長(zhǎng)白落葉松轉(zhuǎn)錄因子LobHLH34克隆及表達(dá)分析

楊宇寧 董 昊 董實(shí)偉 王乃銳 宋 躍 張含國(guó) 李淑娟

（林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

落葉松（spp. Mill.）具早期速生、抗逆性強(qiáng)、輪伐期短等優(yōu)勢(shì)，是東北地區(qū)三大針葉用材樹(shù)種之一。長(zhǎng)白落葉松（）又稱(chēng)朝鮮落葉松，為松科（Pinaceae）落葉松屬（）的落葉喬木，作為北半球所獨(dú)有的一種針葉用材樹(shù)種，廣泛分布在我國(guó)東北以及華北的高山地區(qū)，是東北地區(qū)的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹(shù)種，在干旱且寒冷的困難立地條件下其抗逆性和適應(yīng)性較其他樹(shù)種更強(qiáng)。目前該樹(shù)種已建立高效的體胚發(fā)生及懸浮培養(yǎng)體系。因此，它是進(jìn)行落葉松抗逆基因克隆和機(jī)制研究的理想材料。

bHLH（basic∕helix-loop-helix）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它存在于真核生物中，由兩個(gè)保守區(qū)域構(gòu)成：堿性區(qū)域和bHLH（螺旋—環(huán)—螺旋）區(qū)域，前者含有大量堿性氨基酸，主要參與DNA 的結(jié)合；后者由疏水氨基酸殘基構(gòu)成，利于HLH 之間相互作用形成二聚體。植物基因組中包含許多轉(zhuǎn)錄因子，其中WRKY、NAC、CBF、MYB、AP2∕EREBP 等均參與非生物脅迫應(yīng)答且被廣泛研究。而bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的研究相對(duì)滯后。玉米（）中的和基因是植物界中最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，隨后研究者對(duì)水稻（L.）和擬南芥（）等模式植物進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究。通過(guò)全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在擬南芥及水稻中bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的家族成員分別有164 和180個(gè)，擬南芥的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中將bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族分為12 個(gè)亞家族，水稻中將其分為22 個(gè)亞家族。它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、花器官形成、激素應(yīng)答、次生產(chǎn)物代謝和抗逆性等方面發(fā)揮了重要作用。目前關(guān)于bHLH 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與植物逆境響應(yīng)的研究已有一些報(bào)道，如發(fā)現(xiàn)一些bHLH轉(zhuǎn)錄因子受低溫、高鹽、干旱、缺鐵及缺磷等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。研究表明，水稻在干旱脅迫下表達(dá)量顯著增高，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱脅迫的耐受程度。在擬南芥中，和通過(guò)降低PP2Cs 編碼基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。

本研究以長(zhǎng)白落葉松為材料，根據(jù)長(zhǎng)白落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，克隆長(zhǎng)白落葉松基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)該基因在長(zhǎng)白落葉松不同器官中的表達(dá)特異性及不同類(lèi)型非生物脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)探究該基因在長(zhǎng)白落葉松中的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與主要試劑

植物材料：供試的長(zhǎng)白落葉松種子選自黑龍江雞西種源，選取種皮飽滿、表面有光澤的長(zhǎng)白落葉松種子，用流水沖洗3～5 d，選取沉在底部的優(yōu)勢(shì)種子播種于溫室苗盤(pán)內(nèi)，基質(zhì)為V（草炭土）∶V（蛭石）=1∶1 的營(yíng)養(yǎng)土，澆透水覆膜保濕，培養(yǎng)條件為溫度25±1 ℃，16 h 光照∕8 h 黑暗，濕度為75%。其間隔天掀開(kāi)噴水通風(fēng)1 次，培養(yǎng)30 d 左右，當(dāng)針葉完全伸開(kāi)時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的小苗移入直徑10 cm的培養(yǎng)缽中，每盆1 株，繼續(xù)培養(yǎng)3 個(gè)月左右。進(jìn)行亞細(xì)胞定位的材料為溫室內(nèi)生長(zhǎng)8 個(gè)月的野生型毛果楊（）木質(zhì)部原生質(zhì)體。

主要試劑：cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于百泰克公司；PCR酶KOD FX購(gòu)于東洋紡（上海）生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Omega Bio-tek 公司；限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA 連接酶購(gòu)于NEB（北京）有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖購(gòu)于北京沃比森科技有限公司；DL 2000 DNA Marker購(gòu)于biosharp公司。

1.2 菌株與載體

大腸桿菌感受態(tài)DH5α 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101為本實(shí)驗(yàn)室保存；VB191103-1905rcy 載體菌種和pUC19-GFP載體均為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 長(zhǎng)白落葉松總RNA 提取與cDNA 第一鏈的合成

取苗齡4個(gè)月左右的長(zhǎng)白落葉松土培苗全株，經(jīng)無(wú)菌水沖洗、吸干表面水分后加液氮迅速研磨成粉末，采用CTAB 法提取植株總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)（產(chǎn)品型號(hào)：Micro Drop）檢測(cè)RNA的濃度，用1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，最終獲得RNA 模板。再根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，在PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，并放在-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 長(zhǎng)白落葉松基因的克隆與特異引物設(shè)計(jì)

從長(zhǎng)白落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因的全長(zhǎng)序列，基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?96 bp。利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），引物由上海生工生物有限公司合成。以整株的RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板，采用KOD-FX PCR 酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克隆出基因的全長(zhǎng)片段。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：ddHO 10 μL，2x PCR buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol·LdNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL，擴(kuò)增條件：94 ℃2 min，98 ℃10 s，58 ℃30 s，68 ℃42 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃10 min；16 ℃保溫。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用DL2000 DNA Marker 比對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段長(zhǎng)度，確認(rèn)正確后，使用膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，操作步驟與方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。膠回收后用HⅠ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶將基因和載體同時(shí)雙酶切，后將目的片段與VB191103-1905rcy 載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè)，將目的條帶大小正確的菌株送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)的序列，依據(jù)各類(lèi)生物信息在線工具和軟件進(jìn)行分析。利用NCBI 在線軟件分析該基因的開(kāi)放閱讀框，使用在線工具CLUSTALW 將獲得的核苷酸和氨基酸序列與NCBI 中已登錄的其它物種進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，結(jié)合MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析、保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、親水性疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，具體方法見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件Table 2 Websites and softwares for bioinformatics analysis

1.3.4 LobHLH34亞細(xì)胞定位分析

選取溫室內(nèi)生長(zhǎng)8個(gè)月的野生型毛果楊，以木質(zhì)部原生質(zhì)體為材料進(jìn)行亞細(xì)胞定位。將基因序列構(gòu)建到pUC19-GFP 載體上，成功構(gòu)建該基因的融合綠色熒光蛋白（GFP）瞬時(shí)表達(dá)載體；使用pUC19-H2A-mCherry 作為細(xì)胞核定位標(biāo)記，用100 mL 2×YT 培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌大提質(zhì)粒，至質(zhì)粒濃度達(dá)到2000 ng·μL。質(zhì)粒與細(xì)胞核定位的瞬時(shí)表達(dá)載體與毛果楊木質(zhì)部分離出來(lái)的原生質(zhì)體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化并過(guò)夜培養(yǎng)，次日通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢觀察。

1.3.5 長(zhǎng)白落葉松基因的組織特異性表達(dá)檢測(cè)

選取4 月苗齡的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的長(zhǎng)白落葉松植株，以每3 株幼苗為一組樣本，分別進(jìn)行鹽脅迫，干旱脅迫及ABA 處理，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

分別配置200 mg·LNaCl、40%的PEG和50 mg·LABA 水溶液澆灌長(zhǎng)白落葉松土培苗，每盆中的溶液等量，使溶液完全浸透土壤。以上3種脅迫處理分別在0，12，24，48 和96 h 五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，0 h 為對(duì)照組。根、莖、葉分別取樣，取材后立即用液氮處理并放于-80℃冰箱保存。分別提取根、莖、葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR 儀（ABI Prism7500 型）進(jìn) 行qRT-PCR 分析該基因在長(zhǎng)白落葉松不同組織中的特異性表達(dá)。

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異定量引物-FQ 及-RQ，以tubulin 基因?yàn)閮?nèi)參設(shè)計(jì)正向引物tubulin-F 及tubulin-R（見(jiàn)表1），以脅迫處理后獲得的根、莖和葉cDNA為模板，進(jìn) 行qRT-PCR 分 析。反 應(yīng) 體 系：2×TransStartTOP∕Tip Green qPCR Supermix 10 μL、-QF∕QR 引 物（10.0 μmol·L）各0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，加ddHO至20 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，40次循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s。每個(gè)cDNA 模板均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，利用2法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)白落葉松總RNA 的檢測(cè)及LobHLH34 基因的克隆

以長(zhǎng)白落葉松為材料提取的總RNA 經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，有明顯的18 s RNA、28 s RNA 兩條條帶和微弱的5 s RNA 彌散狀條帶，且28 s RNA的亮度為18 s RNA 的兩倍（見(jiàn)圖1A），提取的總RNA質(zhì)量完好可用于后續(xù)試驗(yàn)。

利用在線軟件https：∕∕www.arabidopsis.org∕，運(yùn)行Blast 工具將該基因的ORF 與模式植物擬南芥對(duì)比，比對(duì)結(jié)果顯示該基因與擬南芥轉(zhuǎn)錄因子家族的相似度最高，因此命名為。利用長(zhǎng)白落葉松總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，利用特異性引物對(duì)基因ORF 序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 結(jié)果顯示與目的片段大小基本一致（見(jiàn)圖1B）。將菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，可以進(jìn)行后續(xù)操作。

圖1 長(zhǎng)白落葉松總RNA和擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoresis of total RNA in L.olgensis and PCR production

2.2 長(zhǎng)白落葉松LobHLH34基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

ExPAsy 分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)白落葉松基因蛋白分子式為CHNOS，完整的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為696 bp，共編碼231 個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖2）。該基因蛋白分子量為26.09 kDa，在組成蛋白的20 種氨基酸中，脯氨酸（Pro）和絲氨酸（Ser）所占比例最高，均占9.1%，半胱氨酸（Cys）所占比例最低，占1.3%。含有帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）和帶正電的氨基酸（Arg+Lys）個(gè)數(shù)分別為33 和34 個(gè)，理論等電點(diǎn)（pI）為7.73，脂溶指數(shù)61.73，總平均親水系數(shù)為-0.830，不穩(wěn)定系數(shù)為67.17；且該蛋白中第64 位親水性最強(qiáng)，得分為-3.156，第114 位疏水性最強(qiáng)，得分為1.867，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定的酸性親水蛋白（見(jiàn)圖3）。

圖2 LobHLH34基因序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and predicted amino acid sequences of LobHLH34

圖3 LobHLH34蛋白的親/疏水性分析預(yù)測(cè)Fig.3 Analysis pro-/hydrophobic of LobHLH34

2.2.2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

采用在線軟件SOPMA 對(duì)長(zhǎng)白落葉松氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，含α-螺旋（Alpha helix）101個(gè)，占43.72%；β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）2 個(gè)，占0.87%；延伸鏈（Extended strand）1個(gè)，占0.43%；無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）127 個(gè)，占54.98%（見(jiàn)圖4）。

圖4 LobHLH34蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicion of secondary structure of LobHLH34

2.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的延伸基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)繞和折疊。采用SWISS-MODEL 工具，運(yùn)用同源建模法對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模（見(jiàn)圖5）。其中建模范圍是83～166個(gè)氨基酸，序列對(duì)比一致性為30.95%。

圖5 LobHLH34蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of tertiary structure of LobHLH34

2.2.4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI 中的在線工具Conserved Domain Search Service（CD Search）對(duì)LobHLH34 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)（見(jiàn)圖6），結(jié)果表明，保守區(qū)包含從75 位至150 位的氨基酸，該基因?qū)儆赽HLHSF superfamily家族，包含ILR3保守結(jié)構(gòu)域。

圖6 LobHLH34蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Protein domain prediction of LobHLH34

2.2.5基因的進(jìn)化樹(shù)分析

用MEGA 5.0 軟件通過(guò)近臨相接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)，由系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，長(zhǎng)白落葉松和云杉的距離最為接近，和其他植物均相差較遠(yuǎn)（見(jiàn)圖7）。

圖7 LobHLH34系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of LobHLH34

2.3 長(zhǎng)白落葉松LobHLH34的亞細(xì)胞定位分析

為了解是否是典型的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞核表達(dá)功能，構(gòu)建了基因融合綠色熒光蛋白（GFP）瞬時(shí)表達(dá)載體。結(jié)果如圖8 所示：基因融合GFP發(fā)出的綠色熒光與細(xì)胞核定位的H2A基因融合mCherry發(fā)出的紅色熒光完全重疊，重疊區(qū)域顯示出黃色的光。表明轉(zhuǎn)錄因子是核定位蛋白，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。

圖8 LobHLH34亞細(xì)胞定位分析Fig.8 Subcellular localization of LobHLH34

2.4 長(zhǎng)白落葉松LobHLH34基因的表達(dá)模式分析

2.4.1基因在長(zhǎng)白落葉松不同器官下的表達(dá)模式

分別以長(zhǎng)白落葉松根、莖、葉為模板，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)分析基因在長(zhǎng)白落葉松各器官的相對(duì)表達(dá)量（見(jiàn)圖9）。結(jié)果表明：基因在落葉松各個(gè)器官中均有表達(dá)，以莖中的相對(duì)表達(dá)量為參照，葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，約為莖中的10 倍，根的相對(duì)表達(dá)量約為莖中的2倍。

圖9 LobHLH34基因不同器官的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of LobHLH34 gene in different organs

2.4.2基因在長(zhǎng)白落葉松逆境脅迫下的表達(dá)模式

為更深入了解長(zhǎng)白落葉松基因的生物學(xué)功能，本研究對(duì)其進(jìn)行了NaCl、PEG和ABA處理，采用qRT-PCR 分別對(duì)基因在根、莖、葉中的表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明：Na-Cl、PEG 和ABA 等非生物脅迫均對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量產(chǎn)生不同程度的影響。在NaCl脅迫后，落葉松根中基因表達(dá)量呈現(xiàn)升高—降低—升高的趨勢(shì)，不同時(shí)間點(diǎn)之間的表達(dá)量差異顯著。其中，在12 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照的2.7倍；在莖中該基因的表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)均為上調(diào)表達(dá)，12 h時(shí)表達(dá)量最高；在葉中該基因表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)（見(jiàn)圖10）。推測(cè)該基因在植物體不同器官中的調(diào)控模式不同；在PEG 脅迫下，落葉松根和莖中該基因的表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，其中根部表達(dá)量呈持續(xù)升高的趨勢(shì)；在莖中表達(dá)量短時(shí)間內(nèi)迅速升高而后迅速降低，但始終高于對(duì)照，24 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的27倍；在葉中該基因的表達(dá)量先下降后上升，在12 h時(shí)表達(dá)量最低，然后呈逐漸升高的趨勢(shì)（見(jiàn)圖11）。分析該基因可能參與滲透脅迫應(yīng)答，然而在不同器官中的響應(yīng)模式不同；在ABA處理后，根部各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著，呈現(xiàn)出明顯的先上升后降低的趨勢(shì)，24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照組的12倍；莖的表達(dá)量在12 h時(shí)變化不大，在24 h時(shí)表達(dá)量迅速升高；葉在12 h時(shí)先迅速降低，后逐漸升高，在96 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照基本持平（見(jiàn)圖12）。

圖10 NaCl 脅迫下LobHLH34 在長(zhǎng)白落葉松不同器官中的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）Fig.10 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under NaCl stress（P＜0.05）

圖11 PEG 脅迫下LobHLH34 在長(zhǎng)白落葉松不同器官中的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）Fig.11 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under PEG stress（P＜0.05）

圖12 ABA 脅迫下LobHLH34 在長(zhǎng)白落葉松不同器官中的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）Fig.12 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under ABA stress（P＜0.05）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子主要參與干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫以及礦質(zhì)元素鐵和磷脅迫的的逆境響應(yīng)調(diào)控。在長(zhǎng)白落葉松中克隆獲得基因，共含696 bp 的CDs 序列，編碼231 個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因所編碼的蛋白只包括ILR3保守結(jié)構(gòu)域，為非跨膜運(yùn)輸，不穩(wěn)定的酸性親水蛋白。該基因所編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（43.72%），無(wú)規(guī)卷曲（54.98%），β-折疊（0.87%），延伸鏈（0.43%）組成。選取了云杉等14 種植物的基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明長(zhǎng)白落葉松與云杉相似性最高。

qRT-PCR 研究發(fā)現(xiàn)，基因在長(zhǎng)白落葉松根、莖、葉中都有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低，表明該基因可能參與葉的光合作用或氣孔的發(fā)育過(guò)程，并影響了落葉松的組織特異性表達(dá)，而且在NaCl、PEG 及ABA 脅迫下，其表達(dá)量的變化趨勢(shì)各不相同：在NaCl 處理下，落葉松根和莖部表達(dá)量在12 h 迅速升高，在葉中卻呈下降趨勢(shì)；在PEG 脅迫下落葉松各器官的表達(dá)量始終上調(diào)表達(dá)，但程度不一樣，這與煙草（）基因在干旱脅迫下表達(dá)量始終高于對(duì)照的結(jié)果相符；在ABA 處理下，根部的表達(dá)量開(kāi)始迅速升高，在24 h 時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的12倍，莖部的表達(dá)量在12 h時(shí)變化很小，在24 h 才開(kāi)始上升，葉在12 h 時(shí)表達(dá)量迅速降低后基本與對(duì)照持平。葉在這3 種脅迫下，在12 h 時(shí)表達(dá)量與對(duì)照相比均存在顯著差異，表明該基因在葉中能夠較快的做出逆境脅迫響應(yīng)，初步分析認(rèn)為，落葉松基因的表達(dá)可能參與NaCl、PEG 脅迫和ABA 處理的應(yīng)答，但在不同脅迫下響應(yīng)模式有所差異。基因在響應(yīng)NaCl、PEG 和ABA 的過(guò)程中調(diào)控途徑及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。