碳源等因素對濕地松優(yōu)良無性系胚性愈傷組織增殖的影響

高啟陽 黃宇龍 郭文冰 趙奮成 劉 陽

（廣東省林業(yè)科學研究院廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520）

培養(yǎng)基的pH 會影響培養(yǎng)基中外源激素和營養(yǎng)元素的作用效果，可能對培養(yǎng)物的生長狀況產(chǎn)生不同的影響。同時，培養(yǎng)基的pH 還會隨著培養(yǎng)過程而發(fā)生改變。培養(yǎng)基中碳源的種類及濃度對胚性愈傷組織的增殖和體胚的發(fā)育起著至關重要的作用，不僅為胚性愈傷組織的增殖提供能量，還維持著一定的滲透壓。不同的碳源種類和濃度會影響胚性愈傷組織的生長，因此選擇合適碳源種類和濃度對胚性愈傷組織的增殖尤為重要。谷氨酰胺是針葉樹體胚培養(yǎng)中最常見的有機氮源之一，有研究表明大多數(shù)松杉等植物在胚性愈傷組織和體細胞胚胎的培養(yǎng)過程中，需要額外添加谷氨酰胺。但由于谷氨酰胺不耐高溫，且常溫條件下在水溶液中極易分解為氨和焦谷氨酸，使相關培養(yǎng)基的配制和保存難度增加。丙谷二肽是丙氨酸和谷氨酰胺通過縮合反應形成的二肽化合物，以肽鍵連接，具有在水溶液中穩(wěn)定、耐高溫等特性。在人源細胞培養(yǎng)中，已經(jīng)開始使用丙谷二肽替代谷氨酰胺，但還鮮見丙谷二肽在松樹體細胞胚胎發(fā)生研究中的應用報道。

本研究以濕地松優(yōu)良無性系的胚性愈傷組織為研究材料，探究了不同pH、碳源和谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響，期望能夠獲得適合濕地松胚性愈傷組織增殖的主碳源種類及使用濃度，明確最優(yōu)pH 范圍，并回答谷氨酰胺能否被丙谷二肽替代的問題，以進一步降低培養(yǎng)成本，促進胚性愈傷組織迅速增殖并減輕褐化，為進一步提高濕地松胚性愈傷組織增殖的質(zhì)量和數(shù)量奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2019 年6～7 月從廣東臺山紅嶺種子園的濕地松精選種子園（混合代）中，采收優(yōu)良單株自由授粉的未成熟球果，誘導獲得胚性愈傷組織。單種子來源的胚性愈傷組織獨立建立胚性無性系，從中選擇已繼代6 次，增殖能力強，活力好的無性系PEE3-13進行本實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 胚性愈傷組織的鑒定

從誘導的愈傷組織中選取直徑2～5 mm 大小的愈傷組織材料置于載玻片上，用2%醋酸洋紅和0.5%伊文思藍先后對其進行染色，在體視顯微鏡下觀察被染色的細胞團特征。鑒定出的胚性愈傷組織用于增殖培養(yǎng)。

1.2.2 胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

隨著經(jīng)濟發(fā)展以及外來文化的影響，復雜、耗時的傳統(tǒng)工藝被現(xiàn)代化的快速藝替代，社會流動帶來民族文化認同上的缺失，傳統(tǒng)土家族服裝實用功能減弱。在傳統(tǒng)式微的情形之下，土家族服飾逐漸消失在民眾生活的視野中。再者，隨著新時代對民族文化的消費，土家族服飾在“再設計”的過程中為了迎合表演或者觀者“獵奇”的心態(tài)發(fā)生了很多的變化，現(xiàn)代舞臺表演用的土家族服飾除了“西蘭卡普”元素之外，已經(jīng)和苗族、侗族甚至西式禮服相差不大。伴隨著土家族傳統(tǒng)服飾的“消逝”，現(xiàn)在在民眾生活中碩果僅存的就是繡花鞋墊，而且繡花鞋墊伴隨著時代發(fā)展，其形式、圖案都發(fā)生了很大的變化。

將愈傷組織置于Y0 固體培養(yǎng)基表面進行繼代增殖，暗培養(yǎng)，23±1℃，每隔14 d 繼代1 次，繼代時優(yōu)選愈傷塊表面新生的細胞團進行繼代，以維持無性系的活力。Y0 培養(yǎng)基以mP6 為基本培養(yǎng)基，附加1 g·L肌醇，0.5 g·L水解酪蛋白，0.45 g·L谷氨酰胺，30 g·L蔗糖，1.1 mg·L2，4-D，0.45 mg·L6-BA，0.43 mg·LKT，1.3 mg·LABA和0.96 mg·LBr，以3 g·L植物凝膠（Phytagel）為凝固劑，0.25 g·LMES為pH穩(wěn)定劑。

1.2.3 培養(yǎng)基pH對胚性愈傷組織增殖的影響

在Y0 固體培養(yǎng)基成分不變的情況下，高壓滅菌前用1 mol·L的HCl 和NaOH 準確調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 分別為4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，然后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后依次加入ABA，Br和谷氨酰胺，充分混勻，取約30 mL 混勻的培養(yǎng)基，待其溫涼但未凝固時，用pH 計測定以上設定的幾種pH 是否發(fā)生變化，記錄培養(yǎng)基此時的pH，其余培養(yǎng)基正常倒平板備用。

將PEE3-13 的新生胚性愈傷稱量每個平板約0.7 g，輕輕置于培養(yǎng)基表面，并均勻分成7塊，每塊約0.1 g，記錄每個平板的初始接入質(zhì)量，每個所設定pH 條件下均接入10 板作為10 個生物學重復。將平板置于23±1 ℃，黑暗條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d 后，準確稱重此時平板上的胚性愈傷總質(zhì)量并記錄。

1.2.4 培養(yǎng)基碳源對胚性愈傷組織增殖的影響

以生工生物公司購買的蔗糖、麥芽糖及市場購買的精制白砂糖、紅塊糖為所測試的碳源種類，設置6個處理：30 g·L蔗糖，20 g·L蔗糖，30 g·L紅塊糖，45 g·L麥芽糖，20 g·L蔗糖+10 g·L麥芽糖或30 g·L白砂糖。除碳源外，其余培養(yǎng)基成分均與Y0培養(yǎng)基相同，配制方法類似。

PEE3-13 的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2胚性愈傷組織增殖的最適pH 篩選”，培養(yǎng)條件一致。

1.2.5 谷氨酰胺及丙谷二肽對胚性愈傷組織增殖的影響

以Sigma 公司購買的L-谷氨酰胺和廣州樂試生物科技有限公司購買的L-丙-谷二肽為所測試的有機氮源，設置4 個處理：①不添加任何谷氨酰胺或丙谷二肽，②450 mg·L的谷氨酰胺，③670 mg·L丙谷二肽，④870 mg·L丙谷二肽。除谷氨酰胺外，其余培養(yǎng)基成分均與Y0 培養(yǎng)基相同，配制方法類似。

PEE3-13 的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2 胚性愈傷組織增殖的最適pH篩選”，培養(yǎng)條件一致。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

增殖率（%）=（每板培養(yǎng)14 d后的質(zhì)量-每板初始接入的質(zhì)量）∕每板初始接入的質(zhì)量×100% （1）

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS Stasitics 21.0 軟件進行，使用Turkey 法進行多重比較并用標記字母法表示差異顯著性（不同小寫字母代表在＜0.05 水平差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕地松愈傷組織的鑒定

利用濕地松未成熟球果誘導獲得的愈傷組織有兩種類型：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織染色后在體視鏡下可見分生組織細胞團組成的胚頭（EC，embryonal mass cells）和胚柄（SC，suspensor cells）結(jié)構(gòu)，而非胚性愈傷中無法觀察到這一結(jié)構(gòu)。

對所獲得的無性系PEE3-13 的愈傷組織進行染色鑒定，體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其具有胚頭及胚柄結(jié)構(gòu)，胚頭細胞團密集，胚柄細胞呈長條形，緊隨在胚頭細胞團后（見圖1）。因此，所鑒定的愈傷組織由胚性細胞組成，為胚性愈傷組織。

圖1 濕地松無性系PEE3-13胚性愈傷組織的細胞形態(tài)觀察EC.胚頭；SC.胚柄Fig.1 Cell morphology observation for embryogenic callus of the clone PEE3-13EC.Embryonal mass cells；SC.Suspensor cells

2.2 不同pH對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響

對增殖培養(yǎng)基滅菌前和滅菌后的pH 分別進行了測定，結(jié)果表明，滅菌前培養(yǎng)基調(diào)整至某一確定的pH 后，在滅菌后仍會發(fā)生較大變化。當滅菌前的pH 小于6.0 時，滅菌后的pH 升高，滅菌前pH越低，升高越多；當滅菌前的pH 大于或等于6.0時，滅菌后的pH 降低，滅菌前pH 越高，降低越多（見表1）。因此，滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基的pH 至固定值并不能代表培養(yǎng)時該培養(yǎng)基的實際pH。

在不同pH 條件下，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和增殖率有很大差別（見表1）。當滅菌前pH 調(diào)整為6.0，滅菌后pH 變?yōu)?.68 時，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和平均增殖率最高，平均增殖率可達到436.20%，但與滅菌前調(diào)整pH 為7.0 時沒有顯著差異，說明培養(yǎng)基實際pH 范圍為5.68～6.28 時，均適宜胚性愈傷組織的生長。當滅菌前pH 調(diào)整為4.0，滅菌后pH 變?yōu)?.77 時，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和平均增殖率最低，此時培養(yǎng)基凝固困難，呈凝膠流動狀。當滅菌后pH 未落在最適范圍內(nèi)時，平均增殖率均有所下降，說明胚性愈傷組織在增殖過程中對pH 仍較為敏感。綜上，在培養(yǎng)基滅菌前將pH 調(diào)節(jié)至6.0～7.0 左右，能夠保證滅菌后pH 在最適范圍內(nèi)，最大限度降低pH 對胚性愈傷組織增殖的影響。

表1 不同pH對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響Table 1 Effects of different pH on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

2.3 不同碳源對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響

利用市售的精制白砂糖、紅塊糖與試劑公司購買的蔗糖和麥芽糖進行胚性愈傷組織增殖的比較研究，結(jié)果表明，不同碳源對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響非常顯著（見表2）。增殖培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率均在使用30 g·L白砂糖作為碳源時達到最高，平均增殖率可達到851.27%，胚性愈傷組織團呈白色，表面有絲狀突起，生長狀態(tài)好（見圖2f）；而在使用45 g·L的麥芽糖作為碳源時平均增殖率最低，僅為29.51%，胚性愈傷組織團大多萎縮不生長（見圖2d）；當蔗糖與麥芽糖結(jié)合使用時，平均增殖率雖高于僅使用蔗糖的處理，但差異不顯著（見表2）；市售紅塊糖可能因其雜質(zhì)成分較多，培養(yǎng)后質(zhì)量及平均增殖率均不理想，且胚性愈傷組織發(fā)黃變褐（見圖2c）。

圖2 不同碳源成分及濃度條件下濕地松胚性愈傷組織的生長情況a.30 g·L-1蔗糖；b.20 g·L-1蔗糖；c.30 g·L-1紅塊糖；d.45 g·L-1麥芽糖；e.20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麥芽糖；f.30 g·L-1白砂糖Fig.2 Growth of P.elliottii embryogenic callus in different carbon source and concentrationsa.30 g·L-1 sucrose；b.20 g·L-1 sucrose；c.30 g·L-1 brown sugar；d.45 g·L-1 maltose；e.20 g·L-1 sucrose+10 g·L-1 maltose；f.30 g·L-1 white sugar

表2 不同碳源成分及濃度對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響Table 2 Effects of different carbon source and concentrations on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

因此，市售精制白砂糖相比于純蔗糖，更適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，但具體是其中的何種成分促進了增殖，還需進一步探索；而麥芽糖極不適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，即使?jié)舛忍岣咧?5 g·L，也無法供給增殖所需的能量。

2.4 谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響

通過添加谷氨酰胺以及不同濃度的丙谷二肽，觀察丙谷二肽能否替代谷氨酰胺用于胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明，丙谷二肽添加后，即使增加使用濃度，培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率均顯著低于添加谷氨酰胺的處理組（見表3），說明丙谷二肽無法在濕地松胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)中替代谷氨酰胺。

表3 丙谷二肽及谷氨酰胺對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響Tabl 3 Effect of L-alanine-L-glutamine and L-glutamine on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組與添加谷氨酰胺的處理組相比，培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率差異雖然略低，但差異不顯著（見表3）；進一步在繼代后觀察到未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組的胚性愈傷組織更容易褐化，多次繼代后容易出現(xiàn)增殖困難和死亡，說明谷氨酰胺的缺乏即使在培養(yǎng)當代未顯著影響增殖率，仍會潛移默化地影響胚性愈傷組織的細胞活力，使細胞活力降低。

3 討論

胚性愈傷組織的增殖是松樹體細胞胚胎發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)，胚性愈傷組織可在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上長期繼代培養(yǎng)，并具有發(fā)育為體細胞胚胎，萌發(fā)形成體胚幼苗的能力。影響針葉樹胚性愈傷組織的增殖的因素有很多，其中包括碳源成分及濃度、微量元素、激素和瓊脂的濃度、pH 等，并且這些因素一直是體胚細胞胚胎發(fā)生過程研究的重點。

2003 年，曹新祥等人綜述了植物組織培養(yǎng)中pH 變化的有關問題：培養(yǎng)基的pH 能夠影響細胞的分裂和細胞增殖，當環(huán)境pH 高于8 時可啟動細胞的分裂，偏低則抑制細胞分裂；pH 還可影響植物材料的呼吸代謝狀況、激素進出胞內(nèi)和作用。目前，針葉樹胚性愈傷組織及體細胞胚胎培養(yǎng)中常用的pH 是5.8，且通常在培養(yǎng)基滅菌前測定。在本研究結(jié)果中，胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)的最適pH 在5.68～6.28，過酸過堿均會顯著影響增殖率。他人的研究中所使用的pH=5.8也在該pH范圍內(nèi)，但本研究獲得的最適pH 范圍并不是培養(yǎng)基滅菌前測定的，而是滅菌后實際測得的pH。已有研究表明，培養(yǎng)基經(jīng)過高溫高壓也會發(fā)生pH 改變，滅菌前培養(yǎng)基pH 在5～7 時，滅菌后pH 平均降低0.56。與該研究結(jié)果不同，在本研究中，不同的pH 范圍在滅菌前后的變化并不是一致的：當滅菌前pH 在4.0～5.0 時，滅菌后pH 升高；當滅菌前pH在6.0～8.0 時，滅菌后pH 降低。因此，如何調(diào)節(jié)滅菌前pH 使滅菌后pH 能夠落在最適pH 范圍內(nèi)，是一個極易被研究者忽略的細節(jié)問題。根據(jù)本研究結(jié)果，如滅菌前調(diào)節(jié)pH 至5.8，滅菌后pH 進一步降低至5.4 左右，并不適宜胚性愈傷組織的增殖；如滅菌前調(diào)節(jié)pH 至6.0～7.0，滅菌后pH 落在約5.68～6.28，更適宜胚性愈傷組織的增殖。

胚性愈傷組織在增殖時期，基本上不進行光合作用，需要額外添加碳水化合物作為能量。培養(yǎng)基中的碳源通常是由糖類提供。蔗糖是松屬胚性愈傷組織增殖過程中最常用的碳源之一，常規(guī)使用濃度在10～30 g·L。在本研究中，使用20 g·L蔗糖時，增殖率略低于使用30 g·L蔗糖的處理組，說明在一定范圍內(nèi)提高蔗糖的濃度，能夠提高濕地松胚性愈傷組織的增殖效率，與付雙彬在油松中的研究結(jié)果相似。麥芽糖是針葉樹體胚誘導和成熟過程的常用碳源，亦有研究者將其用于濕地松胚性愈傷組織的增殖。據(jù)報道，麥芽糖比蔗糖、葡萄糖更有利于胚性愈傷組織的誘導，或提高濕地松的成熟體胚獲得率。在本研究中，麥芽糖并不適合濕地松胚性愈傷組織的增殖，在麥芽糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，胚性愈傷幾乎不能增殖；這與成熟培養(yǎng)中利用麥芽糖抑制胚性愈傷增殖的作用原理相一致，但與張彩云等利用麥芽糖作為濕地松增殖培養(yǎng)的碳源的報道不相符。本研究基于降低培養(yǎng)基成本方面考慮，還使用了市售精制白砂糖和紅塊糖作為碳源進行研究，并意外地發(fā)現(xiàn)白砂糖是最適宜濕地松胚性愈傷組織增殖的碳源。雖然白砂糖的主要成分是蔗糖，但同時還含有0.5%左右的其他成分，有可能對植物組織的生長產(chǎn)生負面影響。在杉木的組織培養(yǎng)中，用白砂糖代替蔗糖，對其組培苗生長并無影響，且大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。這與本研究的結(jié)果類似，在濕地松胚性愈傷組織的培養(yǎng)中，也可利用精制白砂糖替代蔗糖以降低生產(chǎn)成本。

氮元素對于植物的生長發(fā)育是至關重要的，在針葉樹的體胚生長發(fā)育過程中，所需的氮全部依賴培養(yǎng)基供給，且有研究表明，谷氨酰胺所提供的有機氮比無機氮更為重要。在挪威云杉胚性培養(yǎng)物的增殖過程中，觀察到游離氨基酸庫中67%的同化氮源均來自谷氨酰胺提供的氮。在挪威云杉的體胚萌發(fā)過程中，谷氨酰胺也是體胚萌發(fā)過程的首選氮源。可見谷氨酰胺提供的有機氮是胚性愈傷組織和體胚正常生長不可或缺的，但谷氨酰胺的水溶液極易水解，給培養(yǎng)基的配制和存放、胚性愈傷組織和體胚的培養(yǎng)和繼代帶來了諸多不便。在動物及人源細胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺發(fā)揮的作用與體胚培養(yǎng)中類似，也是重要的有機氮來源和各類氨基酸∕維生素等的合成前體。目前已有研究表明，谷氨酰胺能夠以L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的二肽形式或蛋白水解物的形式給細胞提供營養(yǎng)，其商品化的產(chǎn)品GlutaMAX被廣泛應用于各種細胞培養(yǎng)中。在本研究中，也想嘗試利用丙谷二肽替代谷氨酰胺進行胚性愈傷組織的培養(yǎng)，但目前結(jié)果表明，丙谷二肽不僅不能替代谷氨酰胺用于濕地松胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)，還會在一定程度上抑制增殖。該結(jié)果說明針葉樹胚性愈傷組織利用谷氨酰胺的方式可能與動物細胞并不一致，胚性愈傷組織無法利用以二肽形式存在的谷氨酰胺，需要尋找其他可能的谷氨酰胺替代物以改進胚性愈傷組織的培養(yǎng)方法。

胚性愈傷組織的增殖是體胚發(fā)生過程中的一個重要階段，一方面在此階段要實現(xiàn)迅速擴增，另一方面其生長狀態(tài)也會直接影響體胚的成熟比率和發(fā)育狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)用于濕地松胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)基應在滅菌前調(diào)整pH 至6.0～7.0，使滅菌后pH 可落在5.68～6.28，選擇30 g·L精制白砂糖或30 g·L蔗糖作為碳源，并添加450 mg·L谷氨酰胺，能夠獲得較優(yōu)增殖效率，且胚性愈傷組織的生長狀態(tài)較好。本研究初步探究了pH、碳源和谷氨酰胺對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響，獲得一些有趣的發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究中可進一步對碳源或谷氨酰胺的利用機制進行探索，以揭示胚性愈傷組織的碳∕氮利用規(guī)律，為進一步優(yōu)化體胚發(fā)生體系奠定研究基礎。