楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2基因克隆及生物信息學(xué)分析

趙佳明 樊二勤，2 劉 軼 王 智 王軍輝 曲冠證

（1. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楸樹(shù)國(guó)家創(chuàng)新聯(lián)盟，北京 100091；3. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

開(kāi)花是由內(nèi)部遺傳因素和外界環(huán)境因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜生命過(guò)程，是植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)具備繁殖能力和遺傳能力的象征。在模式植物擬南芥（）中，有近百個(gè)開(kāi)花相關(guān)基因被鑒定出來(lái)，例如，，，，等。這些基因主要通過(guò)光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑等多種途徑發(fā)揮功能，同時(shí)與，，等開(kāi)花整合因子相互關(guān)聯(lián)共同調(diào)控植物開(kāi)花。目前開(kāi)花機(jī)制與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在擬南芥中研究較為深入，而在其他物種中研究較少，尤其是在木本植物中。

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）通常被理解為DNA序列沒(méi)有發(fā)生改變的情況下基因功能或細(xì)胞類型的可遺傳變化。介導(dǎo)表觀遺傳的分子機(jī)制通常有3 種形式，即DNA 甲基化（DNA methylation）、組蛋白翻譯后修飾（histone post-translational modifications，hPTM）和非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。通常不同類型以及不同位點(diǎn)的甲基化修飾具有不同的效應(yīng)，如H3K4me3、H3K36me3 和H3K79me3 與基因的轉(zhuǎn)錄激活和常染色質(zhì)有關(guān)，H3K27me3、H3K9me2∕me3多與基因沉默和異染色質(zhì)相關(guān)。組蛋白H3K4的甲基化是細(xì)胞修飾啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的1 種方法，組蛋白H3K4 的三甲基化（H3K4me3）主要聚集在轉(zhuǎn)錄活躍的啟動(dòng)子區(qū)，而一∕二甲基化（H3K4me1，H3K4me2）則主要集中在增強(qiáng)子區(qū)域。擬南芥同源基因（）是一種已知的花發(fā)育調(diào)節(jié)因子，它是一種H3K4組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間、細(xì)胞產(chǎn)量以及從根尖分生組織中的細(xì)胞增殖到細(xì)胞伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變來(lái)控制根的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因是根發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)生、構(gòu)型和形態(tài)發(fā)生所必需的。在維管植物中，厚壁組織細(xì)胞的次生壁增厚受到一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格控制。通過(guò)對(duì)擬南芥全基因組分析顯示，在莖發(fā)育過(guò)程中，參與次生壁形成的基因上調(diào)在很大程度上是通過(guò)增加H3K4三甲基化水平來(lái)調(diào)控的，在擬南芥H3K4me3 的所有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中，ATX1在花序莖發(fā)育過(guò)程中顯著增加，結(jié)果表明ATX1在擬南芥花序莖發(fā)育過(guò)程中對(duì)束間纖維次生壁生物合成的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。

β 族乙酰氨基葡萄糖（β-GlcNAc）對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是由O-GlcNAc 糖基轉(zhuǎn)移酶（OGlcNAc transferases，OGTs）催化完成，這種糖基化修飾參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種重要的生物學(xué)過(guò)程。O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶SEC（SECRET AGENT）的功能的缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥提前開(kāi)花表型，且突變體中開(kāi)花時(shí)間的負(fù)調(diào)節(jié)因子FLC 的轉(zhuǎn)錄受到抑制，同時(shí)FLC 染色質(zhì)區(qū)組蛋白H3K4me3 修飾水平顯著降低，表明植物體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶SEC 參與表觀遺傳介導(dǎo)的開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)過(guò)程。FLC 位點(diǎn)組蛋白的H3K3me3 修飾由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ATX1 催化完成，該研究發(fā)現(xiàn)SEC 可以直接催化ATX1使其獲得O-GlcNAc修飾，在體外及體內(nèi)條件下，SEC均表現(xiàn)出通過(guò)O-GlcNAc 修飾而激活A(yù)TX1 的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。而且，遺傳分析表明ATX1的功能依賴于SEC，所以表明擬南芥O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶SEC激活組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ATX 1 可以調(diào)節(jié)開(kāi)花。利用全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序、RNA-seq 和RTPCR 聯(lián)合分析表明，SDG25 和ATX1 的突變降低了組蛋白H3K4me3 的水平，增加了DNA 胞嘧啶甲基化，并抑制了擬南芥在逆境恢復(fù)過(guò)程中熱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，ChIP-qPCR 結(jié)果證實(shí)ATX1 與這些靶基因相關(guān)的染色質(zhì)結(jié)合，結(jié)果證明SDG25 和ATX1 是擬南芥耐熱脅迫所必需的。銅是生物體必需的微量元素，體內(nèi)銅平衡機(jī)制是蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，它將細(xì)胞內(nèi)的銅傳遞給靶蛋白，這一途徑是通過(guò)銅伴侶蛋白實(shí)現(xiàn)的。特定的蛋白質(zhì)，即所謂的銅伴侶，介導(dǎo)有害金屬的運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)ATX 參與銅向受體轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并發(fā)現(xiàn)ATX1家族的細(xì)胞質(zhì)伴侶蛋白和膜結(jié)合型ATPase 參與了銅的轉(zhuǎn)運(yùn)。

對(duì)高度保守重復(fù)基因的擬南芥和進(jìn)行了比較研究，揭示了部分冗余和功能分化的特征。盡管它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似、同源物高度相似但編碼的蛋白具有不同的生化功能以及調(diào)控序列。和很大程度上影響了互不重疊的基因集的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)只甲基化了一小部分核小體。即使在共同調(diào)節(jié)共享靶標(biāo)時(shí)和也可能采用不同的機(jī)制。兩種蛋白質(zhì)都使組蛋白H3K4甲基化，但當(dāng)將其三甲基化時(shí)，將其二甲基化。有研究報(bào)道了基因、三胸基因家族（Trithorax group genes）基因、多梳基因家族（polycomb group genes）基、以及ULTRAPETALA 1 基因在早期花發(fā)育過(guò)程中的相互作用，和在表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)方面具有拮抗作用。TrxG 蛋白家族作為最重要的表觀遺傳調(diào)控元件之一，參與依賴于染色質(zhì)修飾的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，TrxG 蛋白家族在生物進(jìn)化過(guò)程中極其保守，并且已經(jīng)被證實(shí)參與多類生物發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因的激活表達(dá)。在擬南芥TrxG家族中發(fā)現(xiàn)（）和（）功能缺失突變體對(duì)ABA 更加高敏，實(shí)驗(yàn)證明在ABA 誘導(dǎo)下，和結(jié)合非磷酸化的RNA 聚合酶II，通過(guò)H3K4me3 修飾激活的表達(dá)，從而參與ABA和干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程。

植物開(kāi)花是十分復(fù)雜的過(guò)程，作為植物重要的性狀之一，對(duì)于木本植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)境適應(yīng)性具有極其重要的意義，然而由于木本植物童期較長(zhǎng)，基因組復(fù)雜等，使得木本植物開(kāi)花分子機(jī)制的研究比較緩慢。楸樹(shù)（C.A.Mey.）隸屬紫葳科（Bignoniaceae）梓樹(shù)屬（）多年生木本植物，是我國(guó)特有的珍貴用材和具園林觀賞價(jià)值的古老樹(shù)種，多種植于皇家園林。楸樹(shù)童期時(shí)間較長(zhǎng)，種植五年以上開(kāi)花，花期為10～15 d。百日花楸樹(shù)是以優(yōu)良雜種無(wú)性系“洛楸4 號(hào)”和滇楸為親本雜交培育的新品種，種植當(dāng)年即可開(kāi)花，花期約為100 d。與普通楸樹(shù)相比，百日花楸樹(shù)的發(fā)現(xiàn)為研究楸樹(shù)開(kāi)花分子機(jī)制提供了十分寶貴的材料。通過(guò)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，基因在百日花楸與普通楸樹(shù)中表達(dá)具有顯著差異，對(duì)其進(jìn)行研究以期能夠進(jìn)一步闡述百日花楸樹(shù)開(kāi)花的性狀，為楸樹(shù)開(kāi)花機(jī)制的研究和楸樹(shù)的定向遺傳改良提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

以嫁接的一年生普通楸樹(shù)（）無(wú)性系9-1和突變株系—百日花楸樹(shù)為實(shí)驗(yàn)材料，樣品由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院本課題組提供，在河南省洛陽(yáng)市完成樣品采集。

DNA 膠回收試劑盒，大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技（Bioer）有限公司；大腸桿菌（）Trans1-T1 感 受 態(tài)，pEASY-T1 Clonging Vector 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（Trans-Gen Biotech）有限公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)（BioTeke）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PrimeScripRT reagent Kit，TB GreenPremix ExⅡ，酶，dNTP Mixture 等均購(gòu)自Ta-KaRa 公司（大連）；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純；所用引物合成、測(cè)序服務(wù)由擎科生物技術(shù)有限公司完成（哈爾濱）。

1.2 方法

1.2.1，和基因克隆

分別采集普通楸樹(shù)9-1 系和百日花楸樹(shù)處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、生殖生長(zhǎng)期的混合芽，放入無(wú)RNA酶凍存管中，用液氮快速冷凍后，儲(chǔ)存于超低溫冰箱中備用。參照百泰克生物公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取樣品的Total RNA，利用Nanodrop 2000C分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的純度和濃度，取0.5 μg RNA 為材料，利用PrimeScriptRT reagent Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)楸樹(shù)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期的發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行，和差 異 基 因 篩選，并根據(jù)未公布的楸樹(shù)基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)楸樹(shù)，和基因特異性引物，擴(kuò)增目的基因片段所用引物見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板2 μL，引物Forward 和Reverse 各1 μL、10×ExBuffer 2.5 μL、Ex0.25 μL、dNTP 2 μL，用ddHO 補(bǔ) 足至25 μL，反 應(yīng)條 件94 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 kB·min，40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃7 min；反應(yīng)結(jié)束后取25 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，選取條帶大小正確的進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物與pEASY-T 連接載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Trans1-T1），涂于LB 固體培養(yǎng)基（含50 mg·mL卡那霉素），37 ℃培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)挑取單克隆并進(jìn)行菌液PCR 檢測(cè)，將條帶位置正確的陽(yáng)性單克隆菌液送往哈爾濱擎科生物公司測(cè)序。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2，和基因生物信息學(xué)分析

利用BioEdit 軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利 用 在 線 軟 件（https：∕∕www.ebi.ac.uk∕interpro∕search∕sequence-search）進(jìn)行蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析；利 用 在 線 網(wǎng) 站（http：∕∕web.expasy.org∕protparam∕）進(jìn)行蛋白的理化性質(zhì)分析；利用在線網(wǎng)站（https：∕∕npsa-pra-bi. ibcp. fr∕cgi-bin∕npsa automat.plpage=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線網(wǎng)站（https：∕∕swissmodel.expasy.org∕interactive）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的功 能；利 用 在 線 網(wǎng) 站（http：∕∕web. Expasy. org∕protscale∕）進(jìn)行親∕疏水性進(jìn)行分析；利用在線網(wǎng)站（https：∕∕embnet. vital-it. ch∕cgi-bin∕tmpred_form_parser）進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)；利用在線網(wǎng)站（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕SignalP-3.0∕）進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析；利用在線網(wǎng)站（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕NetPhos）進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；利用在線網(wǎng)站（http：∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕plantcare∕html）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3，和基因在楸樹(shù)混合芽不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析

利用Instegrated DNA Technologies 在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)定量引物。參考TB GreenPremix ExⅡ熒光定量試劑盒反應(yīng)體系，以基因?yàn)閮?nèi)參基因，以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期的普通楸樹(shù)和百日花楸樹(shù)為樣品反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，重復(fù)3 次，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析 采 用2法，得到，和基因在普通楸樹(shù)和百日花楸樹(shù)中不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 基因CDS全長(zhǎng)克隆及其編碼的氨基酸序列分析

通過(guò)對(duì)處于不同發(fā)育時(shí)期的混合芽樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，我們從差異基因集中篩選得到差異顯著的關(guān)鍵基因家族。根據(jù)楸樹(shù)基因參考序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克隆得到了楸樹(shù)，和基因，條帶位置與預(yù)期相同（見(jiàn)圖1）。連接pEASY-T 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，菌液PCR 并送測(cè)序（見(jiàn)圖2）。測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致?；駽DS 全長(zhǎng)726 bp，編碼一個(gè)由241個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列；基因CDS全長(zhǎng)801 bp，編碼一個(gè)由266個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列；基因CDS全長(zhǎng)1 554 bp，編碼一個(gè)由517個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列（見(jiàn)圖3）。

圖1 CbuATX1、CbuATX1-like、CbuATX2基因PCR產(chǎn)物M.DNA marker DL5000；1.CbuATX1 基因的PCR 產(chǎn)物；2.CbuATX1-like 基因的PCR 產(chǎn)物；3.CbuATX2 基因的PCR 產(chǎn)物；4：ddH2O 作為陰性對(duì)照Fig.1 CbuATX1，CbuATX1-like，CbuATX2 gene PCR productsM.DNA marker DL5000；1.CbuATX1 Gene PCR products；2.CbuATX1-like Gene PCR products；3.CbuATX2 Gene PCR products；4：ddH2O as a negative control

圖2 大腸桿菌菌液PCR分析M.DNA marker DL5000；A.1～8，pEASY-ATX1菌液PCR檢測(cè)結(jié)果；B.pEASY-ATX1-like菌液PCR檢測(cè)結(jié)果；C.pEASY-ATX2菌液PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR analysis of Escherichia coliM.DNA marker DL5000；A.1-8，pEASY-ATX1 PCR results of bacterial liquid；B.pEASY-ATX1-like PCR results of bacterial liquid；C.pEASYATX2 PCR results of bacterial liquid

圖3 CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列A.CbuATX1基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列；B.CbuATX1-like基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列；C.CbuATX2基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.3 The cDNA sequence and amino acid sequence of CbuATX1，CbuATX1-like and CbuATX2 geneA.The cDNA sequence and amino acid sequence of CbuATX1 gene；B.The cDNA sequence and amino acid sequence of CbuATX1-like gene；C.The cDNA sequence and amino acid sequence of CbuATX2 gene

對(duì)楸樹(shù)基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（見(jiàn)表2），結(jié)果顯示：蛋白的氨基酸中共含有18 個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu），37 個(gè)帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），不穩(wěn)定系數(shù)為52.52，該值大于40，為不穩(wěn)定蛋白，蛋白疏水性平均值為-0.550，為親水性蛋白；蛋白的氨酸中共含有25 個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu），41個(gè)帶正電荷氨基酸殘基（Asp+Glu），不穩(wěn)定系數(shù)為59.46，為不穩(wěn)定蛋白，蛋白疏水性平均值為-0.627，為親水性蛋白；蛋白的氨基酸中共含有78個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu），78 個(gè)帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），不穩(wěn)定系數(shù)為41.71，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為78.43，蛋白疏水性平均值為-0.586，為親水性蛋白。

表2 蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical properties of protein

2.2 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

利用SOPMA 在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明：CbuATX1 和CbuATX1-like 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量中：無(wú)規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞α 螺旋＞β 轉(zhuǎn)角；CbuATX2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量中：無(wú)規(guī)則卷曲＞α 螺旋＞延伸鏈＞β轉(zhuǎn)角（見(jiàn)圖4）。因此可推斷，無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)荂buATX1 和CbuATX1-like 蛋白的主要組成成分，無(wú)規(guī)則卷曲和α 螺旋是CbuATX2 蛋白的主要組成成分。

圖4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析A.CbuATX1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析；B.CbuATX1-like蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析；C.CbuATX2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析Fig.4 Prediction and analysis of the secondary structure of proteinA.Prediction and analysis of the secondary structure of CbuATX1 protein；B.Prediction and analysis of the secondary structure of CbuATX1-like protein；C.Prediction and analysis of the secondary structure of CbuATX2 protein

蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行盤曲或折疊形成具有規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。利用在線軟件SWISS-MODEL 對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè) 分 析，獲 得 了CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，可知CbuATX1，CbuATX1-like 都以NBS-LRR class disease resistance protein 作為目標(biāo)建模，均含有2 個(gè)α 螺旋，4個(gè)β 折 疊，組 分 間 均 以β 轉(zhuǎn) 角（loop）相 連；CbuATX2 以Hepatoma-derived growth factor 作為 目標(biāo)建模，含有1 個(gè)α 螺旋，4 個(gè)β 折疊，組分間以β轉(zhuǎn)角（loop）相連；這3 種蛋白未形成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。

圖5 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A.CbuATX1 編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；B.CbuATX1-like 編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；C.CbuATX2編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Prediction of protein structureA.CbuATX1 coding protein tertiary structure；B.CbuATX1-like coding protein tertiary structure；C.CbuATX2 coding protein tertiary structure

2.3 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI 的Conserved Domain Search（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Structure∕cdd∕wrpsb.cgi）在線軟件，對(duì)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析，結(jié)果顯示：CbuATX1 和CbuATX1-like 蛋白有1 個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域，相同基序是LRVSLHC，KMRKHISRMEGVTSFNID，KKVTLTG 和VLSSIS。具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，均屬于Heavy-metal-associated domain（HMA）superfamily，HMA 結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)半胱氨酸殘基，它們?cè)阢~、鎘、鈷和鋅等金屬離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)移中起重要作用。CbuATX2 蛋白有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于Pro-Trp-Trp-Pro（PWWP）superfamily，該結(jié)構(gòu)域與賴氨酸、H4K20me 上甲基化的組蛋白結(jié)合，揭示它是甲基賴氨酸識(shí)別基序；也包含F(xiàn)∕Y-rich N-terminus（FYRN），它通常類似于trithorax∕ALL1 family proteins。

表3 蛋白二/三級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 3 Protein secondary/tertiary structure composition

2.4 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已測(cè)序的楸樹(shù)基因組序列，選取基因上游1 500 bp 序列作為啟動(dòng)子序列，利用P1antCare 在線網(wǎng)站對(duì)楸樹(shù)，和啟動(dòng)子順式調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（見(jiàn)表4～6）。結(jié)果表明，基因啟動(dòng)子含有多個(gè)真核生物啟動(dòng)子的基本元件，如CAAT-box和TATA-box 等，還含有與光響應(yīng)作用元件、生長(zhǎng)發(fā)育作用元件（玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件、分生組織誘導(dǎo)）、激素誘導(dǎo)元件（脫落酸誘導(dǎo)、赤霉素誘導(dǎo)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件）、脅迫元件（低溫誘導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件），此外還包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)常見(jiàn)的順式作用元件等，說(shuō)明基因很可能與光響應(yīng)密切相關(guān)并參與外界環(huán)境脅迫響應(yīng)等過(guò)程。

表4 CbuATX1基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 4 Analysis of homeostasis elements in CbuATX1 gene promoter

表5 CbuATX1-like基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 5 Analysis of homeostasis elements in CbuATX1-like gene promoter

表6 CbuATX2基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 6 Analysis of homeostasis elements in CbuATX2 gene promoter

2.5 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2氨基酸同源性分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的blastp 程序，以楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 氨基酸序列為檢索對(duì)象，對(duì)不同物種進(jìn)行比對(duì)，篩選得到與這3 個(gè)氨基酸序列同源性較高且具有代表性物種的同源序列，利用BioEdit 軟件中的ClustalW 工具對(duì)上述不同物種的同源序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CbuATX1和CbuATX1-like蛋白在不同物種中具有高度保守性，與芝麻（）相似性較高，CbuATX1 和CbuATX1-like 蛋白與其他物種相同的基序有QVV，LRVSL，RKH，MEGVTSFNI，KKV 等（見(jiàn)圖6A）。CbuATX2 蛋白的同源序列較少，只檢索到與其他屬的馬尾草（）和擬南芥（）相似性較高，CbuATX2 蛋白與其他物種相同基序有KLGVD，QCKVYW，WPLDA，QFFGTHDFAR，SFLKGLL，EEAKMYL等（見(jiàn)圖6B）。

圖6 CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2與其它物種同源氨基酸序列比對(duì)A.CbuATX1 and CbuATX1-like與其它物種同源氨基酸序列比對(duì)；B.CbuATX2與其它物種同源氨基酸序列比對(duì)Fig.6 CbuATX1，CbuATX1-like and CbuATX2 amino acid sequence alignment with other speciesA.CbuATX1 and CbuATX1-like amino acid sequence alignment with other species；B.CbuATX2 amino acid sequence alignment with other species

2.6 CbuATX基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，和同源基因，利用生物學(xué)軟件MEGA7.0 對(duì) 楸 樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，采用遺傳距離建樹(shù)法的相鄰連接法，并進(jìn)行1000 次的Bootstrap 校正。結(jié)果顯示，CbuATX1 與芝麻（）、甜菜（），CbuATX1-like 與胡蘿卜（）、歐洲橄欖（）、三葉通菜（），CbuATX2 與馬尾草（）的同源序列處于同一個(gè)進(jìn)化分支上，表明它們的親緣關(guān)系最近（見(jiàn)圖7）。

圖7 CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2與其它物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析A.CbuATX1 and CbuATX1-like與其它物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；B.CbuATX2與其它物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 CbuATX1，CbuATX1-like and CbuATX2 Phylogenetic tree analysis of proteins homologous to other speciesA.CbuATX1 and CbuATX1-like Phylogenetic tree analysis of proteins homologous to other species；B.CbuATX2 Phylogenetic tree analysis of proteins homologous to other species

2.7 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like和CbuATX2功能預(yù)測(cè)

為 了 研 究 楸 樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2 蛋白的功能，分別利用ProtScale 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白疏水性；利用TMpred 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP-3.0 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；利用NetPhos 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示：

CbuATX1蛋白其多肽鏈中疏水性最強(qiáng)的在16區(qū)域，高達(dá)1.844，疏水性最小的在70 區(qū)域，低至-3.533，與理化性質(zhì)分析的基本一致，推測(cè)是一種親水性蛋白；CbuATX1 蛋白從內(nèi)到外共有1 個(gè)跨膜區(qū)域在6～24 aa，推測(cè)是一種跨膜蛋白；CbuATX1 蛋白信號(hào)肽S 值在1～15 位氨基酸之間，其中最大值在第7個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)值是0.532，平均分值為0.280（小于閾值0.5），說(shuō)明該蛋白不含有信號(hào)肽，推測(cè)可能是一種非分泌性蛋白；CbuATX1蛋白磷酸化位點(diǎn)有41個(gè)，包括Ser（絲氯酸）30個(gè)、Thr（蘇氨酸）10個(gè)、Tyr（酪氨酸）1個(gè)，蛋白磷酸化位點(diǎn)上不存在特定修飾激酶，說(shuō)明氨基酸序列上的磷酸化位點(diǎn)含有多種修飾類型。

CbuATX1-like 蛋白其多肽鏈中疏水性最強(qiáng)的在232 區(qū)域，高達(dá)1.344，疏水性最小的在112 區(qū)域，低至-3.522 與理化性質(zhì)分析的基本一致，推測(cè)是一種親水性蛋白；CbuATX1-like 蛋白從內(nèi)到外共有1 個(gè)跨膜區(qū)域在2～18 aa，從外到內(nèi)有1 個(gè)跨膜區(qū)域，在1～18 aa，可能是一種跨膜蛋白；CbuATX1-like 蛋白信號(hào)肽S 值在1～15 位氨基酸之間，其中最大值在第14個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)值是0.290，平均分值為0.173（小于閾值0.5），說(shuō)明該蛋白不含有信號(hào)肽，推測(cè)可能是一種非分泌性蛋白；CbuATX1-like 蛋白磷酸化位點(diǎn)有60 個(gè)，包括Ser（絲氯酸）46 個(gè)、Thr（蘇氨酸）8 個(gè)、Tyr（酪氨酸）6個(gè)，蛋白磷酸化位點(diǎn)上不存在特定修飾激酶，說(shuō)明氨基酸序列上的磷酸化位點(diǎn)含有多種修飾類型。

CbuATX2 蛋白其多肽鏈中疏水性最強(qiáng)的在384 區(qū)域，高達(dá)1.978，疏水性最小的在99 區(qū)域，低至-3.778，與理化性質(zhì)分析的基本一致，推測(cè)是一種親水性蛋白；CbuATX2蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，可能是一個(gè)與非參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)；CbuATX2蛋白信號(hào)肽S值在1～4位氨基酸之間，其中最大值在第1個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)值是0.311，平均分值為0.145（小于閾值0.5），說(shuō)明該蛋白不含有信號(hào)肽，推測(cè)可能是一種非分泌性蛋白；CbuATX2蛋白磷酸化位點(diǎn)有44 個(gè)，包括Ser（絲氯酸）35 個(gè)、Thr（蘇氨酸）8 個(gè)、Tyr（酪氨酸）1 個(gè)，蛋白磷酸化位點(diǎn)上不存在特定修飾激酶，說(shuō)明氨基酸序列上的磷酸化位點(diǎn)含有多種修飾類型。

2.8 楸樹(shù)CbuATX1，CbuATX1-like 和CbuATX2基因不同發(fā)育時(shí)期樣品中的表達(dá)量分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)，和基因在不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)基因在CK（普通楸樹(shù)）、EF（百日花楸樹(shù)）中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)中的相對(duì)表達(dá)量與表達(dá)趨勢(shì)存在差異。如圖8A 所示，基因在普通楸樹(shù)和百日花楸樹(shù)中均呈現(xiàn)出從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變到生殖生長(zhǎng)期基因相對(duì)表達(dá)量下降的趨勢(shì)。在百日花楸樹(shù)中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，與普通楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期中相差9.3 倍，差異極顯著；與百日花楸樹(shù)生殖生長(zhǎng)期相差5.8 倍，差異顯著。在百日花楸樹(shù)中生殖生長(zhǎng)期表達(dá)量也要高于普通楸樹(shù)生殖生長(zhǎng)期，是其1.8 倍。如圖8C 所示，基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與相同。但在百日花楸樹(shù)中生殖生長(zhǎng)期表達(dá)量要低于普通楸樹(shù)生殖生長(zhǎng)期，相差15%。

如圖8B 所示，基因在普通楸樹(shù)與百日花楸樹(shù)中，其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)期的相對(duì)表達(dá)量呈相反趨勢(shì)。在普通楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)期時(shí)，基因表達(dá)量上調(diào)為2倍；而在百日花楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)期時(shí)基因表達(dá)量下調(diào)，但差異不大，僅為1 倍。綜合以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，和3 個(gè)基因與普通楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期相比，在百日花楸樹(shù)的樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期相表達(dá)量均上調(diào)，這暗示著基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表達(dá)的差異，很可能是造成楸樹(shù)花期產(chǎn)生變化的重要原因之一。

圖8 不同時(shí)期不同品種A.CbuATX1 基因相對(duì)表達(dá)量；B.CbuATX1-like 基因相對(duì)表達(dá)量；C.CbuATX2 基因相對(duì)表達(dá)量；CK-V.普通楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期；CK-R.普通楸樹(shù)生殖生長(zhǎng)期；EF-V.百日花楸樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期；EF-R.百日花楸樹(shù)生殖生長(zhǎng)期，方差顯著性分析；P＞0.05表示差異不顯著；0.01＜P＜0.05 表示差異性顯著；P＜0.01 表示差異極顯著；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001Fig.8 Different species in different periodsA.Relative expression of CbuATX1 gene；B.Relative expression of CbuATX1-like gene；C.Relative expression of CbuATX2 gene；CK-V.Vegetative growth period of C.bungei；CK-R.Reproductive growth period of C. bungei；EF-V.Vegetative growth period of bairihua；EF-R.Reproductive growth period of bairihua；**P＜0.01，**P＜0.001 analysis of variance significance；P＞0.05 means no significant difference；0.01＜P＜0.05 indicates significant difference；P＜0.01 indicates extremely significant difference；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

3 討論

通過(guò)對(duì)處于不同發(fā)育時(shí)期的花芽樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，我們從差異基因集中篩選得到差異顯著的關(guān)鍵基因家族，通過(guò)熒光定量PCR篩選出3 個(gè)差異基因，和，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為探究百日花楸樹(shù)開(kāi)花周期奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)，和基因的理化性質(zhì)、同源性、啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼一個(gè)由241個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列，不存在信號(hào)肽，等電點(diǎn)為9.96，為堿性蛋白，可能具有一定的抗菌性，與芝麻、甜菜親緣關(guān)系較近。編碼一個(gè)由266個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列，不存在信號(hào)肽，等電點(diǎn)為9.80，為堿性蛋白，可能具有一定的抗菌性，與胡蘿卜、歐洲橄欖親緣關(guān)系較近。編碼一個(gè)由517 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列，不存在信號(hào)肽，等電點(diǎn)為7.21，為堿性蛋白，可能具有一定的抗菌性，與馬尾草親緣關(guān)系較近。這3 個(gè)基因含有與光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)所必需的順式調(diào)節(jié)元件等，說(shuō)明基因很有可能與光響應(yīng)密切相關(guān)并參與外界環(huán)境脅迫響應(yīng)等過(guò)程。擬南芥Trithorax 1 同源基因是與根發(fā)育相關(guān)，而且動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)擬南芥花序莖纖維次生細(xì)胞壁的生物合成的功能。本研究發(fā)現(xiàn)與基因相似度較高，但是否具有相同的功能還需要進(jìn)一步探索。在真核生物中，PcG 和TrxG 在表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)方面具有拮抗作用，TrxG 蛋白在擬南芥中抵消了PcG 介導(dǎo)的花抑制，但對(duì)其在其他發(fā)育過(guò)程中的作用知之甚少，有研究報(bào)道了基因、基因和基因以及基因（）在早期花發(fā)育過(guò)程中的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因的突變未能挽救突變體的早花表型，而、和基因幼苗表現(xiàn)出一種新的根膨大表型。開(kāi)花是相對(duì)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程，它利用許多信號(hào)通路完成，并且這些信號(hào)通路有幾乎相同的下游基因，這些基因通過(guò)上游信號(hào)啟動(dòng)開(kāi)花調(diào)控。目前比較常見(jiàn)的開(kāi)花整合因子 主 要 有，和，究 竟，-和這3 個(gè)基因與哪個(gè)開(kāi)花通路相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。這3個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)具有一定的差異，和這兩個(gè)基因具有相同的表達(dá)趨勢(shì)，無(wú)論在普通楸樹(shù)還是百日花楸樹(shù)中從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期到生殖生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)變都呈下降趨勢(shì)，且與表達(dá)趨勢(shì)相反，與基因相似度高，表達(dá)趨勢(shì)卻相反，3 個(gè)基因間是否存在協(xié)同與抑制還需要進(jìn)一步的研究探討。