新型AMPA受體調(diào)節(jié)劑LCX001抗阿片受體激動劑TH-030418致呼吸抑制效應(yīng)及其機制

高 翔，樊永正，2，代 威，雍 政，蘇瑞斌

（1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850；2.聯(lián)勤保障部隊第九九一醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

以阿片類藥物為代表的鎮(zhèn)痛藥在疼痛治療和誘導麻醉中的作用迄今無可替代，但該類藥物引發(fā)的嚴重呼吸抑制是導致死亡的重要原因之一［1-2］。雖然臨床上常用阿片受體拮抗劑（如納洛酮等）緩解阿片致呼吸抑制，但其在緩解呼吸抑制效應(yīng)的同時會抵消阿片的鎮(zhèn)痛效果，同時存在給藥方式單一、持續(xù)時間短、劑量不可控、需長時間密切觀察等缺點［3-5］，用于對抗呼吸抑制需要進一步評估和密切監(jiān)測患者各項體征。因此，探索可以改善阿片致呼吸抑制且并不影響阿片鎮(zhèn)痛效果的新型藥物，成為目前該類藥物開發(fā)的新思路，對于提升臨床急救能力具有重要意義。

近幾年眾多文獻報道，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸（α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體調(diào)節(jié)劑可調(diào)控呼吸功能，該受體在延髓呼吸中樞的前包欽格復合體廣泛分布，對調(diào)節(jié)呼吸節(jié)律的形成和呼吸沖動的傳導發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6-7］。有研究證實，以安帕金（ampakine）為代表的AMPA受體調(diào)節(jié)劑可對抗多種藥物所致的呼吸抑制［8-11］。AMPA受體調(diào)節(jié)劑潛在的鎮(zhèn)痛、改善學習記憶和神經(jīng)保護等作用，與納洛酮等阿片受體拮抗劑相比，具有顯著優(yōu)勢，可使救治預后更好，有望成為非特異性抗阿片致呼吸抑制藥物。

基于以上研究背景，本研究所藥物化學研究室在美國RespireRx制藥公司研發(fā)的苯甲酰胺類系列AMPA受體調(diào)節(jié)劑基礎(chǔ)上，通過三維藥效團模型模擬、計算機輔助設(shè)計及虛擬篩選，合成了200余個潛在AMPA受體調(diào)節(jié)劑。其中代號為LCX001的化合物（相對分子質(zhì)量275，化學結(jié)構(gòu)見圖1）可顯著提高阿片受體激動劑TH-030418所致小鼠急性死亡生存率［12-15］，且具有良好的鎮(zhèn)痛及鎮(zhèn)靜效應(yīng)，同時放射性配體受體結(jié)合實驗顯示，LCX001與［3H］AMPA無競爭結(jié)合，但可以明顯促進［3H］AMPA與AMPA受體結(jié)合，表明LCX001通過調(diào)節(jié)AMPA受體發(fā)揮效應(yīng)，屬于AMPA受體調(diào)節(jié)劑范疇，而非AMPA受體激動劑或拮抗劑［14-15］。提示LCX001是具有抗阿片致呼吸抑制效應(yīng)的新型AMPA受體調(diào)節(jié)劑。本研究擬在前期初步篩選基礎(chǔ)上，對LCX001抗呼吸抑制量效和時效關(guān)系進行系統(tǒng)評價，并初步探討其作用機制。

Fig.1 Chemical structure of LCX001.

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SD大鼠，雄性，SPF級，體重為180～220 g，由軍事醫(yī)學研究院動物中心提供，合格證號：SCXK-（軍）2016-004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫24～26℃，濕度40%～60%，12 h/12 h交替日光燈照明。每籠5只，自由飲水與攝食。所有操作均按照軍事醫(yī)學研究院實驗動物管理與使用委員會的要求（批準編號：06-2018-020）進行。

LCX001（批號：140315，純度≥98%）和TH-030418（批號：030418，純度≥98%）由本所藥物化學研究室合成；羥丙基-β-環(huán)糊精（批號E0276），北京鳳禮精求商貿(mào)有限責任公司；鄰苯二甲醛（批號：BCCC3481，純度≥99%），美國Sigma公司。LCX001加入20%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液配制至所需濃度；TH-030418溶于注射用水配制至所需濃度；以上藥物均現(xiàn)用現(xiàn)配。

清醒動物肺功能測定儀，美國DSI公司；雷度ABL90系列血氣分析儀和PICO70自吸式動脈血氣針，丹麥Radiometer公司；安捷倫1200系列液相色譜工作站，美國Agilent公司；DECAYDEⅡ電化學檢測器，荷蘭Antec Leyden公司；HoneyCombTM低溫樣品自動收集器、M2250型微透析探針（透析膜長度4 mm）和Ω-型腦內(nèi)引導管，美國BAS公司；CMA120清醒動物裝置和CMA100微量注射泵，瑞典CMA公司；ODS-C18色譜柱（10 μm，250 mm×4.6 mm），迪馬公司。

1.2 大鼠肺功能參數(shù)檢測

肺功能檢測儀由氣泵、透明有機玻璃箱、壓力傳感器、信號調(diào)節(jié)器和計算機操作界面相繼連接組成。氣泵用于連續(xù)輸送新鮮空氣和濾除二氧化碳，壓力傳感器測量氣壓變化，信號調(diào)節(jié)器將氣壓變化通過電信號轉(zhuǎn)化成具體數(shù)據(jù)在計算機界面上顯示。設(shè)置清醒無創(chuàng)大鼠肺功能檢測儀參數(shù)和監(jiān)測條件：氣泵流量1.5 L·min-1，增益放大倍數(shù)1倍，傳感器放大倍數(shù)200倍，采樣功率500 Hz。將大鼠隨機分為呼吸抑制模型組（iv給予TH-030418 20 μg·kg-1）和模型+LCX001治療組（iv給予TH-030418 20 μg·kg-1，17.5 min后，iv給予LCX001 5，10和20 mg·kg-1），每組5只。檢測時，將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30～40 min，而后連續(xù)測定15 min穩(wěn)定的肺功能參數(shù)〔每分鐘通氣量（minute ventilation，MV）、呼吸頻率（respiratory frequency，RF）和呼吸氣道阻力（enhanced pause，EP）〕的基礎(chǔ)值，而后取出大鼠按分組給藥，給藥后放回檢測儀中，2.5 min后開始記錄肺功能參數(shù)，隨后每5 min測1次，直至62.5 min。將給予TH-030418前17.5，12.5和7.5 min 3個時間點的大鼠肺功能參數(shù)測量值的平均值定義為基線值，實驗結(jié)果以各測量值與基線值的百分比表示。

1.3 大鼠血氣參數(shù)檢測

將大鼠隨機分為模型組（iv給予TH-030418 20 μg·kg-1構(gòu)建呼吸抑制模型）和模型+LCX001治療組（iv給予TH-030418 20 μg·kg-1，5 min后，iv給予LCX001 5，10和20 mg·kg-1），每組5只。分別在給予TH-030418后0，5，15，30和60 min 5個時間點，使用雷度PICO70血氣針自大鼠腹主動脈取血（每次取血量＞65 μL），每次取血后1～2 min內(nèi)將血氣針置入ABL90血氣分析儀進樣口，儀器自動取樣并檢測動脈血氣參數(shù)〔氧分壓（oxygen partial pressure，pO2）、二氧化碳分壓（carbon dioxide partial pressure，pCO2）和血氧飽和度（oxygen saturation，sO2）〕值。

1.4 腦微透析和高效液相-電化學（high-performance liquid chromatography-electrochemical detector，HPLC-ECD）法檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞外液谷氨酸（Glu）含量

1.4.1 大鼠腦立體定位置管手術(shù)

大鼠ip給予水合氯醛（400 mg·kg-1）麻醉，俯臥固定于立體定位儀上，充分暴露顱骨表面，定位海馬區(qū)的坐標：前囟后5.2～5.5 mm，前囟側(cè)4～6 mm，顱骨面下5 mm。將引導管垂直插至指定深度，用小螺釘和牙科水泥將其固定于顱骨面。術(shù)后縫合皮膚，將大鼠單籠飼養(yǎng)，恢復48～72 h后用于腦微透析實驗。

1.4.2 大鼠藥物處理和腦微透析樣品采集

置管手術(shù)后，將大鼠隨機分為4組，分別為溶劑對照組（ip給予20%羥丙基-β-環(huán)糊精）、LCX001對照組（ip給予LCX001 20mg·kg-1）、模型組（iv給予TH-030418 20 μg·kg-1）和模型+LCX001 預防組（ip給予LCX001 20 mg·kg-1，15 min后，iv給予TH-030418 20 μg·kg-1），每組5只。給藥前，將大鼠用乙醚輕微麻醉，小心取出引導管內(nèi)的鋼芯，將M2250型探針置入導管內(nèi)，探針事先通過連接管與微量注射泵和收集器的收集針相連，微量注射泵以1.5 μL·min-1的速度灌流人工腦脊液（mmol·L-1：NaCl 124，KCl 5，NaH2PO41.25，MgSO42，葡萄糖10，CaCl22和NaHCO326），收集器溫度調(diào)至4°C。將大鼠置于觀察籠內(nèi)，每20 min收集25 μL腦脊液微透析樣品，平衡透析1 h后，加入2 μL鄰苯二甲醛進行衍生化反應(yīng)10 min，隨后取25 μL樣品進行HPLC-ECD檢測。呼吸抑制組在給藥前測定40 min的Glu基礎(chǔ)釋放值變化，并于0 min時間點給予TH-030418，隨后每隔20 min收集一次透析樣品并進行HPLC-ECD檢測至160 min；溶劑對照組、LCX001對照組和模型+LCX001預防組在給藥前測定20 min的Glu基礎(chǔ)釋放值變化，并于-15 min時間點分別給予溶劑和LCX001（其中模型+LCX001預防組在給LCX001 15 min后給予TH-030418），15 min后取樣1次并進行HPLC-ECD檢測，隨后每隔20 min收集1次透析樣品并進行HPLC-ECD檢測至160 min。將給予TH-030418前40和20 min 2個時間點的谷氨酸含量測量值的平均值定義為基線值，實驗結(jié)果以各測量值與基線值的百分比表示。實驗結(jié)束后處死大鼠，取全腦切片檢查，剔除置管位置不正確的動物數(shù)據(jù)。

1.4.3 HPLC-ECD色譜條件

流動相配制：磷酸二氫鈉15.59 g，辛烷磺酸鈉0.1605 g，EDTA0.0080 g，氯化鉀 0.1493 g，溶于800 mL雙蒸水中，加入乙腈10 mL，乙酸5 mL，甲醇150 mL，用濃磷酸調(diào)pH至3.32，加雙蒸水定容至1000 mL，0.22 μm微孔濾膜抽濾。電化學檢測器的工作電極為玻璃碳，參比電極為固態(tài)Ag/AgCl，檢測工作電壓為±0.70 V，流速為1.0 mL·min-1，柱溫28℃。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LCX001對TH-030418致呼吸抑制大鼠肺功能參數(shù)的影響

iv 給予 TH-03041820 μg·kg-1后，大鼠立即出現(xiàn)靜止不動、木僵、豎尾和呼吸困難等現(xiàn)象。肺功能參數(shù)檢測結(jié)果（圖2）顯示，在給予TH-030418后2.5 min時間點，呼吸抑制模型組大鼠MV和RF均比基礎(chǔ)值顯著下降（P＜0.01），而EP則比基礎(chǔ)值顯著增加（P＜0.01）。而模型+不同劑量LCX001組大鼠MV，RF和EP均表現(xiàn)出一定程度的改善，其中模型+LCX001 20 mg·kg-1組在給予 TH-030418后22.5 min時間點MV迅速上升至與基礎(chǔ)值相近的水平（P=0.67）；與相同時間點模型組相比，模型+LCX001 20 mg·kg-1組在37.5～62.5 min MV顯著升高（P＜0.01），在22.5～62.5 min RF顯著升高（P＜0.01）；在47.5，57.5和62.5 min EP顯著降低（P＜0.05），提示LCX001能有效逆轉(zhuǎn)TH-030418所致的大鼠MV和RF下降及EP升高，改善大鼠呼吸狀態(tài)。

Fig.2 Effects of LCX001 on lung function parameters in TH-030418-induced respiratory depression rats.Rats were divided into respiratory depression model group that was iv given TH-030418 20 μg·kg-1（0 min）and model+LCX001 groups[iv given TH-030418 20 μg·kg-1（0 min），15 min later iv given LCX001 5，10 or 20 mg·kg-1].The mean of the measured values at-17.5（17.5 min before TH-030418 administration），-12.5 and-7.5 min was defined as 100%.All the data were normalized to a percentage by dividing the mean.Lung function parameters were measured every 5 min.MV：minute ventilation；RF：respiratory frequency；EP：enhanced pause.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the corresponding time point of model group；＃P＜0.01，compared with-7.5 min of model group.

2.2 LCX001對TH-030418致呼吸抑制大鼠動脈血氣參數(shù)的影響

大鼠 iv 給予 TH-030418 20 μg·kg-1后腹主動脈血顏色暗紅，給予LCX001 20 mg·kg-1后15，30和60 min由暗紅逐漸變?yōu)轷r紅。動脈血氣參數(shù)檢測結(jié)果（圖3）顯示，在給予TH-030418后5 min，模型組大鼠pCO2顯著上升，pO2和sO2顯著下降（P＜0.01），提示TH-030418引發(fā)大鼠明顯呼吸抑制。與相同時間點模型組相比，模型+LCX001 20 mg·kg-1組大鼠pCO2顯著下降，pO2和sO2顯著上升（P＜0.01）。提示LCX001可以逆轉(zhuǎn)TH-030418所致呼吸抑制大鼠動脈血氣參數(shù)的變化，使其恢復或接近基礎(chǔ)值水平。

Fig.3 Effects of LCX001 on arterial blood gas parameters in TH-030418-induced respiratory depression rats.Rats were divided into respiratory depression model group（iv given TH-030418 20 μg·kg-1）and model+LCX001 groups（iv given TH-030418 20 μg · kg-1，5 min later iv given LCX001 5，10 and 20 mg·kg-1）.pCO2：carbon dioxide partial pressure；pO2：oxygen partial pressure；sO2：oxygen saturation.± s，n=5. ＊＊P＜0.01，compared with the corresponding time point of TH-030418 group；＃P＜0.01，compared with 0 min of model group.

2.3 LCX001對TH-030418致呼吸抑制大鼠海馬神經(jīng)細胞外液中Glu含量的影響

LCX001對照組（P=0.12）和溶劑對照組（P=0.40）各時間點腦脊液中Glu含量均未見明顯變化，提示單用LCX001并不引起Glu含量釋放的明顯改變。模型組大鼠給予TH-030418后20 min與該組給予TH-030418前20 min時間點相比，大鼠腦脊液中Glu含量明顯下降（P＜0.05）。模型+LCX001組在給予TH-030418后20，60，120和160 min時間點大鼠腦脊液中Glu含量均比相應(yīng)時間點的模型組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示LCX001可逆轉(zhuǎn)TH-030418引起的大鼠腦脊液Glu含量減少（圖4）。

Fig.4 Effect of LCX001 on glutamate（Glu）release in TH-030418-induced respiratory depression rats.Rats were divided into vehicle group[ip given 20% hydroxypropyl-βcyclodextrin at 15 min before TH-030418 injection（-15 min）]，LCX001 control group（ip given LCX001 20 mg·kg-1at-15 min），model group（iv given TH-030418 20 μg·kg-1at-15 min）and model+LCX001 group（ip given LCX001 20 mg·kg-1at-15 min，15 min later iv given TH-030418 20 μg · kg-1）.The mean of the measured values at-40 and-20 min was defined as 100%.All the data were normalized to a percentage by dividing the mean.Glu content was measured every 20 min.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with-20 min time point of model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the corresponding time point of model group.

3 討論

本研究對新型AMPA受體調(diào)節(jié)劑LCX001改善阿片類藥物所致呼吸抑制的量效和時效進行評價，并對其作用機制進行初步探討，結(jié)果提示，LCX001可明顯逆轉(zhuǎn)TH-030418所致呼吸抑制大鼠的肺功能參數(shù)，并顯著改善動脈血氣，有效對抗阿片類致大鼠呼吸抑制，這一效應(yīng)可能與LCX001調(diào)節(jié)呼吸抑制大鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)細胞外液的Glu神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)。

近幾年眾多研究表明，AMPA受體與呼吸功能關(guān)系密切，尤其表達于介導呼吸節(jié)律產(chǎn)生的重要核團前包欽格復合體的AMPA受體參與呼吸節(jié)律和幅度的調(diào)控，在內(nèi)源性激動劑Glu的激活作用下，AMPA受體對中樞神經(jīng)元的興奮和抑制平衡進行調(diào)節(jié)，并維持呼吸中樞的正常功能［16-17］。與現(xiàn)有臨床使用的特異性拮抗劑及呼吸興奮劑相比較，AMPA受體調(diào)節(jié)劑表現(xiàn)出對抗呼吸抑制特點，具有副作用低、安全性好等優(yōu)勢，同時可能具有的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、改善學習記憶和神經(jīng)保護等作用，可以使救治預后更好。

LCX001是在AMPA受體調(diào)節(jié)劑CX717和CX1739結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進行改構(gòu)合成的新結(jié)構(gòu)類型的化合物，可通過調(diào)節(jié)AMPA受體的功能發(fā)揮生物學效應(yīng)，與AMPA受體激動劑不同的是，該類化合物不會產(chǎn)生抽搐等驚厥樣行為，目前CX717已經(jīng)作為改善阿片類致呼吸抑制藥物進入Ⅱ期臨床試驗［18］。本課題組前期體外實驗已證實，LCX001對AMPA受體有正向調(diào)節(jié)作用，可以促進神經(jīng)元的興奮性傳遞［15］。本研究選用阿片類藥物TH-030418建立呼吸抑制大鼠模型，系統(tǒng)考察了LCX001改善呼吸抑制的量效和時效關(guān)系。TH-030418是我所自行設(shè)計合成的一個結(jié)構(gòu)新穎的長效阿片受體激動劑，作為噻吩諾啡的衍生物，可以非選擇性地與各亞型阿片受體結(jié)合，并具有很強的親和力，是一類比嗎啡和二氫埃托啡更為強效的阿片類鎮(zhèn)痛藥。TH-030418的鎮(zhèn)靜和麻醉作用明確，呼吸抑制強度具有明顯劑量依賴性，在較低劑量下（8 μg·kg-1）即可產(chǎn)生呼吸抑制，且持續(xù)時間長，更有意義的是，在納洛酮催促戒斷、條件性位置偏愛和自身給藥實驗中，均未發(fā)現(xiàn)有明顯身體依賴和精神依賴潛能［12-14］。上述藥理藥效特點說明，TH-030418可作為良好的工具藥用于中重度呼吸抑制模型的建立?？紤]到避免雌性發(fā)情周期對實驗結(jié)果的干擾及性別導致的阿片受體敏感性差異，本研究選擇了雄性大鼠給予TH-030418建立呼吸抑制模型，測定處于清醒和自由活動大鼠的MV、RF和EP等呼吸指標，結(jié)果顯示，LCX001能有效逆轉(zhuǎn)TH-030418所致大鼠RF降低、MV下降和EP增加等呼吸抑制狀態(tài)。呼吸抑制大鼠的動脈血氣參數(shù)pO2、pCO2和sO2也進一步確證LCX001抗阿片類致呼吸抑制的有效性。

目前已證實，阿片受體、Glu、γ-氨基丁酸、甘氨酸和Ca2+等都參與呼吸節(jié)律的調(diào)控。延髓呼吸中樞產(chǎn)生的節(jié)律性呼吸依賴于延髓呼吸中樞內(nèi)各神經(jīng)元之間復雜的相互聯(lián)系和相互作用，其中Glu系統(tǒng)是興奮呼吸中樞的主要神經(jīng)系統(tǒng)，可調(diào)控呼吸節(jié)律，增強興奮性神經(jīng)沖動向膈肌運動神經(jīng)元的傳遞。中樞Glu釋放與激動AMPA受體和NMDA受體密切相關(guān)。而直接作用于AMPA受體的激動劑，由于直接與受體的結(jié)合位點結(jié)合，易對受體產(chǎn)生過度刺激引發(fā)神經(jīng)毒性［19-21］。為了考察LCX001改善呼吸抑制的作用機制，本研究采用微透析法測定與呼吸密切相關(guān)的海馬腦區(qū)的Glu釋放。結(jié)果顯示，TH-030418使海馬腦區(qū)細胞外液Glu釋放明顯減少，單用LCX001對海馬腦區(qū)細胞外液Glu含量無影響，但預先給予LCX001后可緩解TH-030418所致的Glu釋放減少，使其恢復至接近基礎(chǔ)值狀態(tài)，且未造成過度激活。以上結(jié)果表明，LCX001發(fā)揮變構(gòu)調(diào)節(jié)功能，可能是通過與AMPA受體激動劑不同的受體結(jié)合位點，通過增強AMPA受體激動劑與AMPA受體的結(jié)合，影響AMPA受體的脫敏和失活過程實現(xiàn)對AMPA受體的精確調(diào)控，相比于直接作用于AMPA受體的激動劑更具優(yōu)勢。