核桃JrNPR1基因的克隆與抗病響應(yīng)潛力

馬凱恒 何佳凝 謝牧洪 任 斌 黃倩雪 楊桂燕*

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院陜西省經(jīng)濟植物資源開發(fā)利用重點實驗室，楊凌 712100）

植物抗病基因在識別病原菌和抗病信號傳導(dǎo)的病害防御過程中起重要作用。近年，利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、定位克隆和抗病基因同源序列法等從植物中克隆到大量的抗病基因。這些基因的克隆、鑒定和功能分析對于深入研究植物抗病機制、通過基因工程提高植物抗病性具有十分重要的意義。（nonexpressor of pathogenesis-related genes 1）基因是植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要調(diào)控因子，是植物水楊酸（Salicylic acid，SA）信號通路的重要組成部分，參與了SA 與茉莉酸（Jasmonic acid，JA）∕乙烯（Ethylene，ET）信號途徑的相互作用；因此是植物響應(yīng)病原菌侵染的核心因子。典型的基因含有BTB和ANK-r結(jié)構(gòu)域，這與NPR1 同其他轉(zhuǎn)錄因子互作密切相關(guān)。如，與bZIP 轉(zhuǎn)錄因子中的TGA 家族之間的互作，通過BTB 結(jié)構(gòu)域與TGA2 的抑制區(qū)結(jié)合使TGA2 抑制病程相關(guān)基因（Pathogenesis-related gene，PR）表達的功能缺失。目前，很多植物中的基因被陸續(xù)克隆，并對其功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)來自不同植物的同源基因或相同植株的不同基因，其功能具有一定差異。如，煙草（）具有對SA 敏感的反式激活結(jié)構(gòu)域，在水稻（）中過表達基因會自發(fā)激活防御基因的表達，在水稻和草莓（）中防御反應(yīng)的激活可能會對植物生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響，影響作物生產(chǎn)相關(guān)的重要過程，但在擬南芥（）和許多其它植物中不存在這種現(xiàn)象。在大量植物中，過表達及其同源基因被證實能夠增強植物的抗病性，說明了1在抗病中的保守作用?？梢姡瑢ξ幢粓蟮赖幕蜻M行研究，一方面可以探究基因應(yīng)對植株病害的功能，另一方面又可能挖掘基因的新功能。

核桃（）屬胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（）多年生落葉喬木，享有“世界四大堅果”之一的美譽，也是我國主要經(jīng)濟樹種之一。隨著核桃栽培面積不斷擴大，核桃產(chǎn)業(yè)鏈逐漸延長，為區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展做出了重要貢獻。但近年，核桃病蟲害問題日益突出，對核桃生長及產(chǎn)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的制約，尤其是核桃炭疽病、枝枯病和黑斑病對核桃植株的危害較大，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致絕收，甚至樹木死亡。當(dāng)前，防治核桃此類病害主要依靠噴灑化學(xué)殺菌劑?；瘜W(xué)農(nóng)藥存在殘留問題，對食品安全、環(huán)境保護等都會造成不良影響，這急切需要掌握核桃的病害調(diào)控機制，進而為尋求高效安全的病害防治措施提供依據(jù)。因此，本研究從核桃中鑒定獲得1條基因（命名），通過基本生物信息及病害響應(yīng)表達分析其生物學(xué)功能，為揭示核桃抗病響應(yīng)機制提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

植物材料：2年生‘香玲’核桃嫁接苗。

病原：①膠孢炭疽菌（）（簡寫為CgTJ）：引起核桃炭疽病的病原菌。②矩圓黑盤孢菌（）（簡寫為MoZK）：引起核桃枝枯病的病原菌。③黃單胞菌（）（簡寫為XcHB）：引起核桃細菌性黑斑病的病原菌。

處理：分別制備濃度為1×10個·L的膠孢炭疽 菌 分 生 孢 子 菌 液，配 置100 μmol·L水 楊 酸（SA）溶液。對植株分別進行SA、CgTJ、CgTJ+SA、MoZK、MoZK+SA、XcHB、XcHB+SA 噴灑處理。以噴水處理為對照。在處理后第0、1、6、9、12 d 等時間分別取葉和莖，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。每個處理包含6棵植株。

1.2 JrNPR1基因的克隆與分析

以“nonexpressor of pathogenesis related genes 1”為關(guān)鍵詞在‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組中篩選基因，通過BLAST 分析對比后，選擇其中1 條基因（命名為）進行后續(xù)分析。用ORF finder（http：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gorf∕gorf.Html）確 定基因開放讀碼框（ORF），通過ExPASy（http：∕∕web.expasy.org∕protparam∕）分 析基因的序列特征。采用CD-Search（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Structure∕cdd∕wrpsb.cgi）對的保守結(jié)構(gòu)域進行分析。利用BLASTP（http：∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast）對同源性蛋白序列進行搜索。利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用NEW PLACE（https：∕∕www.dna.affrc.go.jp∕PLACE∕）分析啟動子順式作用元件。

1.3 JrNPR1基因的表達分析

樣品總RNA 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取。RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA 使用Prime-ScriptRT Reagent Kit（CWBIO，康為世紀(jì)，中國）試劑盒進行。cDNA 稀釋10 倍用作實時熒光定量PCR（qRT-PCR）模板。qRT-PCR 反應(yīng)體系參照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）制備。定量反應(yīng)儀器為Step OneReal-Time PCR System（Applied Biosystems 生產(chǎn)）。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性12 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，45個循環(huán)；81 ℃讀板1 s，重復(fù)3次?；蚨恳餅椋?′-CCGATGTATGTTGGCTGT-3′∕5′-GGTCTACATGCATCATGG-3′。 內(nèi)參基因為18S rRNA（HE574850）基因，引物為：5′-GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT-3′∕5′-TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3′。相對表達結(jié)果用2法進行分析。數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件包（SPSS，Chicago，Illinois，USA）處理。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不同時間點與0 d 之間的表達差異用檢驗分析（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrNPR1全長cDNA序列基本信息

通過查找核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得1 條基因，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因ORF 長1 782 bp（GeneBank登錄號：MW202261），擬推導(dǎo)的蛋白含有593 個氨基酸（見圖1），理論等電點為6.40。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)含有NPR1-like-C 結(jié)構(gòu)域（見圖1），多序列比對發(fā)現(xiàn)該蛋白與其它物種的NPR1 蛋白相似性很高（見圖2），表明屬于NPR1-like基因家族成員。構(gòu)建進化樹分析發(fā)現(xiàn)JrNPR1 蛋白與楊梅（）、歐洲栓皮櫟（）以及加州白櫟（）等的進化關(guān)系較近（見圖3）。

圖1 JrNPR1蛋白的NPR結(jié)構(gòu)域分布Fig.1 The NPR domain distribution of JrNPR1 protein

圖2 JrNPR1蛋白與其同源蛋白的NPR結(jié)構(gòu)域比對Jr.核桃；Mr.楊梅；Rc.蓖麻；Pd.美洲黑楊；Ss.密花豆Fig.2 Multiple sequence alignment of NPR domains from JrNPR1 and its homologous proteinsJr.Juglans regia；Mr.Morella rubra；Rc.Ricinus communis；Pd.Populus deltoids；Ss.Spatholobus suberectus

圖3 JrNPR1蛋白的進化分析Jr.核桃；Mr.楊梅；Rc.蓖麻；Pd.美洲黑楊；Ss.密花豆；Ql.加州白櫟；Qs.歐洲栓皮櫟；Cc.木豆；Ap.非洲相思子；Pe.胡楊；Pa.銀白楊；Pt.毛果楊Fig.3 Phylogenetic tree analysis of JrNPR1 proteinJr.Juglans regia；Mr.Morella rubra；Rc.Ricinus communis；Pd.Populus deltoids；Ss.Spatholobus suberectus；Ql.Quercus lobata；Qs.Quercus suber；Cc.Cajanus cajan；Ap.Abrus precatorius；Pe.Populus euphratica；Pa.Populus alba；Pt.Populus trichocarpa

2.2 JrNPR1啟動子元件特征

經(jīng)BLASTX 比對發(fā)現(xiàn)與GeneBank 中的XP_018838913.1 序列一致，以此鑒定其上游1 233 bp 的DNA 序列設(shè)計引物，以‘香玲’核桃DNA 為模板擴增獲得該基因啟動子序列進行生物信息學(xué)分析，NEW PLACE 預(yù)測顯示，啟動子中含有多種與抗病性相關(guān)順式作用元件，如WRKY 轉(zhuǎn)錄因子識別的WRKY71OS 元件，RAV1轉(zhuǎn)錄因子識別的RAV1AAT元件，組織特異表達的CAATBOX1 元件（見表1）。推測其具有調(diào)控參與抗病的能力。

表1 JrNPR1啟動子正向包含的主要順式作用元件Table 1 The cis-acting elements contained in JrNPR1 promoter

2.3 JrNPR1基因響應(yīng)不同病害的表達

對試材分別進行SA、CgTJ、CgTJ+SA、MoZK、MoZK+SA、XcHB、XcHB+SA 等處理，分析處理后第0、1、6、9、12 d 時葉和莖中基因的表達（見圖4～5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉中炭疽病脅迫下，脅迫1 d 時的表達達到最大值，為對照的9.96 倍，之后的表達逐漸降低，與SA 處理下的變化趨勢一致。在進行CgTJ+SA處理后，基因隨脅迫后時間延長的變化趨勢與單獨進行SA和CgTJ處理的變化趨勢一致，但其表達水平高于單一處理下的表達，在0～12 d，分別為單一SA和CgTJ 處 理 下 的1.15～3.78、1.31～7.66 倍。在MoZK、MoZK+SA 脅迫下，基因的表達變化與SA、CgTJ、CgTJ+SA 相似，在1 d 的表達值最大，分別為對照的7.00、12.41 倍。XcHB、XcHB+SA 處理下的表達最大值出現(xiàn)在6 d，為對照的7.91、17.86 倍。在SA 存在情況下，基因響應(yīng)XcHB 表 達 是 單 獨XcHB 處 理 的2.21～178.89 倍（見圖4）。

圖4 不同處理下JrNPR1基因在葉中的表達*表示相同處理下不同時間點與0 d之間的差異顯著（P＜0.05），下同F(xiàn)ig.4 The expression of JrNPR1 gene in leaf under different treatments*Indicates that the difference between different time points and 0 d under the same treatment is significant（P＜0.05），the same as below

在莖中，基因在SA、CgTJ、CgTJ+SA、XcHB、XcHB+SA 處理下隨時間的變化趨勢相似，都是在6 d 達到最大值，分別為對照的12.06、13.62、20.19、8.10、17.06 倍。在MoZK、MoZK+SA處理下的最大表達值在9 d，分別為對照的9.40、12.41 倍。SA 存在情況下，基因響應(yīng)CgTJ、MoZK、XcHB 的轉(zhuǎn)錄水平均高于對應(yīng)的單獨處理下的表達，即，CgTJ+SA、MoZK+SA、XcHB+SA處理下的表達分別為CgTJ、MoZK、XcHB 處理下轉(zhuǎn)錄水平的1.67～12.70、1.32～2.07、1.53～3.59倍（見圖5）。

圖5 不同處理下JrNPR1基因在莖中的表達Fig.5 The expression of JrNPR1 gene in stem under different treatments

3 討論

核桃作為我國廣大山區(qū)百姓脫貧致富、實現(xiàn)國家鄉(xiāng)村振興的重要木本油料樹種，種植面積廣泛，形成了可明顯改善種植戶經(jīng)濟收入、推動區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)鏈。但核桃產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)、增收必須要有科學(xué)的綜合管理，包括樹體、營養(yǎng)、病蟲危害防控等各個方面。特別是近年時常爆發(fā)的病蟲害，值得關(guān)注。而這就要求必須掌握核桃主要病蟲害發(fā)生規(guī)律及防御機制，選育抗病優(yōu)良品種。NPR1 是植物病害響應(yīng)中的重要因子，隨著在較多草本植物中的功能解析被報道，基因得到了較多的關(guān)注，認為其表達可以增強植株的抗病能力，是植物抗病育種的重要候選基因。但在核桃中，基因尚未被鑒定，這對揭示核桃抗病機制不利。因此，本研究中我們克隆獲得一條核桃基因（命名為），通過保守結(jié)構(gòu)域、多序列比對、同源進化等分析發(fā)現(xiàn)與其它物種的NPR 蛋白具有較高的相似性和較近的親緣關(guān)系（見圖2～3），在此基礎(chǔ)上，探究基因響應(yīng)核桃主要病害的潛力。

由于啟動子包含較多的可起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并可預(yù)測基因潛在功能的順式作用元件，首先，本研究鑒定獲得了基因上游1 233 bp啟動子進行順式作用元件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該啟動子包含WRKY、ABRE、Dof 等轉(zhuǎn)錄因子識別的順式作用元件，且有組織特異性表達、病害、干旱等逆境響應(yīng)相關(guān)原件（見表1）。由于其他較多啟動子含有相似元件，均作為預(yù)測目標(biāo)基因潛在功能的重要依據(jù)，如，海蓬子（）基因啟動子含有MYB、WRKY、MYC等轉(zhuǎn)錄因子識別的元件，且涉及病害、激素響應(yīng)，后被證實與基因抵抗?jié)B透脅迫相關(guān)。核桃基因的啟動子包含Dof、MYB、MYC、WRKY 等順式作用元件和激素響應(yīng)相關(guān)的ARFAT 等元件，且受NaCl、PEG及ABA 誘導(dǎo)，認為是重要的逆境調(diào)控候選基因。同時，考慮到基因是病害響應(yīng)重要基因，可推測基因很可能參與核桃抗病響應(yīng)過程。

由于大多數(shù)基因的表達水平與植物的抗性水平密切相關(guān)。如，擬南芥基因過表達對霜霉病菌（）和丁香假單胞菌（）的抗性增強；將基因轉(zhuǎn)入番茄（），不僅能對番茄花葉病毒產(chǎn)生抗性，而且對多種真菌性和細菌性病害表現(xiàn)出廣譜抗性；在水稻中組織特異性表達基因提高了對稻紋枯病的抗性。過表達蘋果（）基因可增強蘋果對火傷病和真菌病害的抗性，并激活一系列下游抗病相關(guān)基因的表達。在葡萄（）中超表達基因能夠增強對白粉病的抗性。因此，為了進一步明確的病害響應(yīng)功能潛力，對核桃進行了主要病害—炭疽病、枝枯病、細菌性黑斑病—脅迫處理，分析在接種后不同時間葉和莖中的表達。結(jié)果顯示，基因可被膠孢炭疽菌、矩圓黑盤孢菌、黃單胞菌誘導(dǎo)表達，且體現(xiàn)了一定的病害響應(yīng)特異性和組織差異性（見圖4～5）。綜上可得知，可作為抵抗核桃炭疽病、枝枯病、細菌性黑斑病的重要候選基因。

SA 在植物生長發(fā)育等過程中具有重要的作用。內(nèi)源SA是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的信號物質(zhì)，可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種生理代謝。外源SA 可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生生物與非生物脅迫耐受性，其中病害抗性更為突出。如，外源噴施SA 和吸附SA 插簽兩種給藥方式均能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對煙草番茄斑萎病、黑脛病、普通花葉病、野火病和赤星病的抗性。在采收前對葡萄果穗噴施SA，可顯著降低果實生長期間潛伏真菌率，提高紅地球葡萄對潛伏侵染病害的抗性，抑制采后灰霉病效果明 顯。因 此，對 核 桃 進 行 了SA、CgTJ+SA、MoZK+SA、XcHB+SA 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因的表達可被SA 顯著誘導(dǎo)，且基因在CgTJ+SA、MoZK+SA、XcHB+SA 處理下的表達水平要明顯高于單一的CgTJ、MoZK、XcHB 處理下的表達（見圖4～5）。這與其他基因響應(yīng)激素和逆境表達推測的功能潛力一致。如，核桃MYB 轉(zhuǎn)錄因子在干旱、SA 等處理下的表達認為可作為核桃逆境響應(yīng)機制研究及抗逆育種的優(yōu)良候選基因。番茄、、基因在SA 存在情況下，NaCl誘導(dǎo)的葉中表達被顯著增強。可見，SA是介導(dǎo)基因響應(yīng)核桃炭疽病、枝枯病、細菌性黑斑病的重要因子，基因是核桃抗病的重要候選基因。在后續(xù)研究中，將通過在木本和草本植株中過量表達來全面解析的抗病功能。