胡楊PeNAC121基因啟動(dòng)子的分離鑒定和脅迫應(yīng)答模式分析

謝 望 李天靜 李鑫窈 楊豐銘 姚銀安 高永峰

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010）

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，由于外界氣候環(huán)境條件的變化，導(dǎo)致植物經(jīng)常遭遇干旱、高鹽、低溫以及病蟲(chóng)害等各種非生物和生物脅迫的影響，這些脅迫不僅會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損害，還會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。為此，植物也進(jìn)化出了相應(yīng)的應(yīng)對(duì)策略，其中通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）對(duì)外界環(huán)境脅迫信號(hào)做出響應(yīng)并與相關(guān)啟動(dòng)子中的相關(guān)順式作用元件相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)（激活或抑制）下游逆境基因的表達(dá)，已成為植物應(yīng)對(duì)或抵御外界逆境脅迫的一種重要調(diào)控方式。

植物中存在大量的與非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中的NAC 家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其主要行使轉(zhuǎn)錄激活的功能。近年來(lái)，以NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境抗性中的功能研究的最為深入和廣泛。研究表明，多種植物中的NAC 轉(zhuǎn)錄因子成員都參與調(diào)控了植物對(duì)干旱、高鹽、高溫、低溫以及澇漬等非生物脅迫的應(yīng)答，如 擬 南 芥（）中 的RD26/ANANC072、ANANC096，水稻（）中的SNAC1、ONAC022、OSNAC5 和OSNAC6，玉米（）的ZmSNAC1、小麥（）中 的TaNAC2 和TaNAC29，黃 花 棘 豆（）的OoNAC72和 鷹 嘴 豆（）的CarNAC4等均涉及到對(duì)干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)和抗性。此外，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中也具有重要的作用，如辣椒（）的CaNAC064、小麥的TaNAC67、水稻中的ONAC095 和蘋(píng)果（）的Md‐NAC029 均在低溫響應(yīng)和植物的耐寒性中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。楊樹(shù)（）中的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族有163個(gè)成員，但目前對(duì)其功能的研究還主要集中在次生細(xì)胞壁的發(fā)育和木材的形成的調(diào)控過(guò)程中，如PNAC070/PtWND5、PNAC086/PtWND1、 PNAC008/PtWND3A、 PNAC009/Pt‐WND4B、PNAC071/PtWND1B、PNAC085/PtWND2B等，而對(duì)其參與樹(shù)木逆境脅迫應(yīng)答和響應(yīng)機(jī)制的研究較少。胡楊（）是楊柳科（）楊屬（）中最古老和原始的木本植物，其具有抗旱、耐鹽堿、抗寒、生物量大且抗逆性強(qiáng)的眾多特性，是植物抗脅迫相關(guān)基因挖掘的重要種質(zhì)資源庫(kù)。目前胡楊基因組測(cè)序結(jié)果的公布為胡楊中關(guān)鍵抗逆基因和逆境響應(yīng)啟動(dòng)子元件的挖掘和篩選提供了便利。因此，本研究從胡楊葉片中克隆基因的啟動(dòng)子序列，分析該序列中存在的相關(guān)順式作用元件，并使用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在野生型毛白楊（）中表達(dá)，之后對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株采用不同脅迫處理（干旱、鹽、低溫和ABA）后進(jìn)行GUS染色和酶活定量分析。胡楊NAC家族轉(zhuǎn)錄因子成員逆境脅迫響應(yīng)和調(diào)控機(jī)制的研究，將為今后闡明胡楊抗旱耐鹽的分子調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料胡楊是2016 年從新疆林場(chǎng)購(gòu)進(jìn)，西南科技大學(xué)東九6 樓水培室培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。遺傳轉(zhuǎn)化所使用的植物材料－三倍體毛白楊由西南大學(xué)樹(shù)木生物學(xué)課題組羅克明教授提供?；蚩寺∷杈N、載體均由西南科技大學(xué)國(guó)際樹(shù)木生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制作保存。

1.2 方法

1.2.1 胡楊基因啟動(dòng)子的克隆和序列分析

用胡楊基因核苷酸序列（XM_011045326.1）在NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）找到該基因的上游啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)用于啟動(dòng)子克隆的兩對(duì)上下游引物（見(jiàn)表1），以3 年生胡楊的葉片DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，回收目的片段，連接克隆載體pEASY-T1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送擎科生物公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 1 Primers used in this study

使用在線分析軟件PlantCARE（http：//bioin‐formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)胡楊基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行相關(guān)的順式作用元件分析。

1.2.2 胡楊基因的組織表達(dá)模式分析

提取1 年生野生型胡楊不同組織（根、莖、葉）的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA 作為模板，以胡楊（Ubiquitin，XM_011004860.1）作為內(nèi)參基因，以qRT-PeNAC121-F/R 作為目的基因特異性引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）檢測(cè)。反應(yīng)條件按照TransGen 公司的Trans‐Star Green qPCR SuperMix UDG 的說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量采用2法進(jìn)行計(jì)算方法。

1.2.3 毛白楊啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pEASY-T1+PeNAC121和pBI121分別用HⅠ和dⅢ（Thermo 公司）進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建獲得重組植物表達(dá)載體pBI121+PeNAC121：：GUS，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105細(xì)胞。

1.2.4 毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化和再生植株的陽(yáng)性鑒定

主要分為4 個(gè)過(guò)程，包括侵染、共培養(yǎng)、分化、生根。

（1）侵染：將1.2.3中的農(nóng)桿菌懸液加入配置好的侵染液（加入1 mL 10 g·LAS 乙酰丁香酮的1/2 WPM 液體培養(yǎng)基）中混勻。然后，取野生型毛白楊無(wú)菌苗葉片切成0.2 cm的小方塊后，置入侵染液中浸泡10 min，在此期間，使用尖頭鑷子在葉片上扎上小孔，以增加受傷面積。（2）共培養(yǎng)：侵染結(jié)束后，將已吸干侵染液的葉片均勻放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在24 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)至葉片發(fā)生輕微卷曲（大概2～3 d）后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。（3）分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)保持正常的光照條件，溫度26/22 ℃（白天/16 h、黑夜/8 h）進(jìn)行，每周更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)分化平板上的葉片分化出愈傷組織且長(zhǎng)有小芽時(shí)，說(shuō)明分化狀態(tài)較好。（4）生根培養(yǎng)：待愈傷組織上長(zhǎng)出3 cm 左右的小芽時(shí)，切下小芽置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。待苗長(zhǎng)至6 cm高左右時(shí)取葉片，提DNA進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：WPM（木本植物培養(yǎng)基，Phyto‐Tech 公司，貨號(hào)HHA0449113A）+1 mg·LNAA（萘乙酸，BBI 公司，貨號(hào)A600729-0100）+2 mg·LZT（反玉米素，BBI 公司，貨號(hào)A600748-0100）；誘導(dǎo)培養(yǎng)基：WPM+25 mg·LKana（硫酸卡那霉素，BBI 公司，貨號(hào)A506636-0100）+200 mg·LTMT（特美汀，Solarbio 公司，貨號(hào)401D0320）；分化培養(yǎng)基：WPM+2 mg·LZT+25 mg·LKana+200 mg·LTMT；生根培養(yǎng)基：WPM+1 mg·LIAA（3-吲哚乙酸，BBI 公司，貨號(hào)A600723-0025）+25 mg·LKana+200 mg·LTMT；以上各培養(yǎng)基的pH均為5.8～6.0。

轉(zhuǎn)基因毛白楊的陽(yáng)性鑒定用CTAB方法提取再生植株葉片基因組DNA 并以此為模板，用NPTII-F/R 引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的脅迫處理

將生長(zhǎng)45 d 的野生型幼苗和轉(zhuǎn)基因毛白楊幼苗從生根的固體培養(yǎng)基中取出，然后將它們分別置入含有200 mmol·LNaCl、300 mmol·L甘露醇、0.1 mmol·LABA（先進(jìn)行葉面噴施，再將根置于液體中）的WPM 液體培養(yǎng)基中（不加任何激素和瓊脂），并以在正常WPM 液體培養(yǎng)基中處理的野生型和轉(zhuǎn)基因毛白楊幼苗作為對(duì)照；4 ℃低溫處理在相同光照條件下的人工培養(yǎng)箱進(jìn)行，培養(yǎng)方式同上，并使用正常WPM 液體培養(yǎng)基。將上述處理組的幼苗在相同的光照條件下處理24 h后，分別進(jìn)行GUS 染色和酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)有2 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含6 個(gè)個(gè)體（其中3 株做GUS染色實(shí)驗(yàn)，另3株做GUS酶活測(cè)定）。

1.2.6 GUS組織化學(xué)染色和酶活的定量分析

參照高永峰等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因毛白楊幼苗的GUS 染色和酶活性的定量分析，該實(shí)驗(yàn)中使用酶標(biāo)儀SpectraMax iD3（MOLECULAR DE‐VICES公司）測(cè)其樣品產(chǎn)生的熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡楊PeNAC121 基因啟動(dòng)子克隆與序列分析

以胡楊葉片的基因組DNA 為模板，分別以PeNAC121Pro-F0/R0 和PeNAC121Pro-F1/R1 作 引物進(jìn)行巢式PCR 的二輪擴(kuò)增，第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在1 500～3 000 bp 區(qū)域中間出現(xiàn)一條單一的目的條帶（見(jiàn)圖1），回收其目的條帶并連接pEASY-T1載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑單菌落經(jīng)PCR 陽(yáng)性克隆鑒定后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的基因啟動(dòng)子的片段大小為1 997 bp（見(jiàn)圖2），使用PlantCARE 對(duì)基因啟動(dòng)子中存在的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除含有12 個(gè)光響應(yīng)元件以外，還包含很多與非生物脅迫相關(guān)的元件，包括1 個(gè)低溫響應(yīng)元件LTR、1 個(gè)參與干旱誘導(dǎo)的MYB 結(jié)合位點(diǎn)MBS、2個(gè)防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、2 個(gè)抗氧化反應(yīng)元件ARE、2 個(gè)創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif 和3 個(gè)植物激素相關(guān)響應(yīng)元件（包括2 個(gè)脫落酸和1個(gè)赤霉素響應(yīng)元件）（見(jiàn)圖2 和表2）?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測(cè)胡楊基因啟動(dòng)子可能會(huì)對(duì)干旱、低溫、創(chuàng)傷等非生物脅迫以及ABA 和GA 等植物激素處理產(chǎn)生應(yīng)答。

圖1 胡楊PeNAC121基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M.DL15000；1.目的片段Fig.1 PCR amplified product of PeNAC121 gene promoter from P.euphraticaM.DL15000；1.PCR product of target fragment

圖2 胡楊PeNAC121啟動(dòng)子的DNA序列下劃線表示不同順式作用元件的DNA核心序列Fig.2 DNA Sequences of PeNAC121 gene promoter from P.euphraticaThe underlined DNA sequences in the figure indicate DNA core sequences of different Cis-acting elements

表2 胡楊PeNAC121基因啟動(dòng)子中的順式作用元件Table 2 The Cis-acting elements in the isolated PeNAC121 promoter region

2.2 胡楊PeNAC121基因組織表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)基因在野生型胡楊不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果如下圖所示（見(jiàn)圖3）：基因在胡楊的各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，但在莖中的表達(dá)量最高，分別是根的8.2 倍和葉片的5 倍左右，表明胡楊基因的表達(dá)不具有組織特異性。

圖3 胡楊PeNAC121基因在不同組織中的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of PeNAC121 gene in different tissues of P.euphratica

2.3 胡楊PeNAC121 基因啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建與毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化

為了更深入地分析胡楊基因啟動(dòng)子的功能，利用基因的啟動(dòng)子序列去替換植物表達(dá)載體pBI121 上的CaMV35S 啟動(dòng)子，并形成重組載體pBI121+PeNAC121：：GUS（見(jiàn)圖4）。隨后，對(duì)構(gòu)建好的重組載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切結(jié)果顯示：酶切下來(lái)的條帶與目的條帶大小相符（見(jiàn)圖5），且再次測(cè)序的結(jié)果也與前面測(cè)序的結(jié)果一致，證明重組載體構(gòu)建成功。

圖4 重組載體基因表達(dá)盒示意圖Nos P.Nos啟動(dòng)子；NPTⅡ.新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ；Nos T.Nos終止子Fig.4 Schematic diagram of recombination vectorNos P.The promoter of Nos gene；NPTⅡ.Neomycin phosphotransfer‐ase Ⅱ；Nos T.The terminator of Nos gene

圖5 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M.DL15000；1.重組質(zhì)粒pBI121+PeNAC121Pro：：GUS；2.pBI121+PeNAC121Pro：：GUS質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物Fig.5 Double digestion of recombinant plasmidM.DL15000；1.Recombinant plasmid pBI121+PeNAC121Pro：：GUS；2.The fragments of pBI121+PeNAC121Pro：：GUS recombinant plasmid by restriction enzyme digested

之后，使用含有pBI121+PeNAC121：：GUS的農(nóng)桿菌侵染野生型毛白楊葉片，并通過(guò)組織培養(yǎng)（參考1.2.4）獲得轉(zhuǎn)基因毛白楊再生植株，本研究共獲得9 株再生植株。再生植株的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鑒定結(jié)果顯示（見(jiàn)圖6），除7 號(hào)再生植株外，其余的植株（8 株）均擴(kuò)增出條帶，且條帶大小與正對(duì)照（pBI121+PeNAC121：：GUS 重組質(zhì)粒）相同，且負(fù)對(duì)照（野生型毛白楊）沒(méi)有條帶，證明該實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為89%。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株NPTII基因的PCR檢測(cè)M.Trans2k Plus；+.重組質(zhì)粒pBI121+PeNAC121Pro：：GUS；-.野生型植株；1～9.轉(zhuǎn)基因植株Fig.6 PCR analysis for NPT II gene in transgenic plantsM.Trans2k Plus；+.Recombinant plasmid pBI121+PeNAC121Pro：：GUS；-.Wild type；1-9.Transgenic plants

2.4 胡楊PeNAC121基因啟動(dòng)子的活性分析

取45 d大的轉(zhuǎn)基因毛白楊進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色。染色結(jié)果表明（見(jiàn)圖7B）：所有組織中均能觀察到不同深淺的藍(lán)色，且在莖中的藍(lán)色最深，根中次之，葉片最淺，表明基因啟動(dòng)子無(wú)明顯組織特異性，屬于組成型啟動(dòng)子，該結(jié)果與2.2中的基因的組織表達(dá)模式結(jié)果一致。

2.5 不同脅迫處理對(duì)PeNAC121 基因啟動(dòng)子的活性影響

為進(jìn)一步闡明基因啟動(dòng)子對(duì)不同脅迫處理的應(yīng)答模式，分別利用鹽、干旱、低溫和ABA 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株處理后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS 酶活定量檢測(cè)。結(jié)果顯示：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M幼苗中的各個(gè)組織中均沒(méi)有藍(lán)色（見(jiàn)圖7A），而在轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M幼苗的根和莖中均觀察到藍(lán)色、在葉片的葉脈處觀察到較淺的藍(lán)色（見(jiàn)圖7B），而經(jīng)200 mmol·LNaCl 和300 mmol·L甘露醇處理后，轉(zhuǎn)基因幼苗的根和葉均呈現(xiàn)出深藍(lán)色（見(jiàn)圖7：C～D），其GUS 酶的活性分別是轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M（0.61）的4.91 和4.96 倍（見(jiàn)圖8）。同時(shí)，經(jīng)0.1 mmol·LABA 和4 ℃低溫處理的幼苗其根、莖和葉片也呈現(xiàn)出較深的藍(lán)色（圖7：E～F），其GUS 酶的活性分別是對(duì)照組的2.70 和2.28 倍（見(jiàn)圖8）。上述結(jié)果表明胡楊啟動(dòng)子能夠受到干旱、鹽、低溫及ABA 脅迫的誘導(dǎo)，是一個(gè)能夠響應(yīng)多種脅迫的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

圖7 不同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因毛白楊幼苗的GUS組織化學(xué)染色A.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；B.對(duì)照；C.200 mmol·L-1 NaCl處理；D.300 mmol·L-1甘露醇處理；E.4℃低溫處理；F.0.1 mmol·L-1 ABA處理Fig.7 GUS histochemical staining of transgenic poplar seedlings under different stress conditionsA.NT-Control；B.Control；C.200 mmol·L-1 NaCl treatment；D.300 mmol·L-1 mannitol treatment；E.4℃cold stress treatment；F.0.1mmol·L·L-1 ABA treatment

圖8 不同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因毛白楊幼苗的GUS定量分析不同小寫(xiě)字母表示不同處理間的差異顯著（P<0.05，LSD檢驗(yàn)）Fig.8 Quantification of GUS activity in transgenic poplar seedlings under different stressesDifferent letters represent significant differences among different treat‐men（tP<0.05，LSD test）

3 討論

啟動(dòng)子是基因的重要組成部分，其序列中存在的順式作用元件通過(guò)與相應(yīng)的反式作用因子結(jié)合最終決定了基因的時(shí)空表達(dá)模式。許多轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子中都含有多種與逆境和激素相關(guān)的順式作用元件，如WRKY、MYB 和NAC 基因等。因此在轉(zhuǎn)錄因子的研究中，挖掘啟動(dòng)子中的關(guān)鍵順式作用元件對(duì)于更透徹的研究基因的響應(yīng)模式和調(diào)控功能具有重要意義。此外，隨著對(duì)植物轉(zhuǎn)基因研究的深入，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物生物安全性的認(rèn)識(shí)和要求也在不斷提高，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子培育抗逆作物新品種在很多情況下成為了理想選擇。目前，有大量研究發(fā)現(xiàn)NAC 轉(zhuǎn)錄因子與植物的非生物脅迫應(yīng)答密切相關(guān)。Baloglu 等分析得出小麥69-1 在干旱、鹽和高溫脅迫下強(qiáng)烈表達(dá)。Tak 等發(fā)現(xiàn)香蕉（）中被干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)的42 基因的過(guò)量表達(dá)可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性。此外，Su等研究發(fā)現(xiàn)葡萄（）基因能夠被干旱和外源施加的ABA和JA 強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其異源過(guò)表達(dá)的擬南芥植株可通過(guò)介導(dǎo)茉莉酸的生物合成來(lái)提高其耐旱性。上述研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物的多種逆境脅迫應(yīng)答和抗性中均發(fā)揮著重要作用。

胡楊由于其優(yōu)良的抗旱耐鹽特性使其成為植物逆境響應(yīng)和抗逆基因挖掘的理想遺傳資源庫(kù)。本研究以胡楊為材料，利用PCR 克隆獲得胡楊基因的啟動(dòng)子。 序列分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列中含有3 個(gè)激素（ABA 和GA）響應(yīng)元件、8 個(gè)非生物脅迫（包括干旱、低溫和防衛(wèi)脅迫等）響應(yīng)元件，推測(cè)基因啟動(dòng)子可能受上述非生物脅迫和激素等的誘導(dǎo)響應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，利用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在野生型毛白楊中表達(dá)，并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株采用不同脅迫處理（干旱、鹽、低溫和ABA）后進(jìn)行了GUS染色和酶活定量分析。檢測(cè)結(jié)果顯示：鹽、干旱、低溫和植物激素ABA 均能不同程度地誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性增加，這一結(jié)果與前面的預(yù)測(cè)一致。同時(shí)，GUS 酶活性定量結(jié)果顯示：與植物激素的響應(yīng)相比，啟動(dòng)子對(duì)鹽、干旱和低溫的響應(yīng)更為強(qiáng)烈，推測(cè)這可能與相關(guān)響應(yīng)元件在基因啟動(dòng)子中存在的數(shù)量和調(diào)控的強(qiáng)弱有關(guān)。綜上，本研究初步闡明了基因啟動(dòng)子響應(yīng)干旱、鹽、冷和外源性ABA 等非生物脅迫的模式，并獲得了含該啟動(dòng)子的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因毛白楊植株，為后續(xù)研究該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄應(yīng)答調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)材料。