4種脾虛造模法的橫向?qū)Ρ妊芯?

王啟航，陸瑞敏，陳萌，張冬梅

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

隨著社會的發(fā)展，人們壓力增大、飲食不規(guī)律等問題日益增多，結(jié)合暖期多虛寒的疾病譜特征[1]，致當(dāng)代脾胃疾病多發(fā)。而脾氣的健運與否也很大程度決定了人體健康與否。在越來越重視“治未病”的今天，展開脾胃生理功能、脾虛發(fā)生機制的研究，無疑有著重要的時代意義。中醫(yī)造模實驗是一種現(xiàn)代形式的“比類取象”，它使整個生物科學(xué)成為了中醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)[2]，研究脾虛動物模型是研究脾胃理論的理想切入點。有關(guān)脾虛模型的復(fù)制方法逐漸多樣化、復(fù)雜化[3]，但是缺少模型間的橫向?qū)Ρ燃皩?dǎo)致脾虛的病因探討。有鑒于此，筆者復(fù)制了苦寒瀉下、飲食失節(jié)、勞倦過度、利血平注射4種經(jīng)典脾虛模型，并從宏觀、免疫、消化、血液、線粒體功能角度進行系統(tǒng)評價以比較模型損傷程度及適用性，希冀為脾虛的發(fā)生機制提供研究價值。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性昆明小鼠100只，體質(zhì)量18～22 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證編號SYXK2019-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。

1.2 藥物與試劑 番瀉葉配方顆粒150 g，北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院；利血平粉末（RH45599-1）購于北京百諾威生物科技有限公司；冰乙酸（20180911）購于天津市富宇精細化工有限公司；血清D-木糖檢測試劑盒（20180504）購于南京建成生物工程研究所；Trizol（A8404-1）購于 Invitrogen公司；SYBR Premix EX TaqII Kit（AK2901）、Prime Script TMR Treagent Kit（AK2003）購于 TaKaRa公司；DEPCH2O（20190811）、磷酸鹽緩沖液（20190522）、PCR 引物（20190818）、TIA Namp Genomic DNA Kit（201900526）、DNaseI（20190928）、Promega（M610A）購于北京晶萊生物有限公司。

1.3 儀器設(shè)備 DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、MB10Kpw型電子天平（上海?？惦娮觾x器廠）、BC-2300型血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、精密電子天平（JA2003 SHP07003，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）、TU-1800S型紫外分光光度計、Scanspeed1730R型低溫離心機（Labogene公司）、Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀（Orbett Research公司）、EDTA抗凝血管（博士德生物工程有限公司）。

1.4 模型制備 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按如下分組，見表1。

表1 各組小鼠造模方法Tab.1 Modeling methods of mice in each group

記錄各組小鼠進食量、體質(zhì)量。造模持續(xù)10 d后，隨機取10只小鼠做相關(guān)指標(biāo)檢測，10只小鼠自然恢復(fù)10 d，觀察各組宏觀指標(biāo)的穩(wěn)定性。

1.5 宏觀指標(biāo)評價 記錄各組小鼠進食量、體質(zhì)量變化，觀察小鼠是否出現(xiàn)懶動、拱背、扎堆、瞇眼、毛色枯黃、毛色稀少、耳尾色白、腹面被毛憔悴、抓取無力掙扎、受驚動時無神、軟便、便溏、泄瀉、受激排便率增高等癥狀，出現(xiàn)某一癥狀記1分，對各組小鼠得分進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較宏觀體征得分[5]。

1.6 宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性評價 分別記錄脾虛模型造模結(jié)束后和自然恢復(fù)10 d后各組小鼠體質(zhì)量、進食量變化。然后，采用綁尾迫使小鼠強制游泳至力竭，游泳水溫為22℃，小鼠游泳以連續(xù)“冒泡”5次為力竭標(biāo)志，記錄游泳時長。

1.7 理化指標(biāo)檢測 造模結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，血液分析儀檢測紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）。4℃靜置2 h后，以5 000 r/min，4℃離心5 min，離心半徑18 cm，取上清，比色法測定血清D-木糖水平，操作按試劑盒說明進行。碘-淀粉酶比色法測定小鼠血清淀粉酶活性。記錄胸腺、脾臟質(zhì)量，計算胸腺、脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.8 mtDNA拷貝數(shù)及線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin mRNA的表達 采用實時熒光定量PCR法進行檢測。取1 mm3大小的新鮮肝組織若干塊，按TIA Namp Genomic DNA Kit說明書提取總DNA。根據(jù)SYBR Premix EX TaqII Kit說明書進行擴增，擴增程序為：95 ℃×60 s，（95 ℃×15 s，60 ℃×60 s）×40 個循環(huán)，以 β-actin 為內(nèi)參照，所得 CT 值按照 2-ΔΔCt的方法進行均一化處理后再進行統(tǒng)計分析，得出相對mtDNA拷貝數(shù)。引物序列如下，見表2。

表2 ND1 及 β-actin 引物序列（3′-5′）Tab.2 ND1 and β-actin primer sequences(3′-5′)

取適量組織，按Total RNA Extraction Kit說明書提取總RNA，DNaseI去基因組并用紫外分光光度儀檢測純度與完整性。根據(jù)Prime Script TMR Treagent Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA-20℃保存。按照mRNA/lncRNA qPCR Kit說明書進行擴增，擴增程序為：95 ℃×60 s，（95 ℃×10 s，58℃×30 s）×39 個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參照，將所得CT值按照2-ΔΔCt的方法進行均一化處理再進行統(tǒng)計分析，得出線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin mRNA水平。引物序列如下，見表3。

表3 Pink1、Parkin 及內(nèi)參引物序列（3′-5′）Tab.3 Pink1，Parkin，and the internal reference primer sequences(3′-5′)

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 24．0軟件處理。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)正態(tài)且方差齊多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，非正態(tài)或方差不齊組間比較采用非參數(shù)檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠宏觀指標(biāo)比較 與空白對照組相比，各組宏觀體征均有顯著變化（P＜0．05）。其中，利血平組宏觀體征得分最高，飲食失節(jié)組最低。與空白對照組相比，各造模組小鼠造模后體質(zhì)量與進食量平均值均有所下降（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，以利血平組差異明顯。綜上利血平組小鼠脾虛癥狀表現(xiàn)、進食量與體質(zhì)量變化最為顯著，飲食不節(jié)法因造模方法沖突故不參與統(tǒng)計。見表4。

表4 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)比較（±s）Tab.4 Comparison of macroscopic indicators in spleen deficiency mice（±s）

表4 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)比較（±s）Tab.4 Comparison of macroscopic indicators in spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

造模結(jié)束后體質(zhì)量（g）空白對照組 10 - 15．9 31．5±2．6苦寒瀉下組 10 12．30±0．3** 11．2 26．3±2．6*利血平組 10 13．40±0．2** 5．1 23．4±2．2**飲食失節(jié)組 10 8．80±0．2* - 27．8±2．5*勞倦過度組 10 11．20±0．3** 14．8 28．2±2．9*組別 動物數(shù) 宏觀體征得分造模結(jié)束后進食量（g）

2.2 各組小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較 自然恢復(fù)10 d后，與空白對照組相比，苦寒瀉下組、利血平組、飲食失節(jié)組體質(zhì)量仍未達到正常水平（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，勞倦過度組體質(zhì)量水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；各模型組小鼠進食量恢復(fù)并超出空白對照組水平，進食量發(fā)生“報復(fù)式”增長。其中，利血平組增長最多，苦寒瀉下組增長最少；造模結(jié)束后，苦寒瀉下組、飲食失節(jié)組、勞倦過度組小鼠游泳至力竭的時長均降低（P＜0．05），以利血平組與苦寒瀉下組差異顯著（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。自然恢復(fù)10 d后，苦寒瀉下組與飲食失節(jié)組小鼠仍有低于對照組的趨勢（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上苦寒瀉下組與飲食失節(jié)組小鼠癥狀更穩(wěn)定，飲食不節(jié)組與勞倦過度組因造模方法沖突故不參與統(tǒng)計。見表5。

表5 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較（±s）Tab.5 Comparison of macroscopic index stability in spleen deficiency mice（±s）

表5 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較（±s）Tab.5 Comparison of macroscopic index stability in spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P<0．01。

自然恢復(fù)10 d后游泳時長（min）空白對照組 10 30．6±2．4 35．7±2．4 16．4 17．3 9．2±2．4 11．3±4．3苦寒瀉下組 10 24．6±3．6* 30．6±2．4* 10．3 17．9 4．1±1．3** 7．9±3．4*利血平組 10 22．7±2．2** 29．9±3．2* 5．3 18．7 14．5±3．1** 11．5±4．6飲食失節(jié)組 10 25．2±3．0* 29．6±3．5* - - 6．1±2．8* 8．9±3．6*勞倦過度組 10 26．9±2．1* 34．3±2．6 16．2 18．6 - -組別 動物數(shù)造模結(jié)束后體質(zhì)量（g）自然恢復(fù)10 d后體質(zhì)量（g）造模結(jié)束后進食量（g）自然恢復(fù)10 d后進食量（g）游泳至力竭時長（min）

2.3 各組小鼠理化指標(biāo)比較 與空白對照組相比，各模型組小鼠血清D-木糖水平低于正常組（P＜0．05），說明各組造模成功；勞倦過度組胸腺指數(shù)下降最顯著（P＜0．05），其次是利血平組（P＜0．05），苦寒瀉下組變化最?。≒＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；利血平組脾臟指數(shù)下降最顯著（P＜0．05），苦寒瀉下組次之（P＜0．05），飲食失節(jié)組有所上升（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；血清淀粉酶活性均有所降低，變化以利血平組最為顯著（P＜0．01）；利血平組 RBC 下降最為明顯（P＜0．01），其次為苦寒瀉下組（P＜0．01），勞倦過度組有所上升（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；利血平組 WBC 下降最明顯（P＜0．05），其次為苦寒瀉下組（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；利血平組HGB下降最為顯著（P＜0．05），其次為苦寒瀉下組（P＜0．05），勞倦過度組有所上升（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，利血平組小鼠理化指標(biāo)變化明顯，其次為苦寒瀉下組。見表6。

表6 脾虛小鼠理化指標(biāo)比較（±s）Tab.6 Comparison of physical and chemical indexes of spleen deficiency mice（±s）

表6 脾虛小鼠理化指標(biāo)比較（±s）Tab.6 Comparison of physical and chemical indexes of spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

外周血指標(biāo)RBC（×1012/L） WBC（×109/L） HGB（g/L）空白對照組 10 5．14±0．12 2．98±0．27 4．96±0．19 718．94±15．49 7．37±0．59 6．42±0．93 139．47±13．74苦寒瀉下組 10 2．84±0．22** 2．72±0．34* 4．39±0．57* 633．28±17．58* 6．23±1．08* 5．73±1．29* 128．16±10．42*利血平組 10 2．12±0．26** 2．63±0．47* 4．17±0．62* 603．19±19．73** 5．93±1．16** 5．13±1．67* 120．95±11．73*飲食失節(jié)組 10 3．79±0．19* 2．80±0．41 5．87±0．51** 622．17±20．15** 6．43±0．93 6．23±0．85 126．45±14．94勞倦過度組 10 3．93±0．16* 2．54±0．33* 4．82±0．83 667．87±17．94 8．94±0．97* 5．43±1．36 148．74±12．69**組別 動物數(shù) 血清D-木糖水平（Inmol/L）胸腺指數(shù)（mg/g）脾臟指數(shù)（mg/g）血清淀粉酶（U/100 mL）

2.4 各組小鼠mtDNA拷貝數(shù)、Pink1、Parkin mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，飲食失節(jié)組mtDNA 拷貝數(shù)下降最為顯著（P＜0．01），其次苦寒瀉下組（P＜0．05），勞倦過度組下降較少（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；苦寒瀉下組Pink1mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低最為顯著（P＜0．01），其次飲食失節(jié)組（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；利血平組Parkin mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。綜上，飲食失節(jié)與苦寒瀉下組小鼠線粒體功能改變明顯。見表7。

表7 脾虛小鼠mtDNA相對拷貝數(shù)比較（±s）Tab.7 Comparative copy number comparison of mtDNA in spleen deficient mice（±s）

表7 脾虛小鼠mtDNA相對拷貝數(shù)比較（±s）Tab.7 Comparative copy number comparison of mtDNA in spleen deficient mice（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

組別 動物數(shù)mtDNA相對拷貝數(shù) Pink1 mRNA Parkin mRNA空白對照組 10 1．140±0．120 1．024±0．068 1．049±0．156苦寒瀉下組 10 0．840±0．220* 0．612±0．083**1．028±0．172利血平組 10 1．120±0．260 0．973±0．126 1．319±0．165*飲食失節(jié)組 10 0．790±0．190** 0．893±0．097*1．057±0．176勞倦過度組 10 0．930±0．160* 0．997±0．164 1．059±0．247

3 討論

中醫(yī)在臨床診斷中常常是司外揣內(nèi)的，常以乏力懶言，語聲低微，四肢沉重，形體消瘦，食欲不振，便溏或泄瀉等表現(xiàn)作為衡量患者是否是脾虛證的重要參考，并以癥狀的突出與否來判斷脾虛的輕重及亞型，故在中醫(yī)的實驗研究中，宏觀指標(biāo)也是動物模型評價的重要組成部分[6]。4種造模法都能成功復(fù)制脾虛癥狀，但是各個模型的癥狀輕重存在差異，利血平模型組癥狀重且覆蓋全面，但自然恢復(fù)快，模型穩(wěn)定性差；苦寒瀉下組癥狀表現(xiàn)方面次之，但模型穩(wěn)定性好；飲食不節(jié)模型組癥狀覆蓋同樣較為全面，癥狀穩(wěn)定但較為輕淺，可造模至20 d，勞倦過度模型組的脾虛癥狀輕淺且覆蓋不全面。

脾胃為氣血生化之源，脾的運化作用于血液質(zhì)量息息相關(guān)[7]，故脾虛證動物模型會出現(xiàn)血液質(zhì)量改變。近年來對脾虛模型評價的血液指標(biāo)主要包括：WBC、淋巴細胞、紅細胞比容、RBC平均血紅蛋白量等。脾主運化，脾虛證的主要表現(xiàn)之一為消化系統(tǒng)的功能低下，其中較為公認的是D-木糖代謝水平，該指標(biāo)可以衡量模型的吸收功能[8]。此外，血清淀粉酶也與消化功能關(guān)系密切?！八募酒⑼皇苄啊?，脾氣健運與否很大程度上決定了人體是否健康，脾與人體免疫功能密切相關(guān)[9]，脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的降低不僅直接表明脾家損傷模型小鼠的免疫功能降低，也間接說明了其淋巴細胞與巨噬細胞產(chǎn)生數(shù)目的減少。實驗表明，各模型組小鼠血清D-木糖水平和血清淀粉酶活性均下降，說明造模成功，脾虛小鼠存在消化功能低下的表現(xiàn)，以利血平與飲食失節(jié)組小鼠消化系統(tǒng)功能障礙突出。利血平組與苦寒瀉下組小鼠外周血的RBC、WBC、HGB顯著下降，說明利血平造模法和苦寒瀉下造模法對小鼠的血液質(zhì)量影響廣泛，而勞倦過度造模法對小鼠血液質(zhì)量的影響較小。利血平組和苦寒瀉下組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降非常顯著，說明利血平造模法和苦寒瀉下造模法對小鼠的細胞免疫和體液免疫功能均有顯著影響。飲食失節(jié)組小鼠脾臟指數(shù)上升，可能是脾家損傷小鼠表現(xiàn)出的病理性的脾腫大。勞倦過度組小鼠則只有胸腺指顯著下降，說明其細胞免疫功能降低。飲食失節(jié)造模法和勞倦過度造模法只對動物的部分免疫功能有影響。

脾主運化為生命活動提供能量，中醫(yī)脾的狀態(tài)影響生命活動狀態(tài)。而線粒體為細胞生命活動提供能量，這與脾的功能在某種程度上是相似的。有學(xué)者[10]認為脾主運化就是營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)進行的一系列氧化代謝所代表的“內(nèi)運化”過程。線粒體功能與mtDNA的數(shù)量密切相關(guān)，mtDNA下降超過閾值則發(fā)生線粒體功能障礙，介導(dǎo)線粒體自噬或誘發(fā)細胞凋亡[11]。Pink1、Parkin是介導(dǎo)并啟動線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白[12]。實驗結(jié)果顯示，除利血平組外，其他3種模型小鼠的mtDNA相對拷貝數(shù)下降，說明模型小鼠存在線粒體功能異常，以飲食失節(jié)組小鼠線粒體損傷程度最重。在線粒體損傷的進程中，mtDNA相對拷貝數(shù)會先升高再降低，利血平組小鼠的mtDNA相對拷貝數(shù)變化不顯著，可能是由于其線粒體損傷程度較輕，處于mtDNA相對拷貝數(shù)變化的中間階段。除勞倦過度組和利血平組外，其他兩種模型小鼠的Pink1 mRNA水平下降，表明脾虛損傷小鼠存在線粒體自噬功能的抑制，損傷的線粒體無法被及時清除，線粒體疾病和細胞凋亡發(fā)生的概率增加。與對照組相比，除利血平組外，其他3種模型小鼠的Parkin mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測脾虛損傷主要影響Pink1 mRNA水平，因為Pink1位于Parkin的上游，推測隨著脾虛損傷加重，模型小鼠的Parkin mRNA水平也將受到影響。與對照組相比，利血平組Parkin mRNA水平上升，可能是因為利血平組小鼠存在線粒體損傷，但是線粒體自噬功能未受到影響，Parkin mRNA過表達以清除損傷線粒體，維持細胞穩(wěn)態(tài)。

綜上，4種造模方法都可以在不同程度上造成脾虛損傷。脾虛的形成可能是飲食失節(jié)、過食寒涼、勞倦過度等多種復(fù)合因素導(dǎo)致的胃腸道消化吸收異常，進而影響到人體循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，甚至線粒體異常，但是這些聯(lián)系的具體機制尚未闡明，有待于進一步的研究。