白樺BpERF98基因的遺傳轉(zhuǎn)化及非生物脅迫應答反應

李 麒 閆思宇 陳 肅

（林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040）

低溫和鹽堿是限制植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫，這些非生物脅迫會導致植物減產(chǎn)而造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，甘蔗（）在遭受寒凍害后發(fā)生線粒體解體且保護酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均發(fā)生變化；鹽脅迫使楊樹（）的膜脂過氧化程度和電解質(zhì)外滲率顯著增加；在玉米（）研究中發(fā)現(xiàn)低溫脅迫使玉米超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等活性改變，糖、抗壞血酸、谷胱甘肽含量也發(fā)生變化。同時也有研究表明，植物可以通過調(diào)節(jié)自身的生理和形態(tài)的變化來提高對非生物脅迫下的適應性。例如，SOD、POD在非生物脅迫下被激活以抵御超氧自由基的毒害。因此，通過測量脅迫后SOD、POD活性、MDA含量以及相對電導率等生理指標可有效研究植物抗逆性，為提高林木抗性、增加苗木成活率、擴大林木栽培面積提供重要依據(jù)。

當植物遭受非生物脅迫時，體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)積極調(diào)控，其中不乏一些重要的調(diào)控基因，如植物中特有的AP2∕ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族。根據(jù)編碼AP2 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及序列的相似性，AP2∕ERF 基因家族又被具體細分為3 個家族：AP2 亞家族（編碼2 個AP2 結(jié)構(gòu)域）、ERF 亞家族（編碼1 個AP2 結(jié)構(gòu)域）和RAV 亞家族（編碼一個B3 結(jié)構(gòu)域和一個AP2結(jié)構(gòu)域）。AP2亞家族轉(zhuǎn)錄因子主要負責調(diào)控種子萌發(fā)、花器官的形成等過程；ERF 亞家族分為ERF 亞族（結(jié)合GCC-box 等順式作用元件來調(diào)控下游靶基因的表達）和DREB 亞族（結(jié)合在啟動子DRE 元件上，啟動下游基因表達）；RAV 亞家族分為RAV1 亞族和RAV2 亞族，可通過負調(diào)控FT 和赤霉素途徑，防止植株提早開花。

ERF 亞家族在植物響應生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，幾種水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯誘導的ERF整合了不同的信號通路，以介導植物對不同病原體和疾病條件的防御反應。辣椒（）基因受水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯脅迫誘導，特別在青枯病感染時表達量增高，在植物抵抗感染的過程中發(fā)揮正調(diào)控作用。大豆（）基因在干旱、鹽、脫落酸、乙烯，以及大豆花葉病毒的誘導下均應答，并且能夠增強植物抗花葉病毒和鏈格孢菌的能力。用乙烯處理香蕉（）果實，發(fā)現(xiàn)與表達量變化顯著，經(jīng)少量外源乙烯誘導可以促進兩者及香蕉中乙烯合成關鍵基因和的表達，并促進香蕉果實合成并釋放乙烯，證明ERF 類轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯的生物合成及信號傳導。而在小麥（）、白樺（）、柑橘（）和番茄（）中的研究則表明，基因亦響應干旱、低溫、鹽和各種植物激素等脅迫，具有重要的抗逆調(diào)控作用。雖然目前對于ERF 家族的研究較多，但是其在木本植物中的作用仍需要進一步探究。

白樺屬于落葉喬木，樹形優(yōu)美，可作行道樹和觀賞樹，且材質(zhì)堅硬適合制作家具、筷子和紙漿。白樺樹皮具有抗腫瘤、抗病毒等藥用價值。因其在木本植物中較為經(jīng)典，生長周期短且抗寒性強，故用于本實驗。并且本實驗室通過前期實驗分析發(fā)現(xiàn)白樺基因（與擬南芥基因序列較為相似故命名）在處于非生物脅迫時的表達量顯著上調(diào)，因此推測該基因有助于白樺植株對非生物脅迫的抵御，故克隆全長cDNA 序列，構(gòu)建過表達載體，成功獲得過表達的轉(zhuǎn)基因株系，為研究白樺非生物脅迫形成的分子基礎研究及抗性分子育種提供理論數(shù)據(jù)和研究材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因植物受體材料為野生型白樺組培苗。組織培養(yǎng)室溫度為24 ℃，光周期為16 h光照和8 h黑暗。選擇發(fā)育狀態(tài)良好的較大葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

大腸桿菌（）感受態(tài)細胞TOP10購買于昂羽生物有限公司。農(nóng)桿菌GV3101，植物表達載體pROKⅡ菌株為實驗室保存菌種。酶和T鏈接酶購買自大連寶生物有限公司。

1.2 ERF98基因的多序列比對分析

白樺的基因序列：

ATGGAAAAAGAGGGGAAGGGTCAGGGCAA AGAAGATGGGGAAAAAGATGTGCGTTACAGGG GAGTGAGACGGCGGCCGTGGGGGAAATACGCG GCGGAGATTCGTGACTCCACTAGGCATGGTGCC CGGCTGTGGCTGGGGACTTTTGACAGGGCAGAA GATGCGGCTCGGGCTTATGATCGAGCCGCCTTTG CAATGAGGGGAAACATGGCCATTCTTAACTTCC CCGATGAACACCGGTCACCACCCAATGTGGATT TTCCACCTCCTTCCTCTTCCTTGGCATCATCGTCA TCATCGTCGTCCTCATCCTCTTCATCGCAGGTTG ATAGAAATAGTAGTAGGTCTGAGCTTGGGAAAG AGGTTTTTGAGTTTGAGTATTTGGACGACAAGTT GTTGGAGGAACTTCTTGATTTTGATTACAAAACAAAGAAGAACTGA

利用NCBI 網(wǎng)站進行同源基因的查找。在BioEdit 軟件中進行蛋白質(zhì)多序列比對，比較同源基因的差異性。利用MEGA 5.1 軟件制作進化樹，比較同源基因的親緣性。

1.3 白樺BpERF98基因的克隆及其植物載體構(gòu)建

利用RNA 試劑盒（無錫百泰克生物技術有限公司）提取白樺總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡）合成cDNA作為基因克隆模板。根據(jù)植物過表達載體pROKⅡ的多克隆位點和基因特征，在設計引物時在基因兩端分別添加和限制性內(nèi)切酶位點（見表1）。將以白樺cDNA 為模板克隆獲得的基因插入到兩個酶切位點中間。通過聚合酶鏈式反應（PCR）進行目的基因擴增（反應程序：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；68 ℃延伸1 min；30 個循環(huán)；68 ℃延伸5 min）。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用膠回收試劑盒（Omega）回收，回收產(chǎn)物使用T4 鏈接酶連接到pROKⅡ載體上并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過篩選后送至擎科測序公司進行DNA 測序。通過凍融轉(zhuǎn)化法，將帶有的目的基因的載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 BpERF98的引物序列（黑色為酶切位點）Table 1 Primer sequences used for BpERF98 clone（The balck is the restriction enzyme cutting site）

1.4 白樺BpERF98基因遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

采用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化生長良好的野生型白樺葉片，獲得轉(zhuǎn)基因株系。對轉(zhuǎn)基因株系分株，提取DNA（天根生化科技有限公司），并進行PCR 實驗，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，篩選轉(zhuǎn)基因株系并進行無性系繁殖。

1.5 轉(zhuǎn)基因植物的非生物脅迫分析

對獲得的轉(zhuǎn)基因株系和野生型白樺進行大量的擴繁，待其生根后移栽至土壤中，繼續(xù)培養(yǎng)1 個月后進行非生物脅迫處理，測量相對電導率、超氧化物歧化酶（SOD）的活性（分光法，蘇州科銘生物技術有限公司）、過氧化物酶（POD）的活性（分光法，蘇州科銘生物技術有限公司）和丙二醛（MDA）的含量（分光法，蘇州科銘生物技術有限公司）等生理指標。進行3次生物學重復并計算平均值和標準誤差，使用prisn 6.0進行多重分析。白樺植株在組織培養(yǎng)室和溫室中培養(yǎng)，溫度均為24 ℃，光周期均為16 h 光照和8 h 黑暗。根據(jù)生長狀態(tài)選取了轉(zhuǎn)基因株系L1、L4、L12、L14 和L15 進行非生物脅迫實驗。

1.5.1 鹽脅迫

選用生長狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），使用NaCl的等滲溶液即150 mmol·LNaCl進行脅迫實驗。保持土壤的鹽分水平相同，在脅迫0、1、3 和5 d 后進行取樣（選取第3片到第5片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測量其生理指標。

1.5.2 低溫脅迫

選用生長狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），利用低溫光照培養(yǎng)箱（5 ℃，光周期為16 h光照∕8 h黑暗）模擬低溫脅迫。在脅迫0、3和5 d后進行取樣（選取第3片到第5片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測量其生理指標。

1.5.3 凍害脅迫

選用生長狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），利用零下培養(yǎng)箱（-5 ℃）處理5 min 后取出恢復正常培養(yǎng)，1 d 后進行取樣（選取第3 片到第5 片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測量其生理指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERF98基因的多序列比對分析

根據(jù)蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果可以看出，相似性在80%左右，不同之處可能是由于基因表達的差異。根據(jù)蛋白質(zhì)多序列比對結(jié)果可以看出，白樺與擬南芥、樟子松、茶樹芙蓉雷公藤棗番木瓜和草莓等的結(jié)構(gòu)域相同，同屬于ERF 亞家族，故而推測它們在功能上可能相似。

2.2 BpERF98基因的克隆及其植物載體構(gòu)建

以野生型白樺cDNA為模板，使用特異性載體基因引物pROKⅡ-ERF98-F 和pROKⅡ-ERF98-R，利用RT-PCR進行目的基因克隆擴增（見圖2）。利用和酶對pROKⅡ載體和PCR 產(chǎn)物進行雙酶切，再使用T連接酶將目的基因與載體相連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，選取陽性單克隆進行菌液PCR，測序并比對原始序列，結(jié)果符合一致即成功獲得帶有基因的表達載體。

圖1 多序列比對A.蛋白質(zhì)序列比對；B.蛋白質(zhì)進化樹（AtERF98：NM_113224.3；PsERF98：XM_023017227.1；CsERF98：XM_010513891.2；HmERF98：XM_039165326.1；TwERF98：XM_038864613.1；CpERF98：XM_022042754.1；FaERF98：XM_011459695.1；ZjERF98：XM_016035968.2）Fig.1 Multiple gene sequence alignmentA. Gene sequence alignment；B. ERF98 gene evolutionary tree（AtERF98：NM_113224.3；PsERF98：XM_023017227.1；CsERF98：XM_010513891.2；HmERF98：XM_039165326.1；TwERF98：XM_038864613.1；CpERF98：XM_022042754.1；FaERF98：XM_011459695.1；ZjERF98：XM_016035968.2）

圖2 BpERF98基因的克隆M.DNA Marker DL2000；1.水；2.目的基因BpERF98Fig.2 Cloning of the BpERF98 geneM.DNA Marker DL2000；1.Water；2.Vector containing BpERF98

2.3 白樺BpERF98基因遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

2.3.1 轉(zhuǎn)基因株系的獲得

用含有pROKⅡ-ERF98 載體的農(nóng)桿菌侵染野生型白樺葉片，共培養(yǎng)2 d 后進行脫菌，并放置在含有30 mg·L卡那霉素、200 mg·L頭孢霉素和200 mg·L特美汀的分化培養(yǎng)基上（WPM+0.8 mg·L，6-BA+0.02 mg·L，NAA+0.05 mg·L，GA+2%（w∕v）蔗糖，調(diào)節(jié)pH 至5.8～6.0）。培養(yǎng)25 d 左右可見傷口處長出愈傷組織，待長出不定芽后移栽至生根培養(yǎng)基中（1∕2 MS+0.02 mg·LNAA+2%（w∕v）蔗糖，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0），獲得轉(zhuǎn)基因株系。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

提取轉(zhuǎn)基因株系和野生型白樺苗的基因組DNA（天根生化科技有限公司），利用載體上游引物和下游目的基因引物進行PCR 檢測。使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳（選取轉(zhuǎn)基因株系L1、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L14和L15進行DNA檢測），結(jié)果顯示目的條帶與陽性對照位置一致（見圖3），證明基因成功轉(zhuǎn)入白樺基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系鑒定M.DNA Marker DL2000；1～13.BpERF98轉(zhuǎn)基因株系；14.陽性對照（質(zhì)粒）；15.野生型株系（WT）；16.陰性對照（水）Fig.3 Identification of transgenic strainsM.DNA Marker DL15000；1-13.BpERF98 transgenic strain；14.Positive control（plasmid）；15.Wild-type strain（WT）；16.Negative control（water）

2.4 轉(zhuǎn)基因植物的非生物脅迫分析

2.4.1 鹽脅迫生理指標的變化

在圖4 中，通過頂芽表型看出在第3 天野生型白樺邊緣出現(xiàn)損傷，在第5天時損傷擴大。轉(zhuǎn)基因株系并沒有出現(xiàn)葉片損傷。結(jié)果表明，隨著鹽脅迫時間的增加，野生型白樺受到的損害越來越大，轉(zhuǎn)基因株系隨著時間的推移抗逆物質(zhì)逐漸增多，提高了白樺對鹽脅迫的耐受能力。

圖4 鹽脅迫頂芽表型Fig.4 Terminal bud phenotype under salt stress

如圖5 所示，隨著鹽脅迫時間的加長，野生型白樺的相對電導率及MDA 含量明顯升高，在第五天時達到峰值。而與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系受到傷害程度較小，受傷害程度沒有明顯的起伏。轉(zhuǎn)基因株系在SOD與POD活性的增長趨勢較野生型白樺有大幅度提高，尤其轉(zhuǎn)基因4號株系在遭受鹽脅迫時酶的活性較高，在第5天時酶的活性達到最大值。

圖5 鹽脅迫生理指標A.相對電導率受損指標；B.丙二醛含量的積累；C.過氧化物酶活的含量；D.超氧化物歧化酶活性的含量Fig.5 Physiological indexes of salt stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

2.4.2 低溫脅迫生理指標的變化

低溫脅迫處理5 d 后，轉(zhuǎn)基因1 號株系由于產(chǎn)生了花青素而導致葉脈變紅，其他各株系頂芽表型沒有明顯變化（見圖6）。在第10 天野生型白樺和轉(zhuǎn)基因株系1號發(fā)生變黃和變紅，其它轉(zhuǎn)基因株系發(fā)生了主葉脈變紅。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生了更多的抗逆物質(zhì)，從而抵御了低溫脅迫使植株保持良好的生長狀態(tài)。

圖6 低溫脅迫頂芽表型Fig.6 Terminal bud phenotype under low temperature stress

在零上5 ℃的低溫脅迫下白樺苗均呈現(xiàn)不同程度的傷害。通過圖7 可以看出野生型株系的相對電導率和MDA 含量較轉(zhuǎn)基因株系高，并在第5天就有了明顯的增長趨勢，第10天尤其明顯，說明受損情況嚴重。轉(zhuǎn)基因株系在SOD和POD的活性增長情況比野生型白樺較快。第10天酶活性增長情況比第5 天酶活性增長程度大。轉(zhuǎn)基因株系4號和12號在酶的活性增長程度上較快。

圖7 低溫脅迫生理指標數(shù)據(jù)A.相對電導率受損指標；B.丙二醛含量的積累；C.過氧化物酶的活性含量；D.超氧化物歧化酶的活性含量Fig.7 Physiological index data of low temperature stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

2.4.3 凍害脅迫生理指標的變化

在恢復培養(yǎng)后1 d 觀察到野生型白樺苗頂芽邊緣受損，第一片小頂芽均發(fā)黑枯萎（見圖8），轉(zhuǎn)基因株系1號部分受損，其他轉(zhuǎn)基因株系葉片完好并沒有受到損傷。

圖8 凍害脅迫頂芽表型Fig.8 Terminal bud phenotype under freezing stress

通過模擬北方特有的倒春寒氣候發(fā)現(xiàn)，野生型白樺苗在-5 ℃時受到的損害較轉(zhuǎn)基因株系大。如圖9 所示，轉(zhuǎn)基因15 號株系的MDA 的含量與野生型和其他轉(zhuǎn)基因株系相比積累的較少，且轉(zhuǎn)基因株系的SOD與POD活性的增長情況均超過野生型白樺。其中，轉(zhuǎn)基因株系1 號POD 活性增加是其他類型的2倍左右，轉(zhuǎn)基因株系4號SOD 的活性增長較野生型白樺的增長情況更為顯著。

圖9 凍害脅迫生理指標數(shù)據(jù)A.相對電導率受損指標；B.丙二醛含量的積累；C.過氧化物酶的活性含量；D.超氧化物歧化酶的活性含量Fig.9 Physiological index data of freezing injury stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

3 討論

植物在受到脅迫刺激時，細胞內(nèi)會迅速積累相應的溶質(zhì)和保護劑，像滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括糖、氨基酸、脂肪酸等）及抗氧化酶（包括SOD、POD 和CAT 等）。一些分子通過增加細胞的水勢來幫助細胞重新建立滲透平衡，保護細胞在穩(wěn)定細胞器、蛋白質(zhì)和膜方面發(fā)揮關鍵作用。ERF 亞家族作為乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性結(jié)合基因組上游的AGCCGCC 元件（GCC-box）從而參與乙烯應答、抗病及非生物脅迫。據(jù)已報道的ERF 家族基因多數(shù)能夠響應低溫、干旱、鹽堿、病害和機械損傷并且能夠被脫落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）等內(nèi)源激素誘導而參與不同的信號調(diào)節(jié)途徑。植物激素信號在非生物脅迫響應發(fā)揮著關鍵作用，協(xié)調(diào)各種信號轉(zhuǎn)導途徑。在對環(huán)境脅迫的反應中，內(nèi)源性ABA水平迅速升高，進而激活特定的信號通路并改變基因表達。乙烯對植物在非生物脅迫條件下的適應和生存也起著至關重要的作用。乙烯響應因子通過擬南芥中抗壞血酸合成的轉(zhuǎn)錄激活增強對鹽的耐受性?？梢哉{(diào)控ERF 轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而在活性氧清除中發(fā)揮作用。EFE 是乙烯生成過程中非常重要的酶，已有大量的研究表明ERF 類轉(zhuǎn)錄因子在低溫等非生物脅迫下發(fā)揮重要的作用?；煵荩ǎ┗虻谋磉_，受低鉀、ABA 的強烈誘導，同時，也在轉(zhuǎn)錄水平上對PEG、高鹽、低溫及HO的脅迫有較為明顯的響應。煙草（）轉(zhuǎn)錄因子ERF 基因的過表達植株抗旱、耐高鹽與低溫能力較好，辣椒基因可能參與低溫脅迫應答。小黑楊（×）轉(zhuǎn)錄因子基因的過表達植株通過細胞的滲透調(diào)節(jié)能力提高耐鹽能力，葡萄（）轉(zhuǎn)錄因子和基因通過降低MDA 的含量降低膜脂過氧化的程度，増加SOD、POD 和CAT 的活性提高去除ROS的能力來實現(xiàn)提高過表達植株的耐低溫能力，柑橘屬佛手（L.var.）基因可通過阻止活性氧的過氧化，降低丙二醛等有毒物質(zhì)的積累發(fā)揮作用，使質(zhì)膜受到保護等。因此，本實驗中獲取了過表達ERF 類轉(zhuǎn)錄因子的白樺苗，通過觀察其頂芽形態(tài)及測量生理指標（相對電導率、MDA 含量、POD 和SOD 的活性），分析對比野生型白樺與轉(zhuǎn)基因型白樺在非生物脅迫處理下的差異。

植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，導致活性氧的積累?；钚匝醯奈：κ且l(fā)或加劇膜脂的過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡。丙二醛是植物器官在逆境條件下或衰老時發(fā)生膜脂過氧化作用而產(chǎn)生的一種有機化合物，它的產(chǎn)生加劇膜的損傷。因此，MDA 產(chǎn)生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱。同時，相對電導率也是衡量細胞膜受損情況的一個重要指標，逆境脅迫下細胞膜受損導致電解質(zhì)外滲增加，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響植物的抗逆能力。在本實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，無論是在鹽脅迫、低溫脅迫還是凍害脅迫中，轉(zhuǎn)基因型白樺植株的相對電導率及MDA 含量均低于野生型（圖5，7 和9）。這些代表細胞膜損傷程度的生理指標的相對降低表明ERF 基因的過表達對于保護白樺細胞膜具有積極作用，可以通過對細胞膜傷害的降低來增加抵御非生物脅迫的能力。此外，在鹽脅迫中，轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率及MDA 含量的增加顯著低于野生型植株（見圖5），這可能意味著ERF基因的過表達對于鹽脅迫下細胞膜的保護具有更重要的意義。

SOD 廣泛的存在于微生物、動物、植物和培養(yǎng)細胞中，SOD 不僅是超氧化物陰離子消除酶，也是HO主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有著重要作用。SOD 是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。POD 是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于載體的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫，氧化酚類和胺類化合物和烴類氧化產(chǎn)物，具有消除過氧化氫和酚類、醛類、胺類、苯類毒性的雙重作用。從本實驗的結(jié)果來看，在3 種非生物脅迫中，隨著脅迫時間的增加，過表達ERF 株系的POD、SOD 的活性均高于野生型植株。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因4號株系的SOD 的活性表現(xiàn)出了更高的優(yōu)勢（見圖5，7，9），表明轉(zhuǎn)基因4 號株系對于SOD 活性的調(diào)控可能更為重要。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建植物表達載體，獲得轉(zhuǎn)基因株系。進行了鹽脅迫、低溫和凍害脅迫的抗性實驗，轉(zhuǎn)基因株系在各個脅迫中表現(xiàn)都優(yōu)于野生型株系。轉(zhuǎn)基因株系中酶活性的快速增長為過表達ERF 基因的白樺維持了一個較低的受損情況，猜測其產(chǎn)生了大量抵御物質(zhì)保衛(wèi)白樺從而降低受損情況。推測基因改善了植物的耐鹽和抗寒性。如何通過調(diào)控白樺的抗逆機制還需進一步深入研究。