的系統(tǒng)性功能性比較研究。我們實(shí)驗(yàn)室最近的研究發(fā)現(xiàn),部分沙門菌血清型的sef14操縱子中確實(shí)存在假基因,這一發(fā)現(xiàn)也為進(jìn)一步探索SEF14菌毛提供重要信息。因此關(guān)于SEF14菌毛的功能值得進(jìn)一步探究。隨著SEF14菌毛功能的解析,將有助于加速探尋防控腸炎沙門菌的有效方法。