中藥藥用活性成分的生物合成研究進(jìn)展

李清清 劉志齋張潔 徐德林?

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)， 貴州 遵義563099； 2.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 重慶400715； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所， 四川 成都610061）

中醫(yī)藥是我國的瑰寶，在我國數(shù)千年的歷史長河中對人類的健康有著決定性作用。中藥防治和干預(yù)疾病時發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)就是藥用植物中的藥用活性成分，這些活性成分主要包括生物堿類、甾體類、多酚類、萜類等，是植物進(jìn)行次生代謝產(chǎn)生的復(fù)雜化合物，也是中藥治療疾病的根本。在植物細(xì)胞、組織等的分化與完善過程中，這些次生代謝產(chǎn)物在特定的部位逐漸積累，但是總含量較低，因而入藥部位少，藥用成本高。采用化學(xué)法合成植物的復(fù)雜次生代謝產(chǎn)物，存在合成步驟繁瑣、合成成本高、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，使得藥用植物生物活性成分無法大量人工合成。而合成生物學(xué)方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、綠色環(huán)保、周期短等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代新藥的創(chuàng)新途徑，具有獨(dú)特的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿?。合成生物學(xué)的發(fā)展為藥用植物活性成分的研究注入新的動力，對于藥用植物活性成分的生物合成研究也取得了巨大進(jìn)展，本文對藥用植物活性成分在合成生物學(xué)上的研究進(jìn)展做概括介紹，以期為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 中藥藥用活性成分

藥用植物的治療潛力是由于其存在一些生物活性成分，如單寧、萜類、生物堿、類黃酮等小分子化合物。單寧具有收斂、消炎、止瀉、抗氧化、抗菌等生理活性，可加速傷口和發(fā)炎黏膜的愈合。萜類化合物存在多種類別，有單萜、二萜、倍半萜等，大多具有清除自由基、消除炎癥、防治腫瘤、降血糖、抗膽堿酶等活性，對預(yù)防和治療癌癥、減少炎癥發(fā)生、治療呼吸道疾病、治療糖尿病等都有重要價值。生物堿具有防治瘧疾、哮喘、癌癥、心律失常、高血糖、鎮(zhèn)痛等作用，在傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中廣泛使用，亦可作為藥物發(fā)現(xiàn)的起點(diǎn)。有些生物堿還是興奮劑類精神活性藥物，可用于創(chuàng)傷治療。類黃酮也具有抑菌、抗病毒、防治癌癥、清除自由基、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、止痛、鎮(zhèn)痛等作用。

中藥起作用的根本保證是藥用活性成分，這些活性成分也是開發(fā)新藥的源頭［1?2］。藥用活性成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量少，化學(xué)方法合成難度大，甚至?xí)茐纳鷳B(tài)環(huán)境，而且許多中藥材的生長還受土壤、季節(jié)等生態(tài)環(huán)境因素限制，部分珍稀中藥材的生長周期長，其活性成分更是無法大量獲取，科研和新藥的大量需求是傳統(tǒng)提取方法或化學(xué)合成法無法滿足的，合成生物學(xué)方法將有效解決這一矛盾［3］。

2 合成生物學(xué)應(yīng)用于藥用活性成分富集的研究概況

合成生物學(xué)是21 世紀(jì)新興的一門學(xué)科，是在基因工程、代謝工程等學(xué)科的基礎(chǔ)上形成的整合學(xué)科。合成生物學(xué)以生物學(xué)為基礎(chǔ)，融入工程學(xué)的模塊化與系統(tǒng)設(shè)計理念，以達(dá)到人工改造并優(yōu)化生物合成過程中有關(guān)的生物元件，或者合成全新的具有定向性能的新生物體的元件、器件或模塊，設(shè)計更加系統(tǒng)穩(wěn)定的生物體系的目的。由此形成的合成生物體系將在能源、醫(yī)學(xué)、材料、環(huán)境、天然化合物等領(lǐng)域達(dá)到規(guī)模化應(yīng)用。合成生物學(xué)是生命發(fā)展過程中人類第1 次將生命科學(xué)工程化的學(xué)科［4］。合成生物學(xué)的內(nèi)容包括合成生物學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計與組裝、調(diào)控與優(yōu)化，在生物合成系統(tǒng)設(shè)計上主要包括底盤細(xì)胞的選擇、合成生物系統(tǒng)所需元件和途徑挖掘、計算機(jī)輔助的設(shè)計與分析、生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建與組裝等方面。系統(tǒng)的調(diào)控優(yōu)化主要是在基因組水平上的全局優(yōu)化以及單點(diǎn)的調(diào)控與優(yōu)化，系統(tǒng)優(yōu)化包括單一基因的優(yōu)化、多基因途徑的組合優(yōu)化、基因組簡化和重構(gòu)、生物合成系統(tǒng)的分析與篩選、“設(shè)計→構(gòu)建→檢驗(yàn)→重設(shè)計”的特征循環(huán)等方面。

生物合成是生物體內(nèi)同化反應(yīng)的總稱，具有不同的生理意義，包括①提供生物體生長發(fā)育和繁殖所必要的物質(zhì)；②在正常狀態(tài)下，對消耗掉的物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充；③為長期和短期的貯藏進(jìn)行必要的合成。生物合成有由主要原料進(jìn)行從頭合成的全合成途徑（如光合作用等），也有可逆性的廢物利用途徑，由部分分解產(chǎn)物合成（如嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)換）。生物合成的各個途徑之間可能存在相互作用，在生物體中受到復(fù)雜的調(diào)控［5］。

生物合成通過標(biāo)準(zhǔn)化的生物模塊，構(gòu)建起具有詳細(xì)生物學(xué)特征的元件后轉(zhuǎn)入底盤細(xì)胞，通過重新構(gòu)建代謝合成途徑，實(shí)現(xiàn)定向高效的異源合成，使代謝工程的改造效率大幅提高，亦可使生物學(xué)系統(tǒng)變得更加豐富［6］，具有標(biāo)準(zhǔn)性、簡便性的特點(diǎn)。合成生物學(xué)策略主要有4種，分別為①表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物，即通過微生物宿主使目標(biāo)產(chǎn)物的基因?qū)崿F(xiàn)異源表達(dá)；②改進(jìn)生物合成途徑，即將新的生物元件或基因引進(jìn)生物合成途徑，重新組織構(gòu)建或延伸原有的生物合成途徑；③雜合生物合成途徑在合適的底盤細(xì)胞中的表達(dá)；④人工設(shè)計構(gòu)建目標(biāo)化合物的基因，在合適的底盤細(xì)胞中完成基因的表達(dá)［7］。底盤細(xì)胞即人為在細(xì)胞中構(gòu)建生物系統(tǒng)，使其具有特定功能的細(xì)胞，如大腸桿菌、煙草細(xì)胞等一些微生物和植物細(xì)胞。

基于合成生物學(xué)的特點(diǎn)，天然產(chǎn)物尤其是有明確藥理活性的單體化合物的研究，在合成生物學(xué)出現(xiàn)后獲得了全新的機(jī)遇。中藥藥用活性成分的大量獲取在極大程度上可依賴合成生物學(xué)，其在藥用活性成分生物合成中的操作包括選擇優(yōu)良的底盤細(xì)胞并對其進(jìn)行改造（如敲除細(xì)胞中的冗余基因、將基因組整合到底盤細(xì)胞中人為組裝構(gòu)建新的目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑、對合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控、通過宿主細(xì)胞構(gòu)建異源合成途徑等），進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化并結(jié)合發(fā)酵工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)藥用活性成分的定向高效合成（如青蒿素的微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)等）［8］。目前，許多研究已經(jīng)通過DNA 重組技術(shù)順利構(gòu)建擁有高附加值的微生物工程菌株，包括紫杉醇前 體［9］、丹參酮［10］、人參皂苷［11］、阿 片類［12］、姜黃素［13］、鼠尾草酸［14］等化合物。形成一套藥用植物合成生物學(xué)研究策略［15］，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高效生產(chǎn)，從而滿足人們對藥用植物資源中活性成分的大量需求，這將對藥用植物資源的可持續(xù)利用，提升我國研發(fā)創(chuàng)新性藥物的能力和國際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心競爭力都有很大幫助。

3 中藥藥用活性成分生物合成中的關(guān)鍵技術(shù)

3.1 基因元件的設(shè)計改造 基因元件是具備特定功能的核苷酸序列，是生物體中最基本、最簡單的單元，包含啟動子、增強(qiáng)子、功能蛋白、酶編碼基因等，對基因的表達(dá)調(diào)控有非常重要的意義。這些元件在天然生物中分離得到后，經(jīng)過人工組合、完善、優(yōu)化后可得到新的生物元件。李雷等［16］通過易錯PCR 法對啟動子進(jìn)行突變，結(jié)合基因改組的蛋白工程技術(shù)，改造釀酒酵母的TEFl 啟動子，建立突變啟動子庫，得到一系列強(qiáng)度不同的突變啟動子。簡單的生物元件還可以通過多種多樣的組合，在更大規(guī)模的設(shè)計中形成復(fù)雜的具有特定功能的生物元件和裝置。例如將效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、RNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)和單鏈RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行組合獲得新的功能元件，實(shí)現(xiàn)對基因功能的調(diào)控［17］。通過基因編輯技術(shù)對生物體中基因元件進(jìn)行精確的修改編輯，也可獲得具有新功能的生物元件，例如鋅指核酸酶（ZFN），即為工程化體內(nèi)具有DNA 序列結(jié)合特異性鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域構(gòu)建新的可識別特異序列的核酸酶［18］，而現(xiàn)在只有丹參酮［19?21］、紫杉醇［22?23］、青 蒿素［24?25］、人參皂苷［26?27］等少部分藥用活性成分的代謝通路研究比較透徹，大多數(shù)藥物活性成分的代謝途徑還在研究和發(fā)現(xiàn)中，隨著中藥藥用活性成分相關(guān)途徑的不斷解析，應(yīng)用于合成生物學(xué)的基因元件也將得到補(bǔ)充。因此，目前研究的重要任務(wù)之一是對相關(guān)生物合成途徑的解析以及基因調(diào)控元件的發(fā)掘。

3.2 底盤細(xì)胞的選擇和改造 合成生物學(xué)可以使底盤細(xì)胞具有人類需要的特定生物功能，這些底盤細(xì)胞除了要具備自我復(fù)制和代謝能力，還應(yīng)具備生長周期短、遺傳背景清晰、易于培養(yǎng)、能通過人工設(shè)計調(diào)控元件優(yōu)化原有代謝網(wǎng)絡(luò)提升合成效率等特征。近年來，大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、釀酒酵母、煙草細(xì)胞等微生物和一些植物被廣泛用作異源合成的底盤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成以及某些特定類型的化合物合成，如以酵母為底盤細(xì)胞異源合成丹參酮［10］、以煙草細(xì)胞為底盤合成青蒿素［28］。

一般來說，底盤細(xì)胞本身不能進(jìn)行繁復(fù)的次生代謝，必須對相應(yīng)底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)施行優(yōu)化，才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的異源合成。為了解除合成途徑中的某些制約，增加目標(biāo)產(chǎn)物合成效率，有2 種策略可以對合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行改造優(yōu)化，一種優(yōu)化方式是“自上而下”地從頭合成基因，另一種方式是“自下而上”地逐步敲除冗余基因［29］。

構(gòu)建異源合成系統(tǒng)的過程中，異源合成途徑時常會導(dǎo)致某些有毒中間物的積累，制約合成產(chǎn)物的輸送，使代謝途徑中能量流動不均勻，目標(biāo)產(chǎn)物合成過程中沒有適合的前體供給，嚴(yán)重擾亂底盤細(xì)胞原有的生命活動。因此，底盤細(xì)胞的優(yōu)化關(guān)鍵在于分配好目標(biāo)產(chǎn)物合成過程中的物質(zhì)、信息和能量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物合成和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)化。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等物種的全基因代謝網(wǎng)絡(luò)模型［30］被建立，通過代謝網(wǎng)絡(luò)通量分析的方法模擬預(yù)測底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而使目標(biāo)產(chǎn)物的合成得到優(yōu)化［31］。對底盤細(xì)胞基因組的改造賦予了細(xì)胞工廠全新的生物學(xué)功能和發(fā)展前景，如大腸桿菌等基因組的人為重建和優(yōu)化［29］，不僅對基因組的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用等研究有了新的認(rèn)識，也為構(gòu)建復(fù)雜天然化合物的細(xì)胞工廠提供指導(dǎo)，從而選擇最佳的底盤細(xì)胞代謝合成途徑，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成優(yōu)化。

3.3 代謝途徑的構(gòu)建策略 生物體代謝途徑是由酶催化的復(fù)雜動態(tài)平衡網(wǎng)絡(luò)，中藥合成生物學(xué)中有2 種構(gòu)建代謝途徑的策略用于合成藥用活性成分。一種是在已經(jīng)闡明的生物合成代謝途徑上，對原本存在的代謝途徑進(jìn)行重新構(gòu)建和工程化，這又可以分為3 個層次［32］，分別為①通過底盤細(xì)胞本身的前體供應(yīng)途徑，應(yīng)用基因工程技術(shù)生成目標(biāo)產(chǎn)物；②通過模塊化的設(shè)計理念和基因工程原理，定向改造并優(yōu)化合成路徑，結(jié)合底物調(diào)控模塊使目標(biāo)產(chǎn)物高效合成；③對代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，通過可拆卸的基因調(diào)控元件構(gòu)建不同的活性模塊，優(yōu)化模塊中的元件［33］，組裝形成不同的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［34］，將復(fù)雜的生物合成途徑變得工程化。另一種策略是設(shè)計構(gòu)建一條全新的藥用活性成分合成途徑，根據(jù)目標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)從基因數(shù)據(jù)庫中將相應(yīng)酶基因篩選出來，人為改造并導(dǎo)入底盤細(xì)胞，可在底盤細(xì)胞中程序化形成一條新的異源代謝途徑。

3.4 生物合成工藝的優(yōu)化 目標(biāo)化合物的代謝途徑并不是一成不變的，而是相互交錯而成的動態(tài)平衡網(wǎng)絡(luò)，需要在已有代謝途徑的基礎(chǔ)上整體進(jìn)行改進(jìn)與創(chuàng)新，提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成率，這可從3 個方面進(jìn)行［32］，分別為①優(yōu)化生物合成路線，提高工程菌株生物合成途徑的效率，方法包括增加前體的供應(yīng)、增加生物合成路徑所需底物的絕對總量以及提高藥用活性成分合成的特定途徑中的單個基因的表達(dá)效率和途徑酶的工作效率；②減少或限制競爭代謝途徑流入，使相對多的底物進(jìn)入藥用活性成分合成的特異代謝途徑；③生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的整體調(diào)控，主要方法是結(jié)合生物信息分析，以一種系統(tǒng)的觀點(diǎn)對合成途徑中的調(diào)控進(jìn)行數(shù)學(xué)描述，反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)中的控制，如代謝流控制分析、代謝流量優(yōu)化等。中藥藥用活性成分對細(xì)胞大多都有一定的毒性，對細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以有效提高細(xì)胞性能［35］，增加產(chǎn)物對細(xì)胞的耐受性，有利于整個代謝網(wǎng)絡(luò)的協(xié)調(diào)，同時增加藥用活性成分的生物合成。

4 常用藥用活性成分的生物合成研究概況

中藥活性成分多屬于植物次生代謝產(chǎn)物，類型較多，有4 條主干合成途徑，分別為莽草酸途徑、氨基酸途徑、乙酸?丙二酸途徑（AA?MA 途徑）、甲戊二羥酸途徑（或稱賈瓦龍酸途徑，MVA 途徑）。

4.1 生物堿的生物合成 生物堿是生物體內(nèi)次級代謝產(chǎn)生的一大類復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，主要有多烴類、莨菪烷類、嘌呤類、托品烷類等多種結(jié)構(gòu)類別，其中托品烷生物堿具備抗膽堿等多種生物活性，主要是茄科、毛茛科等雙子葉類高等植物次級代謝產(chǎn)生的一類復(fù)雜化合物，具有悠久的藥用歷史。植物中腐胺是托品烷生物堿合成的前體，以鳥氨酸或精氨酸開始，經(jīng)過相應(yīng)酶的催化最終合成腐胺，這2 條腐胺的生物合成途徑已經(jīng)得到闡明［36］。這2 條途徑在不同植物中對產(chǎn)物合成的貢獻(xiàn)不同，但其合成的次生代謝產(chǎn)物都具有物種特異性。托品烷生物堿的生物合成途徑也已有部分得到解析，N?甲基?腐胺轉(zhuǎn)移酶（PMT）是托品烷生物堿合成途徑中起作用的第一個酶，其是否為限速酶與物種有關(guān)。經(jīng)N?甲基腐胺氧化酶（MPO）催化最終可形成在各代謝途徑中發(fā)揮中心作用的活性N?甲基?△1?吡咯啉正離子，可以在植物體中參與一些反應(yīng)生成托品酮，它是合成莨菪堿的前體，也是托品烷生物堿途徑特有的二環(huán)結(jié)構(gòu)。托品酮還原酶分為托品酮還原酶Ⅰ、托品酮還原酶Ⅱ，它們的酶活性可以直接影響托品烷生物堿的含量，也可以通過影響底物托品酮含量間接地影響托品烷生物堿的含量，這2 種托品酮還原酶的酶活性還會使代謝流的走向受到調(diào)控［37］。生物體內(nèi)存在的其他代謝途徑也會調(diào)控托品烷生物堿的生物合成，人為對相關(guān)信號途徑進(jìn)行設(shè)計改造也可能會間接地調(diào)節(jié)托品烷生物堿的合成和積累［38］。

托品烷生物堿生物合成途徑中的相關(guān)反應(yīng)步驟以及涉及到的酶基因尚未完全研究清楚，例如1?甲基?△?吡咯啉正離子生成前體托品酮的反應(yīng)是如何進(jìn)行的？苯丙酮酸生成苯乳酸是如何還原的以及限速步驟和限速酶都有哪些？雖然不同植物中對托品烷生物堿合成的調(diào)節(jié)是物種特異的，但是所有植物中的托品烷生物堿天然合成途徑卻是相同的。托品烷生物堿生物合成途徑中的基因片段、關(guān)鍵酶、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制以及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等還有待進(jìn)一步探索，目前相關(guān)的研究工作正在積極有序地開展。

4.2 萜類化合物的生物合成 萜類化合物是以C5為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其含氧和不同飽和程度的衍生物，包括類胡蘿卜素、紫杉醇、丹參酮等，是中草藥中重要的化合物，萜類化合物的通用合成途徑已經(jīng)基本闡明［39］。類胡蘿卜素是萜類化合物的代表之一，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌4?磷酸甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑的5 個基因（dxr、ispD、ispE、ispG、ispH）中，過表達(dá)ispG下游的ispH基因可以使β?胡蘿卜素產(chǎn)量提高73%，ispG、ispH基因的協(xié)同表達(dá)是MEP 途徑中重要限速步驟之一［40］，該研究對解析MEP 途徑的調(diào)控機(jī)制和通過微生物細(xì)胞工廠大量生產(chǎn)萜類化合物具有重大意義。

紫杉醇是紅豆杉Taxus baccataLinn.次生代謝產(chǎn)生的二萜類化合物，具有高效、低毒的特點(diǎn)，且抗癌活性良好。紫杉醇的生物合成大致可以分為3 個步驟［28］，分別為①紫杉烷環(huán)母核的合成，植物中所有萜類合成的共同代謝前體是異戊二烯，沿著異戊二烯代謝途徑先合成紫杉烷骨架［紫杉?4（5），11（12）?二烯］，該步驟以4 個異戊二烯分子縮合生成的雙（牻牛兒基）二磷酸鹽（GGPP）作為起點(diǎn)，反應(yīng)酶為紫杉二烯合成酶，最后環(huán)化為紫杉二烯；②骨架上的官能團(tuán)反應(yīng)，在紫杉二烯骨架上的相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生羥基化等一系列的官能團(tuán)反應(yīng)，最終生成化合物巴卡亭Ⅲ，它作為直接前體參與到紫杉醇的代謝合成途徑中；③合成紫杉醇的側(cè)鏈，側(cè)鏈在氨基變位酶的催化下生成，卻是分2 步連接的，在?；D(zhuǎn)移酶的催化下先形成N?苯甲酰紫杉醇，再經(jīng)過羥基化修飾和苯甲酰化修飾生成紫杉醇。關(guān)于紫杉醇詳細(xì)的合成過程和反應(yīng)機(jī)理以及相關(guān)酶基因還沒有研究完全，要通過生物合成實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)紫杉醇還要不斷努力。目前，通過紫杉醇的抗腫瘤生物活性，研制出了很多新型制劑，包括聚合物膠束、納米顆粒、藥物前體等［41］，但在療效方面還有待提高。

丹參酮是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.中的一種有效成分，是二萜醌類化合物，與其他二萜類化合物一樣，以MEP 途徑或MVA 途徑這2 條萜類化合物通用前體合成途徑為起點(diǎn)，參與其中的重要酶包括一系列的焦磷酸合酶、細(xì)胞色素P450 家族蛋白CYP76AH1等，中間產(chǎn)物包括共同前體GGPP、半日花二烯／古巴基二磷酸酯（CPP）、丹參酮二烯、鐵銹醇、次丹參酮等，最后合成丹參酮類化合物［42］。在認(rèn)識生物合成途徑的基礎(chǔ)上，熊丙全等［43］以茉莉酸甲酯為誘導(dǎo)子，研究丹參毛狀根毛中次生代謝途徑的調(diào)控，結(jié)果表明，誘導(dǎo)后丹參酮Ⅰ的含量提高到1.53倍，丹參酮ⅡA的含量提高到1.16 倍；丹參中的另一種活性成分酚酸類化合物，相比于未誘導(dǎo)時，迷迭香酸的含量提高到1.37倍，丹酚酸B 的含量提高到4.43倍，提示茉莉酸甲酯參與丹參毛狀根中丹參酮類化合物代謝途徑的調(diào)控，對丹參酮類和酚酸類活性成分的積累具有正效應(yīng)。Guo 等［10］對丹參酮的生物合成途徑進(jìn)行研究，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)篩選得到2 個細(xì)胞色素氧化酶P450 基因（CYP76AH3、CYP76AK），將這2 個功能基因引入設(shè)計好的底盤細(xì)胞中，得到的酵母工程菌株能同時產(chǎn)生6 種二萜類代謝產(chǎn)物，這為生物體中丹參酮生物合成途徑的闡明、代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控、關(guān)鍵酶基因的研究、微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)等奠定基礎(chǔ)。Shi 等［44］研究表明，從丹參（原變種）Salvia miltiorrhizaBunge 毛狀根中克隆了2 個新基因SmJAZ3、SmJAZ9，這2 個基因在代謝途徑中調(diào)控丹參酮的生物合成，在茉莉酸信號途徑中起抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的作用。Pei等［45］提出SmJAZ8 基因作為茉莉酸誘導(dǎo)的丹酚酸和丹參酮生物合成中負(fù)反饋回路控制器的新作用，SmJAZ8 基因的遺傳轉(zhuǎn)化改變了其他SmJAZ基因的表達(dá)，表明在茉莉酸調(diào)控的次級代謝中發(fā)生串?dāng)_跡象，為將來詳細(xì)研究其分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。張建紅等［46］采用RT?PCR 法、生物信息學(xué)分析、遺傳轉(zhuǎn)化、化學(xué)檢測、代謝組學(xué)分析等研究過表達(dá)丹參毛狀根中SmCYP81C16 基因，結(jié)果表明，SmCYP81C16對丹參酮的生物合成有正向調(diào)控作用，為丹參酮類化合物的高效生物合成奠定基礎(chǔ)。

4.3 黃酮類化合物的生物合成 黃酮類物質(zhì)是自然界中絕大多數(shù)植物都含有的一類含氧雜環(huán)的化合物，對植物的生長發(fā)育、抗菌防病等有重要作用，其基本碳骨架為C6?C3?C6，在植物中通常和糖結(jié)合形成苷類，是一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物［47］，此類物質(zhì)具有抗氧活性、抗病毒能力、抗血管硬化、免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、防治腫瘤等藥理活性，甚至有些具備抗HIV 病毒的生理活性［48］。目前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已經(jīng)多達(dá)4 000種，是許多中草藥的活性成分［49］。

黃酮類化合物的生物合成途徑以苯丙氨酸為起點(diǎn)，特點(diǎn)是具有2 個苯環(huán)，由中央3 個碳原子相互連接生成二氫黃酮類具有C6?C3?C6結(jié)構(gòu)的基本骨架，通過分支途徑合成黃酮、花色素等。Zhang 等［50］以番茄作為底盤細(xì)胞構(gòu)建黃酮類化合物的異源合成途徑，將擬南芥中AtMYB12 等基因進(jìn)行過表達(dá)，將黃酮醇等化合物的含量增加到100 mg／g。Li 等［51］以大腸桿菌為底盤細(xì)胞人為設(shè)計一條黃酮合成途徑，通過表達(dá)PAL、FNSI、4CL以及短SbF6H等不同物種的基因，使黃芩素、野黃芩素含量達(dá)到8.5、47.1 mg／L。通過對合成途徑進(jìn)行優(yōu)化，提高丙二酰輔酶A 的利用率，使黃芩素、野黃芩素含量增加到23.6、106.5 mg／L，為黃酮的生物合成提供新的方式。何江等［52］對新塔花中黃酮類化合物的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PAL、CHS、CHI、FNS這4 個基因在合成過程中起重要調(diào)控作用，為研究黃酮類化合物生物合成途徑中的其他酶基因奠定基礎(chǔ)。酶學(xué)研究方法和同位素原子示蹤法等科學(xué)方法的發(fā)展應(yīng)用將推動黃酮類次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑的解析、途徑酶以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

5 展望

本文基于紫杉醇、丹參酮、黃酮等藥用活性成分生物合成途徑的闡明和基因的研究進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)通過底盤細(xì)胞構(gòu)建生物合成途徑能夠合成一些重要的中間代謝產(chǎn)物或前體物質(zhì)，使得藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量都有不同程度的提高，體現(xiàn)出合成生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢。但是這些活性成分有著復(fù)雜的合成步驟，至今尚未完全解析。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，中藥活性成分的生物合成途徑、調(diào)控機(jī)制不斷被闡明，相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、P450 酶等基因元件的研究也在不斷深入，這將為藥用活性成分的細(xì)胞工廠生產(chǎn)提供新的策略和生物元件，對藥用活性成分的生物合成具有重大意義。藥用活性成分的生物合成在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方面有很大上升空間。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)等的發(fā)展，通過合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步挖掘中藥活性成分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥用活性成分的大量合成，為傳統(tǒng)中藥注入新的活力，提升我國研發(fā)創(chuàng)新性藥物的能力和國際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。