山新楊LTP家族基因生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析

孫 乾 吳宇航 張雅譞 曹競丹 石晶靜 王 超*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

高鹽土壤會(huì)導(dǎo)致植物的生長代謝紊亂，進(jìn)而也會(huì)影響植物的正常生長發(fā)育過程。干旱會(huì)對植物的生化代謝過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而阻礙植物的正常生長發(fā)育。研究林木材性和抗性形成的分子機(jī)制，鑒定重要基因，對于林木在抗鹽、抗干旱育種方面具有重要意義。

（lipid transfer protein）是研究較少的一類植物基因家族，廣泛分布于植物組織和細(xì)胞。1975年，基因首次在馬鈴薯（L.）塊莖內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并被證實(shí)在植物細(xì)胞膜上有可以與磷脂特異性結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，因此被命名為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它作為一類植物蛋白質(zhì)，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。基因相關(guān)研究表明，LTP 蛋白的三級結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)獨(dú)立的疏水腔，因此可以推測，通過疏水腔和磷脂等物質(zhì)的作用，可實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。有關(guān)研究表明基因除了脂質(zhì)運(yùn)輸功能外，還具有角質(zhì)膜的生成、生物信號傳導(dǎo)的功能。

基因作為一種抗性基因，在植物的生長發(fā)育方面具有很重要的作用，因此將具有抗逆功能的基因過量表達(dá)可以提高植物抵抗非生物脅迫的能力。邢儀利用馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)該基因具有抗鹽、抗旱功能。巴西學(xué)者M(jìn)oraes等利用水稻（L.）定量研究LTP1 類蛋白的11種遺傳異構(gòu)體的耐性（尤其是耐鹽性）和抗病基因型；臧慶偉發(fā)現(xiàn)為小麥（L.）水分脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，二者在轉(zhuǎn)基因擬南芥（）中的超表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性；李晉將轉(zhuǎn)入到TI1068 煙草（L.）品系，發(fā)現(xiàn)在高鹽和脫水的環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因煙草的萌發(fā)率和根長高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)基因煙草對干旱和高鹽 逆 境 具 有 更 大 的 耐 受 力。Jülke 等 發(fā) 現(xiàn) 轉(zhuǎn)和基因水稻株系在含有NaCl 的培養(yǎng)基上生長狀況更好，說明這兩個(gè)基因均具有耐鹽功能。另外，有相關(guān)研究表明基因的表達(dá)受多種激素的誘導(dǎo)，程朝澤對基因進(jìn)行啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，基因能夠響應(yīng)鹽旱等逆境條件、激素處理誘導(dǎo)。劉勇發(fā)現(xiàn)脫落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）和HO能顯著上調(diào)基因的表達(dá)水平，赤霉素（GA）處理后其表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，且基因DNA 序列的啟動(dòng)子存在干旱、低溫等多種（非）生物脅迫響應(yīng)元件和MeJA等激素響應(yīng)元件。

山新楊（var.）是由山楊（）和新疆楊（var.）雜交選育而成的楊樹品種，具有生長迅速、抗逆性強(qiáng)、樹干挺直、樹型美觀等特點(diǎn)，品質(zhì)優(yōu)良，很受人們重視，具有廣闊的發(fā)展前景。本研究以家族基因?yàn)檠芯繉ο?，進(jìn)行蛋白性質(zhì)分析、多序列比對分析、進(jìn)化樹分析及qRT-PCR 分析，初步了解家族基因在不同組織及非生物脅迫條件下的表達(dá)模式，為研究山新楊木質(zhì)部發(fā)育及抗非生物脅迫性狀形成的分子基礎(chǔ)研究及分子育種提供理論數(shù)據(jù)和研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所使用的植物材料選自于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的山新楊組培苗，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗，光照強(qiáng)度為400 μmol·m·s。山新楊組培苗培養(yǎng)4 周后將其移至營養(yǎng)土中，置于溫室人工培養(yǎng)，人工培養(yǎng)的營養(yǎng)土壤中（黑土）∶（蛭石）∶（珍珠巖）=5∶3∶2，生長條件為，光周期為光照：16 h/黑暗：8 h，光照強(qiáng)度為400μmol·m·s，溫度為（22±2）℃，相對濕度為65%～75%。生長8 周左右，在200 mmol·LNaCl，20% PEG6000 脅迫處理0、6、9、12、24、48 h 后進(jìn)行取材，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每次重復(fù)含3 株，以水處理為對照。5 年生野生山新楊用于進(jìn)行應(yīng)拉木誘導(dǎo)處理，將處理組的樹干全部朝同一方向彎曲，將樹干頂端部分用繩子和膠帶固定于相鄰樹上，使樹干部分大致傾斜45°，應(yīng)拉木處理為5 棵1 組，未處理對照組為5 棵1 組，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，待2 周之后取材。傾斜上部木質(zhì)部為應(yīng)拉木（TW），下部為對應(yīng)木（OW），以直立木（NW）為對照，刮取正在發(fā)育的木質(zhì)部。所取材料用液氮處理，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1家族基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy 提供的ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/）對家族基因進(jìn)行親水性預(yù)測。利用在線軟件SOP‐MA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測分析山新楊LTP 家族蛋白二級結(jié)構(gòu)。利用軟件SWISSMODEL（https：//www.sw issmodel.expasy.org/interac‐tive/DTDUCp/models/）預(yù)測PdbLTP 家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)。用BioEdit 軟件進(jìn)行多序列比對，將結(jié)果導(dǎo)出后，利用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行分析，選擇NJ 方式構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

引物及樣品的測序均委托吉林省庫美生物科技有限公司（www.comatebio.com）進(jìn)行。主要試劑包 括200 mmol·LNaCl（上 海 生 工）；20%PEG6000（Biosharp）；通用植物總RNA 提取試劑盒（Bioteke Corporation）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；qRT-PCR反應(yīng)試劑盒（全式金）。

使用CTAB 法提取山新楊中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）進(jìn)行cDNA 的合成。反應(yīng)體系為20 μL∶2 × TS Reaction Mix 10 μL，TransScript ⑧RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo（dT）18 Primer（0.5 μg·μL）1 μL，Total RNA 50 ng～5 μg，gDNA Remove 1 μL，補(bǔ)充RNase-Free Water 至20 μL。反應(yīng)條件∶在PCR 儀（Bi-ometra）中，42 ℃條件下，反應(yīng)30 min；85 ℃條件下，反應(yīng)5 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將cDNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qRT-PCR分析

根據(jù)基因組中鑒定的山新楊家族CDS 序列選取200 bp 左右的序列長度設(shè)計(jì)特異性定量引物（如表1）選擇-和作為內(nèi)參基因。qRT-PCR 反應(yīng)體系為特異性定量F，R primer各1 μL、模板2 μL、去離子水7 μL 和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL（Toyobo Co.，Osaka，Japan）總體系為20μL，3 次技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性12 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、78.4 ℃讀板1 s，共45 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。在Bio-Rad（Hercules.CA.USA.）上完成該反應(yīng)。讀數(shù)分析其數(shù)據(jù)，運(yùn)用2方法進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

表1 山新楊LTP家族基因定量引物序列Table 1 Quantitative primer sequences for LTP family genes of Populus sibiricum

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel 2016（Microsoft Office）與SPSS 22（IBM）軟件進(jìn)行，利用檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析中顯著性檢驗(yàn)。將家族基因表達(dá)模式分析結(jié)果分別進(jìn)行兩兩比較，不同材料及處理分別進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，選擇Analyze 模式進(jìn)行分析，<0.05表明結(jié)果顯著，<0.01表明結(jié)果極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdbLTP基因生物信息學(xué)分析

2.1.1基因序列信息

山新楊基因的核苷酸數(shù)量多數(shù)集中在294～396 bp，氨基酸數(shù)集中在97～131 aa；而基因的序列長度較基因長，兩個(gè)基因分別為482和720 bp（見表2）。

表2 PdbLTPs基因序列統(tǒng)計(jì)表Table 2 PdbLTPs genes sequence statistics table

2.1.2 PdbLTPs蛋白親疏水性

由圖1 可知，親水性分析結(jié)果顯示山新楊LTP蛋白既有親水性區(qū)域也有疏水性區(qū)域，圖中正值的高峰部分即是疏水性區(qū)域，負(fù)值的高峰部分即是親水性區(qū)域。可以明顯看出，疏水性區(qū)域多于親水性區(qū)域，說明PdbLTPs 蛋白家族均具有疏水性，推測其為跨膜蛋白。

圖1 PdbLTPs蛋白親水性分析Fig.1 Hydrophilic analysis of PdbLTP proteins

2.1.3 PdbLTPs蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

PdbLTP 家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，PdbLTP1 各二級結(jié)構(gòu)的峰值均在60～80 nm，Pd‐bLTP2 各二級結(jié)構(gòu)的峰值區(qū)域處于40～100 nm，PdbLTP3 的二級結(jié)構(gòu)中延伸連峰值最大，且峰值集中在20 nm，PdbLTP4 二級結(jié)構(gòu)峰值集中在40～80 nm，相比之下PdbLTP5、PdbLTP6、PdbLTP7、Pd‐bLTP8 蛋白的二級結(jié)構(gòu)都有多次不同大小的峰值（見圖2）；為進(jìn)一步進(jìn)行分析，進(jìn)行了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示，山新楊LTP 家族蛋白均將進(jìn)行不同程度的折疊，其中，PdbLTP1、Pd‐bLTP6、PdbLTP8 含有-螺旋和無規(guī)則卷曲和-轉(zhuǎn)角，PdbLTP4、PdbLTP5、PdbLTP7、GLTP1含有-螺旋和無規(guī)則卷曲和-轉(zhuǎn)角和-折疊，PdbLTP2含有-螺旋和無規(guī)則卷曲和-折疊，PdbLTP3含有-螺旋和-轉(zhuǎn)角，PdbGLTP2 含有-螺旋和無規(guī)則卷曲（見圖3）。PdbLTP 家族蛋白由螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相互盤繞、折疊三維構(gòu)象，而Pdb‐GLTP 蛋白則是由螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角盤繞、折疊三維構(gòu)象。

圖2 PdbLTPs蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.2 Secondary structure prediction of PdbLTP Proteins

圖3 PdbLTPs蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.3 Tertiary structure prediction of PdbLTP proteins

2.1.4 PdbLTPs蛋白多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對結(jié)果顯示PdbLTP 蛋白在保守位置具有8 個(gè)Cys 殘基，是LTP 家族蛋白重要結(jié)構(gòu)（見圖4）。進(jìn)化樹分析顯示，PdbLTP1、PdbLTP2、PdbLTP3、PdbLTP4 與響應(yīng)鹽脅迫的BpLTP4 基因蛋白在同一分支。因此，推測這些基因也具有耐鹽功能。PdbLTP5 與AtLTP3 和AtLTP4 同源性較高，PdbLTP6、PdbLTP7、PdbLTP8 與TaLTP 也具有同源性（見圖5）。研究顯示和具有耐鹽能力，因此推測基因具有相似功能。

圖4 PdbLTPs蛋白多序列比對分析Fig.4 Sequence alignment analysis of PdbLTP proteins

圖5 PdbLTPs蛋白進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PdbLTP proteins

2.2 PdbLTPs基因表達(dá)模式分析

2.2.1 重力處理表達(dá)模式分析

在人工彎曲模擬重力刺激處理后，qRT-PCR分析結(jié)果顯示、、、在應(yīng)拉木中的表達(dá)量最高，、在對應(yīng)木中的表達(dá)量最高，這些山新楊基因響應(yīng)人工彎曲和重力刺激。和對人工彎曲和重力刺激處理響應(yīng)不明顯（見圖6）。

圖6 重力處理下PdbLTPs基因表達(dá)模式分析*P<0.05，**P<0.01，下同F(xiàn)ig.6 Expression pattern analysis of PdbLTP genes under gravity processing*P<0.05，**P<0.01，the same as below

2.2.2 組織特異性表達(dá)模式分析

組織特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，、、和均在莖中的表達(dá)量最高；在根中的表達(dá)量最高；在葉中的表達(dá)量最高；在各組織中表達(dá)差異不大（見圖7）。

圖7 PdbLTPs基因組織特異性表達(dá)模式分析Fig.7 PdbLTPs tissue specific expression pattern analysis

2.3 NaCl脅迫下PdbLTPs基因表達(dá)模式分析

NaCl 脅迫處理下基因表達(dá)量分析結(jié)果顯示，基因受鹽脅迫不同程度的誘導(dǎo)，且響應(yīng)鹽脅迫的時(shí)間不相同。其中基因表達(dá)量在NaCl 脅迫9 h 后高度上調(diào)表達(dá)，基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增長而不斷上調(diào)在NaCl 脅迫9 h 達(dá)到峰值。、、表 達(dá) 量 在NaCl 脅 迫6 h 時(shí) 達(dá) 到 峰 值，、基因表達(dá)量在NaCl 脅迫3 h 時(shí)表達(dá)上調(diào)，隨后其表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)?；蛟贜aCl 脅迫3 h 時(shí)下調(diào)，隨著脅迫時(shí)間變長，其表達(dá)量上調(diào)并在NaCl脅迫24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值（見圖8）。說明基因響應(yīng)鹽脅迫，響應(yīng)模式不同。

圖8 NaCl脅迫處理下PdbLTPs基因表達(dá)模式分析Fig.8 Expression pattern analysis of PdbLTP genes under NaCl stress

2.4 PEG 脅迫處理下PdbLTP 家族基因表達(dá)模式分析

PEG 脅迫處理下家族基因表達(dá)量分析結(jié)果顯示：家族基因的表達(dá)對PEG 脅迫處理均有不同程度的應(yīng)答。其中，和基因具有相似的表達(dá)模式，其表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間變長而不斷上調(diào)，在PEG 脅迫9 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到峰值?；虮磉_(dá)量在PEG 脅迫24 h時(shí)表達(dá)量最高，、基因表達(dá)量隨著PEG 脅迫時(shí)間變長而下調(diào)。的表達(dá)量在PEG 脅 迫 處 理24 h 時(shí) 最 高，和基因具有相似的表達(dá)模式，在PEG 脅迫處理9 h 時(shí)出現(xiàn)特異表達(dá)高峰。的表達(dá)變化不顯著。結(jié)果說明，家族基因可以不同程度響應(yīng)干旱脅迫（見圖9）。

圖9 PEG脅迫處理下PdbLTPs基因表達(dá)模式分析Fig.9 Expression pattern analysis of PdbLTP genes under PEG stress

3 討論

高等植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP 是一種分子量為3～9 kDa 的小分子堿性蛋白，占可溶性蛋白的4%左右。這種在植物的細(xì)胞膜上可以與脂質(zhì)特異性結(jié)合的蛋白在植物中一直發(fā)揮著不可替代的調(diào)控作用，相關(guān)研究已經(jīng)表明，在LTP 蛋白的三級結(jié)構(gòu)中有一個(gè)獨(dú)立的疏水腔，可能用以實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。有研究顯示LTP 參與疏水性相互作用，對細(xì)胞壁擴(kuò)張產(chǎn)生重要的影響。本研究對PdbLTP 的親水性預(yù)測分析結(jié)果也顯示該蛋白為疏水性蛋白。其高級結(jié)構(gòu)存在疏水腔結(jié)構(gòu)，說明山新楊LTP 蛋白具有LTP 家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征，在參與疏水性相互作用，利用疏水腔進(jìn)行脂質(zhì)跨膜運(yùn)輸中具有一定功能。進(jìn)化樹分析顯示，基 因 分 別 與、、及耐鹽基因具有較高同源性，研究顯示白樺（）基因和小麥基因具有耐鹽性，因此推測基因具有耐鹽功能。

為了進(jìn)一步分析山新楊基因可能參與的功能，對其進(jìn)行了不同組織的響應(yīng)重力刺激，響應(yīng)鹽和旱脅迫的表達(dá)模式分析。曾有學(xué)者研究過水曲柳（Rupr.）的基因，發(fā)現(xiàn)基因在木質(zhì)部的表達(dá)量最高時(shí)對應(yīng)拉處理有響應(yīng)。對毛果楊（Torr.&Gray）應(yīng)拉木中特異表達(dá)的基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在一定程度上參與木質(zhì)部發(fā)育調(diào)控。之前有研究者對光皮樺（H.Winkl.）基因進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基因在莖表達(dá)量較低時(shí)，應(yīng)拉木相關(guān)檢測數(shù)值顯著低于直立木。本實(shí)驗(yàn)對基因進(jìn)行重力處理表達(dá)模式分析，結(jié)果顯示、、、在應(yīng)拉木中的表達(dá)量最高。對組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié) 果 表 明、、、均在莖中的表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)量最高，和在葉中的表達(dá)量最高。在重力刺激下，表達(dá)量變化不明顯的與，在莖中的表達(dá)量也較低，這符合上述研究的表達(dá)規(guī)律，而、、則很可能影響莖與木質(zhì)部的發(fā)育過程。有人曾經(jīng)就沙柳（）的基因組織特異性表達(dá)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)量在某些部位高表達(dá)時(shí)的確與發(fā)育有一定聯(lián)系。

劉群等對臘梅（）葉片中3 個(gè)基因應(yīng)答非生物脅迫的情況進(jìn)行了qRT-PCR 分析和比較，發(fā)現(xiàn)這些基因受干旱與Na‐Cl 處理的影響程度不同，李倩發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性有明顯提高，表明小麥基因與植物的高鹽脅迫耐性相關(guān)。PEG 脅迫對同一植物的不同器官影響不同，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，一些植物對PEG 脅迫做出一定程度上的響應(yīng)，而這往往與其所含有的基因蛋白有關(guān)，比如小麥干旱響應(yīng)蛋白WZY2 與WZY3-1，和大豆（）中的GsPIP1-4 蛋白對干旱條件的響應(yīng)，還有楊樹（spp.）的多聚泛素蛋白對干旱的響應(yīng)。本研究利用qRT-PCR 分析基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)雖然不同基因在響應(yīng)兩種脅迫的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間均有不同程度的差異，但最終都表明基因的表達(dá)響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫。這進(jìn)一步說明基因家族中的多個(gè)基因都參與到植物的耐鹽和耐旱調(diào)控中。

結(jié)合聚類分析的結(jié)果可以看出，系統(tǒng)進(jìn)化上聚為一組的基因具有相似的表達(dá)模式，如、、聚為一組，它們在受到人工彎曲和重力刺激時(shí)響應(yīng)表達(dá)，在木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)組織高度表達(dá)，在鹽脅迫和干旱脅迫下受誘導(dǎo)。、、聚為一組，他們在應(yīng)力木中變化不顯著，在木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)組織中表達(dá)量較低，在鹽脅迫條件下，和在處理6 h出現(xiàn)特異表達(dá)高峰。說明聚為一組的基因具有相似的表達(dá)模式，乃至可能具有相似功能。、、和木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)，且在環(huán)境刺激（鹽、旱脅迫）中起到一定的調(diào)節(jié)作用。、、則是另外響應(yīng)模式的鹽響應(yīng)基因。

本研究對山新楊家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及其表達(dá)模式分析，分析家族基因中不同基因的不同序列特征及每一種成員潛在的功能，增加對這一類廣泛存在的植物基因家族的了解，為林木優(yōu)質(zhì)、抗逆育種等研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對山新楊基因的生物信息學(xué)研究以及對其表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)PdbLTPs 蛋白具有疏水性，不存在跨膜區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示PdbLTPs 蛋白與已知抗逆相關(guān)的LTP 進(jìn)化關(guān)系較近。在山新楊莖中表達(dá)量較高，且受人工彎曲和重力刺激誘導(dǎo)，在應(yīng)拉木中高度表達(dá)，這些基因與木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)。大部分基因?qū)aCl和PEG 處理下的逆境有不同程度的響應(yīng)，表明基因很可能作為重要因子參與植物抗逆響應(yīng)的過程，提高植物抗逆的能力。