3種天然二萜的化感作用及機(jī)制的研究

郇兆蔚 歐巧明 丁 蘭*

（1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070）

化感作用是植物學(xué)、生態(tài)學(xué)、農(nóng)學(xué)、土壤學(xué)和園藝學(xué)的重要研究內(nèi)容，在耕作制度、防治雜草、緩解連作障礙等方面發(fā)揮重要作用。植物化感作用是釋放于生境中的植物次生代謝產(chǎn)物對其它植物生長發(fā)育所產(chǎn)生的影響。在自然生境中，植物化感作用可增強(qiáng)種間競爭能力，影響種間互作和改變?nèi)郝湮锓N分布格局；在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，化感作用有助于建立合理的作物輪作和間作系統(tǒng)，減少雜草種群密度，減輕化感自毒作用?；形镔|(zhì)可介導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)多種生理生化過程，包括植物蛋白質(zhì)和核酸合成與代謝、光合作用、水分和養(yǎng)分吸收、酶活性、抗氧化系統(tǒng)以及植物激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)等。近年來，隨著研究技術(shù)的發(fā)展以及各種研究平臺(tái)的出現(xiàn)，化感物質(zhì)對受體植物的作用機(jī)制已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

萜類是植物次生代謝產(chǎn)物中含量最豐富的一類，有4 萬余種，它們在植物組織中的功能多種多樣，例如，構(gòu)成膜組分，參與光合作用以及作為植物激素調(diào)控植物生長發(fā)育等；而次生代謝的萜類還通過揮發(fā)、淋溶、根系分泌以及殘?bào)w分解等途徑釋放到環(huán)境中形成化感效應(yīng)。由于從植物中獲取單體萜類的難度大，大多相關(guān)研究使用植物組織的粗提物。因此，僅有某些單萜和倍半萜的化感作用模式有較深入研究，二萜或三萜的化感機(jī)制還了解的很少。唇形科（Labiatae）香茶菜屬（）植物約有150 種，對映—貝殼杉烷二萜是該屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物，其在嫩枝葉中含量尤為豐富，隨枯枝落葉等途徑進(jìn)入自然生境后必然對其它植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，引起植物化感作用。近年來，有關(guān)該類二萜的化學(xué)生態(tài)方面的研究已受到了研究者的關(guān)注，它們影響植物生長發(fā)育的相關(guān)機(jī)制已有陸續(xù)報(bào)道。Oridonin、glaucocalyxin A、epinodosin、rabdosin B、leukamenin E、weisiensin B 和rabdosinate 等對映—貝殼杉烷二萜可以通過干擾植物細(xì)胞的不同生理生化過程，對受試植物的種子萌發(fā)，幼苗生長發(fā)育產(chǎn)生抑制效應(yīng)。例如，它們介導(dǎo)植物生長素極性引起生長素在根組織中的分布的改變，對擬南芥（）主根和側(cè)根發(fā)育產(chǎn)生抑制效應(yīng)，還參與調(diào)節(jié)不同種類磷脂酶（PLA，PLC，PLD）影響細(xì)胞膜系統(tǒng)以及阻滯根尖細(xì)胞有絲分裂和降低伸長區(qū)細(xì)胞長度而抑制其幼苗根的生長。Wangzaozin A、leukamenin E、和weisiensin B 是我們實(shí)驗(yàn)室從2 種香茶菜屬植物中分離提純的3 種對映—貝殼杉烷二萜，其獲得率為各植物中次生代謝產(chǎn)物最高，表明它們分別是上述2種香茶菜的主要次生代謝產(chǎn)物，評估它們的化感潛能以及研究它們的相關(guān)機(jī)制對于闡明其化學(xué)生態(tài)作用具有重要價(jià)值。之前我們報(bào)道了leukamenin E和weisiensin B通過影響擬南芥根組織的生長素極性運(yùn)輸干擾細(xì)胞的有絲分裂并抑制其幼苗主根和側(cè)根的生長。本文以經(jīng)典化感測試植物萵苣（L.雙子葉植物）和黑麥草（L.單子葉植物）為受試材料，繼續(xù)報(bào)道wangzaozin A、leukamenin E 和weisiensin B 對2 種受試植物幼苗的光合作用以及細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷作用及其種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制效應(yīng)，為評估3種二萜的化感作用潛能以及揭示其機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受試植物黑麥草（L.）和萵苣（L.）種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院饋贈(zèng)。3種對映—貝殼杉烷二萜wangzaozin A、leukamenin E和weisiensin B 分別由本實(shí)驗(yàn)室從甘肅產(chǎn)擬缺香茶菜（（Sun ex C. H. H u）C.Y.Wu et H.W.Li）和維西香茶菜（C.Y.Wu）中分離得到，采用波譜學(xué)方法對3種化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。上述3種二萜用助溶劑二甲基亞楓（Dimethyl sulphoxide，DMSO）配成100 mmol·L母液備用；實(shí)驗(yàn)時(shí)用無菌水稀釋成所需濃度，DMSO的終濃度小于0.25%，低于該濃度的DMSO 對黑麥草和萵苣種子萌發(fā)及幼苗生長均無顯著影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 受試植物培養(yǎng)和培養(yǎng)條件

黑麥草和萵苣種子用自來水清洗后，經(jīng)2%NaClO 消毒并用無菌水沖洗后，將大小均勻、籽粒飽滿的受試植物種子30 粒放置于玻璃培養(yǎng)杯中。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)培養(yǎng)杯中加入2 mL 含不同濃度的3 種受試二萜的水溶液（pH6.0），對照組加入等量無菌水。將培養(yǎng)杯置于黑暗條件萌發(fā)3 d 后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（23±2）℃，光周期12 h光照∕12 h黑暗，光照強(qiáng)度2 000 lx。每間隔2 d向培養(yǎng)杯中添加含有藥物的溶液或無菌水以補(bǔ)充揮發(fā)的藥液或無菌水。種子萌發(fā)過程中，每天記錄種子的萌發(fā)情況，以芽長超過種子長度的1∕2作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3 d 無萌發(fā)時(shí)作為最終萌發(fā)率。7 d 后檢測幼苗苗長、根長、植株組織鮮質(zhì)量（FW）及干質(zhì)量（DW）。同樣的處理方法培養(yǎng)受試植物種子，7 d 后檢測其葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、相對電導(dǎo)率（EL）以及相對含水量（RWC），每個(gè)處理重復(fù)3次。

實(shí)驗(yàn)中，3種二萜對受試植物黑麥草的處理濃度梯度為：0、5、10、25 μmol·L，對萵苣的處理濃度梯度為：0、2、4、8 μmol·L。

1.2.2 受試植物種子萌發(fā)率及幼苗生長指標(biāo)測定

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次，求平均值。

式中：G為第日的種子萌發(fā)數(shù)量；D為種子萌發(fā)試驗(yàn)第日。

苗長和根長：培養(yǎng)7 d 后從每個(gè)培養(yǎng)杯中隨機(jī)抽取10 株黑麥草和萵苣，測量其苗長和根長并計(jì)算其平均值。

組織鮮質(zhì)量（FW）和干質(zhì)量（DW）：剪取植物幼苗組織，稱出鮮質(zhì)量后，將幼苗組織在105 ℃烘箱中殺青30 min，轉(zhuǎn)至80 ℃烘干至恒重，稱出干質(zhì)量。

參 照Williamson 和Richardson的 方 法 計(jì) 算化感效應(yīng)指數(shù)（allelopathic response index，）：

式中：為對照值，為處理值，＞0 為促進(jìn)作用，＜0 為抑制作用，其絕對值的大小反映其化感作用的強(qiáng)弱。

1.2.3 葉片葉綠素含量的測定

參照高俊鳳的方法，略有改動(dòng)。每組稱取新鮮樣品0.2 g，剪碎后放入具塞帶刻度試管中。用20 mL 80%丙酮溶液浸提24 h（避光），其間搖動(dòng)3次，至葉肉組織已全部變白時(shí)表示葉綠素已浸提干凈。過濾后用80%的丙酮溶液定容至25 mL。將提取液倒入1 cm 比色杯中，以80%的丙酮作為空白對照，用紫外分光光度計(jì)分別在波長663、646 nm 處測定吸光度，按照下述公式分別計(jì)算葉綠素a、b和總?cè)~綠素的濃度。

式中：、、分別為葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的濃度；和分別為提取液在波長分別為663、646 nm 處的吸光值；為葉綠體色素的濃度，為提取液體積。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量的測定

采用硫代巴比妥酸法測定，略有改動(dòng)。稱取對照組和處理組的新鮮樣品0.2 g，加入10%三氯乙酸（TCA）2 mL，研磨成勻漿，4 000 r·min離心10 min，所得上清液為樣品提取液。取上清液1 mL（對照為蒸餾水1 mL），加入0.6%的TBA（硫代巴比妥酸）溶液1 mL，充分混勻后，在95 ℃沸水浴上煮沸15 min，迅速冷卻后再離心1 次；以對照調(diào)零，使用島津UV120-P 型紫外分光光度計(jì)分別在波長450、532和600 nm處測其吸光度值。

1.2.5 葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性的測定

用Walker 等的方法測量相對電導(dǎo)率（EL），略有改動(dòng)。每組稱取新鮮樣品0.5 g，用自來水沖洗后再用無菌水沖洗3次，用濾紙擦干水分，再加入10 mL 無菌水（盡量不讓葉片漂浮在表面），室溫25 ℃靜置2 h，使用DDS-12A型電導(dǎo)儀測定其電導(dǎo)率；再將待測樣品封口后，沸水浴加熱樣品30 min，冷卻至室溫后，再以上述方法測定樣品電導(dǎo)率。按照下述公式計(jì)算相對電導(dǎo)率，以表征質(zhì)膜相對透性。

1.2.6 相對含水量（RWC）的測定

稱取鮮質(zhì)量后迅速將幼苗組織浸入清水中數(shù)小時(shí)取出，擦拭干凈幼苗組織表面水分后稱重；再將幼苗組織浸入清水中1 h 取出，擦干稱重，直至與上次重量相等為止，即得幼苗組織飽和鮮質(zhì)量（SFW）。然后烘干，稱出組織干質(zhì)量。按照以下公式計(jì)算相對含水量：

式中：、、分別為幼苗組織的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、飽和鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Dunnett’s 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，＜0.05 為差異顯著，＜0.01為差異極顯著，并用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種二萜對黑麥草和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

用不同濃度的wangzaozin A、leukamenin E 和weisiensin B 處理黑麥草和萵苣種子，7 d 后統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率、幼苗根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量（見表1～2）。3 種二萜對黑麥草和萵苣種子萌發(fā)率的影響較小，主要表現(xiàn)為延遲種子萌發(fā)，但對其幼苗生長具有不同程度的抑制作用，其抑制作用隨著處理濃度的增大而增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。如表1 所示，在不同濃度的3 種二萜處理下，盡管黑麥草種子萌發(fā)率有下降趨勢，但與對照組比均無顯著差異，然而其種子萌發(fā)指數(shù)的下降與對照組相比卻有顯著或極顯著差異，表明3種二萜能延遲黑麥草種子的萌發(fā)。另外，不同濃度的3種二萜處理下，黑麥草幼苗根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量表現(xiàn)出明顯的抑制趨勢，與對照組相比，除了5 μmol·L鮮質(zhì)量處理組有顯著性差異（＜0.05）外，其余處理組均具有極顯著差異（＜0.01）。10～25 μmol·L的leukamenin E 對黑麥草的幼苗根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均具有明顯抑制作用，除5 μmol·L處理組外，其余處理組與對照組相比其抑制率均達(dá)到極顯著水平（＜0.01）。weisiensin B 處理組的結(jié)果與leukamenin E相類似，高濃度處理組的抑制率與對照組比顯示了極顯著差異，某些低濃度處理組差異不明顯。

表1 3種二萜對黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響Table 1 The effects of three diterpenes on the germination and seedling growth of L.perenne L.

3 種二萜對萵苣種子萌發(fā)的影響與對黑麥草的影響相似。如表2 所示，3 種二萜處理萵苣種子后其萌發(fā)率均具有濃度依賴性降低趨勢，但與對照組相比沒有顯著性差異，然而較高濃度處理組的萌發(fā)指數(shù)卻顯示了顯著性差異，該結(jié)果與黑麥草的結(jié)果相似，即3種二萜對萵苣種子萌發(fā)率的影響較小，但延遲種子萌發(fā)。與黑麥草的處理結(jié)果不同的是低濃度（2 μmol·L）的wangzaozin A 和leukamenin E 對萵苣幼苗的根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量值均顯示了促進(jìn)作用，某些處理組還顯示了顯著或極顯著差異（＜0.05 或＜0.01），而4～8 μmol·Lwangzaozin A 和leukamenin E 則對萵苣幼苗的根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量表現(xiàn)出濃度依賴性的抑制效應(yīng)，處理與對照間的差異達(dá)到顯著或極顯著水平。不同濃度weisiensin B對萵苣幼苗的根長、苗長、組織鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均具有較明顯的抑制作用，除了2 μmol·Lweisiensin B處理組的苗長沒有顯著性影響外，其余各處理組均顯示了顯著或極顯著差異。另外，未見weisiensin B在低濃度條件下有促進(jìn)效應(yīng)。

表2 3種二萜對萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長的影響Table 2 The effects of three diterpenes on the germination and seedling growth of Lacutuca sativa L.

化感效應(yīng)指數(shù)（）是衡量化感作用強(qiáng)度的重要指標(biāo)，正值表示促進(jìn)作用，負(fù)值表示抑制作用。由表3 可知，不同濃度的3 種二萜對受試植物的種子萌發(fā)及幼苗生長的化感效應(yīng)主要表現(xiàn)為抑制作用，在某些最低濃度處理組顯示了輕微的促進(jìn)效應(yīng)，該結(jié)果與表1～2的結(jié)果相一致。比較3種二萜對受試植物的種子萌發(fā)及幼苗生長的化感效應(yīng)指數(shù)，發(fā)現(xiàn)3種二萜對受試植物生長的抑制強(qiáng)弱順序?yàn)椋簑angzaozin A＞leukamenin E＞weisiensin B。

表3 3種二萜對黑麥草和萵苣的化感效應(yīng)指數(shù)Table 3 Allelopathic response index of three diterpenes on L.perenne L.and L.sativa L.

2.2 3種二萜對黑麥草和萵苣葉片葉綠素含量的影響

光合色素是植物光合作用的功能成分，其中葉綠素是光合色素中最重要的一類，其含量可受包括化感作用在內(nèi)的多種脅迫因子的影響。檢測葉綠素含量的變化對于評估上述二萜對植物生長的影響有重要意義。

如圖2所示，黑麥草幼苗葉片葉綠素含量隨二萜處理濃度的增大而降低。與對照相比，3種二萜處理組的總?cè)~綠素、葉綠素a的含量均有顯著降低（圖2：A～B），而葉綠素b 含量變化較小，僅在高濃度（25 μmol·L）處理組中達(dá)到差異極顯著水平（圖2C）。25 μmol·L的wangzaozin A、leukamenin E和weisiensin B 處理組的總?cè)~綠素含量分別降低45.6%、50.7%和41.1%；葉綠素a 含量分別降低44.6%、51.9%和40.0%。

圖1 3種對映—貝殼杉烷二萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of the three ent-kaurene diterpenes

圖2 3種二萜對黑麥草葉片總?cè)~綠素（A）、葉綠素a（B）和葉綠素b（C）含量的影響Fig.2 The effects of three diterpenes on the total chlorophyll（A），chlorophyll a（B）and chlorophyll b（C）content of L.perenne L.leaves

如圖3 所示，3 種二萜對萵苣幼苗葉片葉綠素含量也表現(xiàn)了抑制作用，但與黑麥草相比，其抑制效應(yīng)較輕。3種二萜在低濃度（2 μmol·L）條件下對萵苣幼苗葉片葉綠素含量的影響較小，與對照組相比無顯著性差異；較高濃度（4～8 μmol·L）處理組的抑制作用具有顯著或極顯著差異，其中8 μmol·L的wangzaozin A、leukamenin E 和weisiensin B處理組的總?cè)~綠素含量分別降低34.5%、26.9%和36.4%，葉綠素a 含量分別降低39.6%、20.2%和33.3%，其抑制率低于對黑麥草的抑制效應(yīng)。

圖3 3種二萜對萵苣葉片總?cè)~綠素（A）、葉綠素a（B）和葉綠素b（C）含量的影響Fig.3 The effects of three diterpenes on the total chlorophyll（A），chlorophyll a（B）and chlorophyll b（C）content of L.sativa L.leaves

2.3 3種二萜對黑麥草和萵苣MDA含量的影響

MDA 含量可以衡量細(xì)胞膜脂過氧化程度，MDA含量高，表明細(xì)胞膜脂過氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。如圖4 所示，不同濃度的3 種二萜處理黑麥草和萵苣幼苗后其MDA 含量顯示了不同程度的升高，其變化隨二萜濃度的升高呈遞增的趨勢。當(dāng)25 μmol·L的3 種二萜處理黑麥草幼苗后其葉片MDA 含量分別較對照增加了129.3%（wangzaozin A）、103.7%（leukamenin E）、99.4%（weisiensin B）（見圖4A）；當(dāng)8 μmol·L的3種二萜處理萵苣幼苗后其葉片MDA 含量分別較對照增加了74.0%（wangzaozin A）、13.9%（leukamenin E）、31.7%（weisiensin B）（見圖4B）。這說明3 種二萜導(dǎo)致了黑麥草和萵苣幼苗葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化作用，對細(xì)胞膜造成了傷害。

圖4 3 種二萜對黑麥草（A）和萵苣（B）幼苗葉片MDA 含量的影響Fig.4 The effects of three diterpenes on the MDA content of L. perenne L.（A）and L. sativa L.（B）seedling leaves

2.4 3種二萜對黑麥草和萵苣相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)胞膜的受傷害程度，植物在受到逆境傷害時(shí)，細(xì)胞膜脂和膜蛋白易受損傷而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（尤其是電解質(zhì)）大量外滲，從而引起相對電導(dǎo)率的增大。如圖5 所示，不同濃度的3 種二萜處理黑麥草和萵苣后其幼苗葉片的相對電導(dǎo)率顯示了不同程度的升高。高濃度（25 或8 μmol·L）的wangzaozin A、leukamenin E和weisiensin B使黑麥草幼苗葉片相對電導(dǎo)率分別較對照組增加了10.2%、20.4%和7.8%（圖5A），使萵苣幼苗葉片相對電導(dǎo)率較對照組分別增加了18.5%、19.6%和11.7%（圖5B），這說明較高濃度的3 種二萜均可使受試植物幼苗葉片細(xì)胞質(zhì)膜受到不同程度的傷害，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)外滲。

圖5 3種二萜對黑麥草（A）和萵苣（B）幼苗葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.5 The effects of three diterpenes on the relative electric conductivity of L. perenne L.（A）and L.sativa L.（B）seedling leaves

2.5 3種二萜對受試植物相對含水量的影響

水分是植物生存的先決條件，葉片含水量反映了植物賴以生存的水分狀況。當(dāng)植物體內(nèi)水分供應(yīng)不足、水分代謝會(huì)受到抑制。相對含水量可反映植物的保水和抗脫水能力，相對含水量越小說明水分虧缺越嚴(yán)重，最終會(huì)影響植物生長發(fā)育。如圖6 所示，3 種二萜處理黑麥草和萵苣后其幼苗葉片的相對含水量隨二萜濃度升高呈現(xiàn)不同程度的下降。當(dāng)25 μmol·L的wangzaozin A、leukamenin E 和weisiensin B 處理黑麥草后，其幼苗葉片相對含水量分別下降了15.3%、12.9%和10.4%（見圖6A）；而8 μmol·L的3 種二萜處理萵苣后，其幼苗葉片的相對含水量分別降低了17.4%、13.2%和6.0%（見圖6B）。上述結(jié)果表明，較高濃度的3 種二萜可通過影響黑麥草和萵苣幼苗的保水力，干擾植株的生理代謝。

圖6 3種二萜對黑麥草（A）和萵苣（B）幼苗葉片相對含水量的影響Fig.6 The effects of three diterpenes on the relative water content of L.perenne L.（A）and L.sativa L.（B）seedling leaves

3 討論

植物化感作用主要體現(xiàn)在對受體植物種子的萌發(fā)及其幼苗的生長發(fā)育等生命過程的影響。釋放于生境中的植物次生代謝產(chǎn)物可通過促進(jìn)或抑制其周圍植物的種子萌發(fā)或植株生長發(fā)育而產(chǎn)生化學(xué)生態(tài)效應(yīng)。天然的單萜因具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，可對較遠(yuǎn)距離的植物產(chǎn)生化感效應(yīng)，而非揮發(fā)性的倍半萜（某些倍半萜具有揮發(fā)性）、二萜或三萜通過根系分泌或枯枝落葉進(jìn)入土壤而影響周圍生境中植物的生長。研究顯示，萜類化合物的植物化感作用通常表現(xiàn)為兩種方式，低濃度促進(jìn)植物生長，高濃度抑制植物生長，即所謂的“低促高抑現(xiàn)象”，但大多數(shù)相關(guān)研究主要關(guān)注其生長抑制作用。Shao 等從外來入侵雜草薇甘菊（）中提取到3種倍半萜，它們對蘿卜（）、白三葉（L.）、黑麥草（）和萵苣的種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著的抑制效應(yīng)，顯示了很強(qiáng)的化感效應(yīng)。水稻根系所分泌的二萜momilactones 可干擾種子儲(chǔ)藏蛋白cruciferins 活性而對其生境中的競爭者稗草（）產(chǎn)生化感作用，抑制其生長。不同分子構(gòu)型的對映—貝殼杉烷二萜對擬南芥、萵苣等受試植物顯示了一致的生長抑制效應(yīng)，某些該類二萜還顯示了“低促高抑現(xiàn)象”，同時(shí)對植物細(xì)胞的生命過程顯示了多效應(yīng)現(xiàn)象。Oridonin 和glaucocalyxin A 通過調(diào)節(jié)磷脂酶活性介導(dǎo)擬南芥細(xì)胞膜的損傷；rabdosin B 誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 損傷導(dǎo)致萵苣幼苗根尖細(xì)胞周期阻滯；leukamenin E、weisiensin B和rabdosinate 干擾擬南芥根細(xì)胞生長素運(yùn)輸。在本研究中，不同濃度的wangzaozin A、weisiensin B 和leukamenin E 對經(jīng)典化感測試植物萵苣及黑麥草幼苗具有顯著的生長抑制效應(yīng)以及對細(xì)胞膜系統(tǒng)和光合作用系統(tǒng)的直接損傷作用。這些研究結(jié)果建議對映—貝殼杉烷二萜對受試植物細(xì)胞可能具有多靶標(biāo)作用，通過影響不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能或細(xì)胞的生理生化代謝，包括抑制萵苣及黑麥草種子萌發(fā)、幼苗根長苗長、幼苗鮮質(zhì)量干質(zhì)量，最終表現(xiàn)為對受試植物生長的干擾作用（見表1～3）。

細(xì)胞膜是半透膜，具有選擇透過性。膜脂過氧化的最終產(chǎn)物是MDA，其含量高低說明了細(xì)胞膜的損害程度。細(xì)胞膜受損使電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高，其升高程度反映了植物細(xì)胞受損程度。膜系統(tǒng)的損傷直接的后果便是膜通透性改變，它與植物組織相對含水量呈負(fù)相關(guān)。植物細(xì)胞膜功能損傷將降低對水分的吸收和營養(yǎng)的攝取，從而影響植物的正常生長發(fā)育。我們測試了不同濃度的3 種二萜處理黑麥草和萵苣后其相對電導(dǎo)率和MDA 含量變化，發(fā)現(xiàn)2 種植物幼苗葉片細(xì)胞的相對電導(dǎo)率和MDA 含量均有不同程度的升高，說明引起了膜脂過氧化作用并且細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞。該結(jié)果表明3 種二萜wangzaozin A、weisiensin B 和leukamenin E 導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加而使細(xì)胞保水性下降是其抑制2 種受試植物生長的重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，誘導(dǎo)生物膜損傷是許多其它化感物質(zhì)抑制靶植物生長的主要機(jī)制之一。腫柄菊（）葉片浸提液處理萵苣后發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞相對電導(dǎo)率值隨著浸提液處理濃度的增加而增加。高濃度的杜松（）凋落物水浸提液處理小麥和油松（）幼苗，引起MDA 含量增加，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和膜系統(tǒng)損傷。胡桃醌等化感物質(zhì)可使受試植物幼苗根部組織相對含水量明顯減小而抑制靶植物生長。植物化感作用中靶植物膜受損與一些非生物脅迫因子（水分、鹽和溫度等）對生物膜系統(tǒng)損傷方式相類似，它們之間的關(guān)聯(lián)性尚不清楚。

光合色素是綠色植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵組分，其中葉綠素是光合色素中最重要的一類色素，其含量的高低是反映植物光合能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，其含量可判斷植物的生長狀況。在植物次生代謝產(chǎn)物中，酚類是目前公認(rèn)的化感物質(zhì)，研究顯示，通過降低靶植物細(xì)胞葉綠素含量干擾其生長發(fā)育是酚類化感作用的效應(yīng)之一，也見于其它化感物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道。例如，從五爪金龍（）和薇甘菊分離得到的酚類物質(zhì)苯甲酸和肉桂酸使茼蒿（）植株體內(nèi)的葉綠素含量顯著下降。曼陀羅（）水浸提液也可顯著降低美洲蒺黎草（）和爪唾大豆（）2 種植物葉片的葉綠素含量。在本實(shí)驗(yàn)中，3 種二萜處理黑麥草和萵苣后其葉片細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量顯著降低（見圖2），這與其對受試植物的幼苗生長抑制作用相一致（見表1～2）。目前，關(guān)于化感物質(zhì)引起葉綠素減少的機(jī)制有不同的觀點(diǎn)：化感物質(zhì)引起相關(guān)酶的活性升高而增加了葉綠素降解；或抑制葉綠素生成相關(guān)酶活性或減少葉綠素合成中間產(chǎn)物；或引起氧化脅迫，大量氧自由基破壞了葉綠素分子結(jié)構(gòu)使其降解。

本研究中，3 種受試二萜均屬于C-20 位未氧化型對映—貝殼杉烷二萜，wangzaozin A 和leukamenin E 僅在C-3 位的取代基不同，而weisiensin B在C-1 和C-18 的取代基與前2 種二萜不同（見圖1）。從生長狀況數(shù)據(jù)看，wangzaozin A 的生長抑制活性稍高于leukamenin E 和weisiensin B（見表1～3）；但從葉綠素含量、電導(dǎo)率、MDA 含量以及保水量數(shù)據(jù)看，它們對細(xì)胞膜系統(tǒng)和光合作用系統(tǒng)的損傷作用差別不大（見圖2～6）。這也說明可能還存在其它作用靶點(diǎn)和機(jī)制。此外，3 種化合物對2種受試植物的化感效應(yīng)不同，對雙子葉的萵苣幼苗生長的抑制作用較單子葉的黑麥草更強(qiáng)烈，因?yàn)樵趯邴湶莸臏y試中3 種化合物的使用濃度比對萵苣的測試濃度高2.5～3.1 倍。該結(jié)果與報(bào)道的某些天然化合物選擇性地對雙子葉植物毒性更強(qiáng)相似，其機(jī)理尚不清楚。由于單子葉和雙子葉植物在根系形態(tài)、維管束結(jié)構(gòu)、葉脈分布等方面存在明顯差異，這使兩者對藥物的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有所不同。我們推測，這可能是萵苣和黑麥草響應(yīng)3種萜類所顯示的植物毒性差異的關(guān)鍵因素。如前所述，對映—貝殼杉烷二萜的化感作用具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，包括膜系統(tǒng)損傷，光合系統(tǒng)功能下降，氧化還原系統(tǒng)干擾，植物激素運(yùn)輸改變以及磷脂酶信號途徑激活等，這些作用效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性值得進(jìn)一步深入探討和研究。