不同轉(zhuǎn)化條件對(duì)3種農(nóng)桿菌GFP基因在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)的影響

張悅婧 李 穎 王娟娟 龐海龍 賈凌云 馮漢青

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

瞬時(shí)表達(dá)是指將外源基因以非整合的方式導(dǎo)入細(xì)胞，以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的基因高水平表達(dá)的技術(shù)。由于瞬時(shí)表達(dá)不需要將外源基因整合到細(xì)胞的染色體上，并且不需要通過篩選，也不產(chǎn)生可穩(wěn)定遺傳的后代，故與穩(wěn)定表達(dá)相比，瞬時(shí)表達(dá)具有簡(jiǎn)單、快速、周期短、效率高、生物安全性強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，該技術(shù)在分子生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用于外源基因的表達(dá)、啟動(dòng)子和抑制子功能分析、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)間相互作用、轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的互作等方面。此外，該系統(tǒng)也用于藥用蛋白的生產(chǎn)，為疫苗、抗體、生物制藥的研發(fā)開辟了捷徑。

通過瞬時(shí)表達(dá)在植物中導(dǎo)入外源基因的方法有基因槍法、電擊法、聚乙二醇法、植物病毒介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌滲透法。其中，農(nóng)桿菌滲透法操作簡(jiǎn)便，易于轉(zhuǎn)染，表達(dá)效率高，可攜帶較大的外源基因片段，同時(shí)可以在完整植株上進(jìn)行表達(dá)，因此使用農(nóng)桿菌滲透法所介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)在上述方法中最為普遍和廣泛。其基本流程為構(gòu)建雙元表達(dá)載體系統(tǒng)，將目的基因插入到Ti 質(zhì)粒上的T-DNA上，形成重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后利用農(nóng)桿菌侵染植物葉片，通過輔助性質(zhì)粒的Vir區(qū)基因與重組質(zhì)粒T-DNA 區(qū)的反式作用激活T-DNA 的轉(zhuǎn)移，從而將目的片段的基因轉(zhuǎn)至植物細(xì)胞的細(xì)胞核中；由此，雖然大部分T-DNA 并未整合到植物基因組中，只是暫存在于核內(nèi)，但仍然可利用植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)對(duì)T-DNA 上攜帶的目的基因進(jìn)行瞬間表達(dá)，達(dá)到短期基因表達(dá)的目的。

目前，常用的農(nóng)桿菌菌株有LBA4404、EHA105、GV3101 等，主要來源于C58 和Ach5 菌株，其中EHA105、GV3101 菌株來源于C58，這類菌株生長(zhǎng)速率快，在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中易于操作，GV3101 菌株常用于構(gòu)建病毒載體來研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）；而LBA4404 菌株來源于Ach5，研究發(fā)現(xiàn)該類型菌株會(huì)增加番茄（L.）和煙草（L.）植株腫瘤發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化。已有研究表明，GV3101 和LBA4404 菌株通過產(chǎn)生細(xì)胞分裂素對(duì)植物免疫應(yīng)答基因的激活有不同的作用。Diamos 等比較發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌菌株EHA105 比GV3101 和LBA4301具有更強(qiáng)的侵染性。不同的農(nóng)桿菌菌株是由其染色體背景和Ti 質(zhì)粒決定的，這三種菌株都含有不同的非致瘤Vir輔助型質(zhì)粒，并且主要是通過修飾Vir區(qū)的相關(guān)基因來影響T-DNA 轉(zhuǎn)移的頻率，所以不同的農(nóng)桿菌菌株的毒力（侵染力）不同。近幾年，利用這些菌株分別在擬南芥（L. Heynh）、番茄、綠豆（L.Wilczek）、葡萄（L.）等植物中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，其中以C58 染色體為背景的菌株EHA105、GV3101等應(yīng)用最為廣泛。

一方面，不同農(nóng)桿菌、以及農(nóng)桿菌的濃度、侵染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)表達(dá)效率的影響尚無(wú)明確報(bào)道。另一方面，近年來利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)仍然存在蛋白質(zhì)產(chǎn)量低等問題；目前提高外源蛋白質(zhì)產(chǎn)量主要是從表達(dá)載體自身構(gòu)成方面進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，而對(duì)農(nóng)桿菌菌種以及濃度等的選擇研究較少?；诖?，本研究利用雙元載體連接GFP 作為報(bào)告基因，以農(nóng)桿菌注射侵染法為手段，分析了不 同 農(nóng) 桿 菌（LBA4404 菌 株、EHA105 菌 株、GV3101 菌株）、菌液濃度以及侵染時(shí)間對(duì)GFP 熒光表達(dá)量的影響，從而為瞬轉(zhuǎn)過程中農(nóng)桿菌相關(guān)因素的查明和條件的優(yōu)化等工作提供了有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

將本氏煙草（L.）種子播種在育苗盤中的泥炭上，置于25℃、50%濕度的培養(yǎng)室中，以16 h∕8 h晝夜周期生長(zhǎng)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出3～4片葉子后轉(zhuǎn)移至空間較大的托盤中，培養(yǎng)5～6 周的煙草用于瞬時(shí)侵染。

1.2 菌液的制備

本實(shí)驗(yàn)中使用的農(nóng)桿菌菌株由荷蘭Wageningen 大學(xué)生物系統(tǒng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Klaas Bouwmeester教授饋贈(zèng)。將帶有GFP 編碼基因的雙元轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的三種不同農(nóng)桿菌（LBA4404 菌株、EHA105菌株、GV3101菌株）在含50 mg·L卡那霉素（Kana）、25 mg·L利福平（Rif）、25 mg·L氯霉素（Chl）的YEB 平板上劃線復(fù)壯，無(wú)轉(zhuǎn)化載體的三種對(duì)照菌株在僅含25 mg·L利福平（Rif）的YEB平板上劃線復(fù)壯。次日挑取單菌落在含相同抗生素的YEB 液體培養(yǎng)基中28℃，180 r·min振蕩過夜，將菌液移至5 mL 離心管中，4℃、5 000 r·min離心10 min 后棄上清收集菌液，加入浸潤(rùn)緩沖液（10 mmol·LMES-KOH，pH5.5、10 mmol·LMg-SO、100 μmol·L的乙酰丁香酮混合溶液）清洗菌體（去除殘留的抗生素）。收集后菌體重懸于浸潤(rùn)緩沖液中，稀釋菌體并測(cè)其對(duì)應(yīng)的OD值來設(shè)置不同的濃度梯度（OD分別為0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0）。室溫放置3 h用于侵染煙草葉片。

1.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法

選取大小、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的煙草葉片，用5 mL無(wú)菌注射器吸取2 mL 菌懸液，取針頭輕刺待注射的煙草葉片下表皮，將菌懸液緩慢注射到葉片中。每個(gè)濃度梯度注射2 個(gè)葉片，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)注射后的煙草繼續(xù)在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，在侵染后第2、4、6 天用熒光體視鏡（Leica，德國(guó)）檢測(cè)葉片擴(kuò)散區(qū)的綠色熒光表達(dá)量并拍照記錄。

1.4 綠色熒光的定量分析

用Image J V1.8.0 軟件分析熒光圖片，所得數(shù)值均為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以＜0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHA105 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的影響

農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化過程中，菌液濃度和侵染時(shí)間是影響外源基因表達(dá)的重要因素。將EHA105菌液設(shè)置5 個(gè)不同濃度梯度，在注射后的第2、4、6天依次觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示（見圖2），隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)?？傮w上，第4天表達(dá)量顯著高于其它侵染時(shí)間組，并且菌液濃度為0.6 時(shí)，GFP 熒光表達(dá)量達(dá)到最大值，菌液濃度為0.4 和0.8 時(shí)表達(dá)效果相同（見圖1）；侵染后第2 天和第6天，菌液濃度分別為0.2、0.8和1.0時(shí)熒光表達(dá)量無(wú)顯著性差異。因此，EHA105 菌株在濃度為0.6，第4天熒光表達(dá)量最高。

圖1 EHA105菌液的GFP熒光表達(dá)量不同字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）；采用Image J 軟件對(duì)不同濃度和不同侵染時(shí)間下GFP熒光表達(dá)量進(jìn)行量化處理的結(jié)果；下同F(xiàn)ig.1 GFP fluorescence expression of EHA105 bacterial solutionDifferent letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level；Image J software was used to quantify the GFP fluorescence expression at different concentrations and different infection times；the same as below

圖2 EHA105菌液在不同濃度和不同侵染時(shí)間下GFP熒光表達(dá)量A.3 種不同農(nóng)桿菌的對(duì)照組；B.EHA105 菌液在不同濃度（OD600值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）和不同侵染時(shí)間下（第2 天、第4 天、第6 天）GFP表達(dá)量的代表性圖片F(xiàn)ig.2 expression of GFP in EHA105 bacteria at different concentrations and different infection timesA.Control group of 3 different Agrobacteria；B.Representative images of GFP expression in EHA105 bacteria at different concentrations（OD600 values were 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）and at different infection times（day 2，day 4 and day 6）

2.2 LBA4404 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的影響

結(jié)果顯示（見圖4），隨著LBA4404菌液濃度增加，GFP 熒光呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，菌液濃度為0.8 時(shí)，熒光表達(dá)量達(dá)到最大值，然而當(dāng)菌液濃度達(dá)到1.0時(shí)，GFP 表達(dá)量與峰值相比有所下降；在菌液注射后第2天，熒光表達(dá)量較高，隨著侵染時(shí)間的增加，GFP 熒光表達(dá)量不斷下降，但侵染后第4 天，菌液濃度為0.6 和0.8 的熒光表達(dá)量無(wú)顯著性差異（見圖3）。綜合可見，LBA4404 菌株在濃度為0.8，侵染時(shí)間為第2天時(shí)GFP表達(dá)量最高。

圖3 LBA4404菌液的GFP熒光表達(dá)量Fig.3 GFP fluorescence expression of LBA4404 bacterial solution

圖4 LBA4404菌液在不同濃度和不同侵染時(shí)間下GFP熒光表達(dá)量LBA4404菌液在不同濃度（OD600值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）和不同侵染時(shí)間下（第2天、第4天、第6天）GFP表達(dá)量的代表性圖片F(xiàn)ig.4 expression of GFP in LBA4404 bacteria at different concentrations and different infection timesRepresentative images of GFP expression in LBA4404 bacteria at different concentrations（OD600 values were 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）and at different infection times（day 2，day 4 and day 6）

2.3 GV3101菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的影響

如圖5 所示，GV3101 菌株整體熒光表達(dá)量較弱，但相比于對(duì)照組均能檢測(cè)到熒光。菌液濃度為0.6 時(shí)，綠色熒光蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高，其它的濃度組表達(dá)量較低；在菌液注射后的第4 天，熒光表達(dá)量最強(qiáng)，菌液濃度為0.2 和0.4 以及0.8 和1.0 時(shí)，熒光表達(dá)量無(wú)明顯差異（見圖6）。因此GV3101菌株在濃度為0.6，侵染后第4天熒光表達(dá)量較高。

圖5 GV3101菌液的GFP熒光表達(dá)量Fig.5 GFP fluorescence expression of GV3101 bacterial solution

圖6 GV3101菌液在不同濃度和不同侵染時(shí)間下GFP熒光表達(dá)量GV3101菌液在不同濃度（OD600值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）和不同侵染時(shí)間下（第2天、第4天、第6天）GFP表達(dá)量的代表性圖片F(xiàn)ig.6 expression of GFP in GV3101 bacteria at different concentrations and different infection timesRepresentative images of GFP expression in GV3101 bacteria at different concentrations（OD600 values were 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）and at different infection times day 2，ay 4 and day 6）

從以上研究結(jié)果可以看出，在注射后的第2天均能檢測(cè)到綠色熒光蛋白，但不同的菌株熒光表達(dá)量差異明顯，第6天后煙草葉片基本檢測(cè)不到熒光。對(duì)GFP 熒光量化處理后的結(jié)果（圖1、圖3 和圖5）與圖片中觀察到的結(jié)果一致。選擇3 種農(nóng)桿菌菌株熒光表達(dá)量最高的濃度和時(shí)間組合，對(duì)比發(fā)現(xiàn)LBA4404 菌株的熒光表達(dá)量最高，分別是EHA105 和GV3101 菌株表達(dá)量的1.4 和3.8 倍（圖7），GV3101菌株表達(dá)量最低。

圖7 3種不同農(nóng)桿菌菌株的GFP熒光表達(dá)量分別選取3種不同農(nóng)桿菌菌株熒光表達(dá)量最高的濃度和時(shí)間組合進(jìn)行比較，EHA105菌株（OD600=0.6，第4天）；LBA4404菌株（OD600=0.8，第2天）；GV3101菌株（OD600=0.6，第4天）Fig.7 expression of GFP in 3 different agrobacterium strainsThe concentration and time combinations with the highest fluorescence expression of 3 different Agrobacterium strains were selected for comparison，EHA105 strain（OD600=0.6，day 4）；LBA4404 strain（OD600=0.8，day 2）；GV3101 strain（OD600=0.6，day 4）

3 討論

瞬時(shí)表達(dá)在合成和生產(chǎn)外源重組蛋白的過程中扮演了重要的角色，較之傳統(tǒng)的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白不僅能夠保證蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工等過程，而且成本低廉。因此，植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)為高效、快速表達(dá)疫苗抗原或藥用蛋白提供了一個(gè)新的平臺(tái)，然而，目前如何提高植物體內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量是瞬時(shí)表達(dá)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前，諸多研究集中于對(duì)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄或翻譯原件的改造，而對(duì)農(nóng)桿菌相關(guān)因素的分析較少，因此本研究以瞬時(shí)表達(dá)體系的常用模式植物本氏煙草和3種常用的農(nóng)桿菌進(jìn)一步分析了農(nóng)桿菌菌株、濃度、侵染時(shí)間等要素對(duì)瞬時(shí)表達(dá)體系的影響。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究所用的3種菌株均能在煙草中瞬時(shí)表達(dá)基因，而對(duì)照組的3 種農(nóng)桿菌幾乎無(wú)熒光出現(xiàn)（見圖2A）。但每種菌株在植物中轉(zhuǎn)化條件有所不同，體現(xiàn)在不同的菌株在轉(zhuǎn)化后GFP 熒光達(dá)到最高表達(dá)效率的OD值和時(shí)間有所不同。Sheludko 等認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中最適菌液濃度OD在0.1～1.5，但顯然這是一個(gè)較為寬泛的范圍。我們的研究結(jié)果顯示，EHA105 和GV3101 菌 株 的OD值 為0.6 時(shí)，GFP 表達(dá)量最高，而LBA4404 菌株與其它兩種菌株不同，OD值在0.8時(shí)，GFP 熒光表達(dá)量最強(qiáng)，然而當(dāng)菌液濃度達(dá)到1.0 及以上時(shí)，熒光表達(dá)量有下降的趨勢(shì)，同時(shí)煙草葉片也會(huì)有泛黃的狀態(tài)，這可能揭示了農(nóng)桿菌濃度過高或過低，都會(huì)影響外源基因的表達(dá)效率；菌液濃度過低不能實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌的有效轉(zhuǎn)化，而菌液濃度過高會(huì)對(duì)植物的生理或細(xì)胞活力產(chǎn)生一定的損傷，可能會(huì)影響植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄或翻譯能力，進(jìn)而影響了外源基因的表達(dá)水平。

已有研究表明，農(nóng)桿菌侵染時(shí)間同樣會(huì)影響表達(dá)效率，侵染時(shí)間過短，農(nóng)桿菌不能有效轉(zhuǎn)化，侵染時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)嚴(yán)重影響植物的生理狀態(tài)。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著侵染時(shí)間的增加，EHA105 和GV3101 菌株在第4 天熒光表達(dá)量最強(qiáng)，在侵染后第6 天GFP 熒光表達(dá)量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但是LBA4404菌株在第2天熒光表達(dá)量最強(qiáng)，之后呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。這說明每種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)的表達(dá)峰值有所差異，因此，農(nóng)桿菌菌株、濃度以及侵染時(shí)間均是影響瞬時(shí)表達(dá)的重要條件。

由于這3 種農(nóng)桿菌菌株的遺傳背景和攜帶的Ti 質(zhì)粒不同，以上所觀察到的差異的內(nèi)在分子機(jī)制應(yīng)和3 種農(nóng)桿菌菌株的遺傳背景和攜帶的Ti 質(zhì)粒密切相關(guān)。但有趣的是，Zottini 等用3 種不同的農(nóng)桿菌菌株LBA4404、GV3101 和AGLl 浸潤(rùn)不同的葡萄品種表達(dá)GFP 基因，結(jié)果表明菌株之間并無(wú)差異。而本研究發(fā)現(xiàn)，LBA4404 菌株相比于EHA105和GV3101菌株在本氏煙草葉片中GFP表達(dá)效率最高，EHA105菌株次之，GV3101菌株瞬時(shí)表達(dá)效率最低。這表明不同農(nóng)桿菌菌株的確會(huì)影響外源基因的瞬時(shí)表達(dá)效率，但也和所使用的植物有關(guān)。因而推測(cè)，植物和農(nóng)桿菌的親和性或是互作關(guān)系在很大程度上會(huì)影響瞬時(shí)表達(dá)過程中植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌菌株的敏感性，并由此影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率。此外，據(jù)報(bào)道，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物過程中，當(dāng)細(xì)菌附著到植物細(xì)胞上之后，Ti 質(zhì)粒上Vir 編碼的基因能夠幫助轉(zhuǎn)移和整合T-DNA 到植物細(xì)胞中。而VirG 是根癌農(nóng)桿菌中VirA∕VirG兩組分系統(tǒng)的響應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可響應(yīng)植物宿主信號(hào)介導(dǎo)Vir基因的表達(dá)，可以影響農(nóng)桿菌在植物中的轉(zhuǎn)化效率。因此我們推測(cè)，不同農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因瞬時(shí)表達(dá)效率不同也可能與它附著在植物細(xì)胞上的能力以及農(nóng)桿菌中Ti 質(zhì)粒上Vir 基因的差異有關(guān)。綜上所述，農(nóng)桿菌菌株是影響瞬時(shí)表達(dá)的重要條件，從而決定了獲得最高外源基因表達(dá)量的菌株工作濃度和時(shí)間，但本研究所觀察到的現(xiàn)象的內(nèi)在分子機(jī)制還有待進(jìn)一步查明。