轉運蛋白分子相關疾病及其可能作用機制研究進展

張 鵬，曹偉靈，葉陳麗，匡海珠，潘明月

（深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院藥學部，廣東 深圳 518001）

轉運蛋白（translocator protein，TSPO）作為地西泮外周結合位點，于1977年被命名為外周型苯二氮受體［1］，是一個相對分子質量為 1.4×105～2.0×105的多聚體復合物的重要組成部分［2］。2001年，Lacapère等［3］成功分離出外周型苯二氮受體的單體，該單體為1.8×104的蛋白，是與藥物配體和膽固醇結合的最小功能單位。此后，Anholt等［4］通過放射自顯影和亞細胞分餾法證實，TSPO主要分布于線粒體外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）。然而隨后大量研究發(fā)現(xiàn)，TSPO在內外膜銜接處也很豐富，并且可隨被轉運的物質進入到內膜，并在線粒體內膜（inner mitochondrial membrane，IMM）分布［5-7］。

線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一個直徑為2～3 nm的非特異性巨大通道［8］，可將相對分子質量＞1.5×103的物質排除在外［9］。許多研究發(fā)現(xiàn)，mPTP的異常開放可引起線粒體功能障礙，導致線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降，氧化應激增加，釋放細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）進入細胞質，最終觸發(fā)細胞死亡。因此，mPTP異常開放是缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）、急性心肌梗死、炎癥、腫瘤、神經退行性疾病和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等多種疾病或病理障礙的主要病因之一［10-12］。

TSPO作為mPTP組成的一部分并具備多種生理調節(jié)功能，決定了其與多種疾病相關，是當前研究熱點之一。本文綜述TSPO與心血管疾病、神經退行性疾病、神經病理性疼痛、腫瘤和COPD等多種疾病的關系及其可能的作用機制。

1 TSPO結構和生理功能

1.1 結構

蛋白質序列分析表明，TSPO有5個跨膜螺旋（transmembrane helices，TH）［13-14］，對小鼠 TSPO蛋白分離的多肽進行圓二色譜法和核磁共振分析的結果進一步支持這一發(fā)現(xiàn)［15］。Jaremko等［16］通過核磁共振等方法模擬出小鼠TSPO-PK11195復合物的3D結構（注冊號：P50637），該復合物含有5個TH（TH1～TH5），在胞漿中按順時針方向緊密聚集在一起。5個TH之間均以殘基相連，除連接TH1和TH2的殘基外，其他TH之間的環(huán)均很短（圖1）。早期研究表明，TH1-TH2環(huán)對PK11195與TSPO結合至關重要［17］。拓撲分析證實，復合物C端帶正電荷且位于細胞質中，而在受體的內膜區(qū)域存在相等數(shù)量的正電荷和負電荷，其暴露部位的荷電可能對內源性TSPO配體（如膽固醇）的蛋白質相互作用起重要作用［18］。Jaipuria等［19］利用固體核磁共振光譜對TSPO的特異性殘基進行分析發(fā)現(xiàn)，TSPO在膜中處于單體-二聚體動態(tài)平衡，而與膽固醇結合后導致整個蛋白質的結構發(fā)生變化，單體形式增多。

圖1 轉運蛋白（TSPO）結構示意圖.TH：跨膜螺旋.

1.2 生理功能

TSPO廣泛分布于外周組織，尤其是合成類固醇類物質的組織，如肝、心、腎和肺等［2，17］。在中樞神經系統(tǒng)中，TSPO主要存在于膠質細胞和神經元［20-21］。TSPO的內源性配體有原卟啉Ⅸ和膽固醇等，苯二氮類化合物Ro5-4864和異喹啉甲酰胺類化合物PK11195等是其外源性配體。TSPO主要的生理功能是將膽固醇由OMM轉運到IMM［22］，這是類固醇和膽汁酸生物合成的限速步驟。膽固醇被TSPO轉運至線粒體內，經過一系列酶促反應后生成孕烯醇酮，然后進一步轉化成性激素、腎上腺皮質類固醇和神經類固醇等具有特異性功能的類固醇激素［14］，這些激素被轉運至相應靶器官后發(fā)揮各自的生理功能。

另一方面，TSPO是mPTP的組成成分［23］，與電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channels，VDAC）和腺嘌呤核苷酸轉運蛋白（adenine nucleotide transporter，ANT）相互作用并構成mPTP的骨架，在調節(jié)mPTP的開放中發(fā)揮重要作用［24-26］。這一作用通過大鼠腦部模型中Ca2+誘導的mPTP開放可被抗TSPO抗體延遲得到證實［27］。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，抗TSPO抗體在阻斷mPTP開放方面比環(huán)孢素A（一種mPTP開放阻斷劑）更有效［28］，提示TSPO可能直接參與mPTP的形成和調控。

2 與TSPO相關的疾病

TSPO的廣泛表達及其所具備的生理功能決定了其可能在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。近年來，大量研究表明，TSPO與心血管疾病、神經退行性疾病、神經病理性疼痛、腫瘤和COPD等疾病密切相關。

2.1 心血管疾病

研究表明，TSPO在心肌組織有較高的表達，并且參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如IRI［29］、動脈粥樣硬化［30］和心律失常［31］等。心血管疾病是一種常見的公共衛(wèi)生疾病，是全球發(fā)病率和死亡率都很高的疾病之一［32］。心肌缺血損傷易導致心肌梗死、心力衰竭和心律失常等。心肌缺血時需要迅速恢復氧合血流量，從而挽救心肌細胞的不可逆損傷［33］。然而，恢復供血后過量的自由基會攻擊原有的缺血組織，造成再灌注損傷［34］。Paradis等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠IRI模型中，TSPO選擇性配體4'-氯地西泮可抑制氧化應激、改善線粒體功能、消除線粒體內膽固醇和氧甾酮的積累，從而保護心臟。該團隊2010年發(fā)現(xiàn)的新化合物TRO40303作為TSPO膽固醇結合位點特異性配體，也具有同樣的效果［36］。TRO40303可延遲缺氧2 h后復氧的成年大鼠心肌細胞mPTP的開放和細胞死亡，并可抑制過氧化氫處理的新生大鼠心肌細胞mPTP的開放。此外，TRO40303可顯著減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生以及鈣潴留。Motloch等［37］在最近的一篇綜述中強調TSPO通過影響mPTP從而在ROS誘導的ROS再生過程中發(fā)揮關鍵作用，認為mPTP隨著ROS水平升高而被激活，而mPTP的激活與心肌細胞死亡直接相關。

2.2 神經退行性疾病

TSPO在神經系統(tǒng)中主要位于膠質細胞和神經元。當膠質細胞被激活時，TSPO的表達水平顯著升高。大量研究發(fā)現(xiàn)，TSPO在神經系統(tǒng)發(fā)生病變的大腦組織中高表達［38-40］。近年來，TSPO作為神經退行性疾病的生物標志物被廣泛研究。2019年，Werry等［41］總結了基于正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET）技術檢測TSPO在神經退行性疾病中作為神經炎癥標志物的研究進展。盡管病因不同，神經炎癥被認為是神經退行性疾病，如阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病和肌萎縮性脊髓側索硬化癥等的病理特征［42-44］。監(jiān)測神經炎癥的發(fā)展軌跡，有助于了解神經炎癥的病因和疾病進展的程度。在神經退行性疾病進程的初級階段發(fā)現(xiàn)炎癥，應盡早治療［45］。要實現(xiàn)這一點，就需要神經炎癥的生物標志物，TSPO便是有望成為該標志物的蛋白。TSPO的PET典型放射性配體是［11C］（R）-PK11195，放射自顯影研究顯示，AD患者大腦中［3H］PK11195結合增加，并且在乙酰膽堿轉移酶活性降低的區(qū)域更為明顯［46-47］。近年來，還發(fā)現(xiàn)其他改良型放射性標記TSPO配體，如18F標記的外周型苯二氮受體28類似物［18F］-FEPPA［48］、18F標記的N，N-二乙基-2-（2-［4-（2-氟乙氧基）-苯基］-5，7-二甲基-吡唑［1，5-a］嘧啶基）乙酰胺［18F］DPA-714［49］和18F標記的吡啶基異喹啉衍生物（R）-［18F］NEBIFQUINIDE［50］。

TSPO不僅可以作為神經炎癥的生物標志物，其配體對神經退行性疾病也有潛在治療價值。Christensen等［51］用雌性3xTg-AD小鼠建立老年癡呆模型，連續(xù)5周給予PK11195（3 mg·kg-1，每周1次）后發(fā)現(xiàn)，小鼠開臂滯留時間明顯延長，且小鼠自發(fā)交替行為顯著增加25%，表明PK11195可顯著改善老年癡呆模型小鼠的焦慮情緒和記憶力。Leva等［52］結合臨床、行為學、組織病理學、生化和分子生物學方法研究表明，低劑量且耐受良好的TSPO配體XBD173能有效改善髓鞘蛋白脂質蛋白誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的臨床癥狀和神經病理改變。實驗發(fā)現(xiàn)，XBD173（10 mg·kg-1）可以改善髓鞘蛋白脂質蛋白誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠運動功能，恢復脊髓和大腦髓鞘堿性蛋白的水平，降低血清中促炎細胞因子（白細胞介素17α、白細胞介素6和腫瘤壞死因子）的水平。綜上所述，TSPO在神經退行性疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，為神經退行性疾病的治療提供了全新思路。

2.3 神經病理性疼痛

神經病理性疼痛是慢性疼痛的一種，臨床主要特征為自發(fā)性疼痛和痛覺過敏等，目前采用抗抑郁藥、抗癲癇藥和阿片類藥物等治療［53］，但有效率一般＜50%［54］。因此，尋找并研發(fā)更有效、靶向性更好的治療神經病理性疼痛的藥物尤為重要。近年來，發(fā)現(xiàn)TSPO作為靶點在治療神經病理性疼痛方面發(fā)揮重要作用。徐霜霜等［55］通過鞘內注射TSPO激動劑Ro5-4864研究發(fā)現(xiàn)，在SD大鼠神經病理性疼痛模型中，與對照組相比，Ro5-4864可顯著緩解SD大鼠的痛覺超敏現(xiàn)象，并可調節(jié)星形膠質細胞的活性。馬冰潔等［56］研究了背根神經節(jié)TSPO對神經病理性疼痛的影響，得出了相同的結論。Liu等［57］以L5脊神經結扎大鼠為實驗對象，研究了脊髓TSPO與神經病理性疼痛的關系。結果顯示，在結扎后的脊髓背側，TSPO升高呈現(xiàn)出時間依賴性，且其激動劑Ro5-4864可以劑量依賴性方式緩解大鼠機械性異位痛。上述結果表明，TSPO可能作為一個新靶點，用于治療或預防神經病理性疼痛。

2.4 腫瘤

TSPO的表達水平與多種腫瘤的惡性程度成正相關，且與患者的生存率成負相關。因此，TSPO可用作多種癌癥的生物標志物［58-61］。Milenkovic等［62］運用CRISPR/Cas9技術敲除人源小膠質細胞C20細胞中的TSPO后，C20細胞內類固醇生成減少，MMP、細胞質Ca2+濃度和呼吸功能均降低，表明TSPO是細胞維持正常功能必不可少的成分。Unterrainer等［59］對組織學確診的膠質瘤患者進行18F-GE-180（一種新型TSPO配體）PET檢查，以評估腫瘤背景和PET體積的最大比率和平均比率。他們發(fā)現(xiàn)，18F-GE-180的攝入量與世界衛(wèi)生組織的腫瘤分類高度相關。Montagner等［63］發(fā)現(xiàn)了一種新的基于銅的抗癌金屬藥物CuBr2（TZ6），并通過實驗和計算機方法分析其結構及其與TSPO的親和性。結果表明，其可靶向TSPO，相對于正常細胞，其在體內外對癌細胞具有較高選擇性。然而，TSPO是否可作為所有癌癥標志物仍需進一步研究。Bhoola等［64］采用原位雜交和RT-PCR技術研究了TSPOmRNA在不同類型的正常和癌組織中的轉錄水平。結果表明，在肝癌和腦癌組織中，TSPO轉錄水平顯著升高，而在肺癌中則顯著降低。定量RT-PCR結果也證實，正常肺細胞系MRC-5中TSPOmRNA水平高于肺癌細胞系A549。由此可見，TSPO并不是在所有癌癥組織或細胞中的表達水平均升高，但與正常組織相比，TSPO的表達水平確實發(fā)生了變化。其在各類腫瘤中的作用仍需進一步研究。

2.5 COPD

COPD是一種慢性肺部疾病，以進行性氣流受限和慢性炎癥為主要特征。近年來發(fā)現(xiàn)，TSPO對COPD的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。免疫組織化學法檢測結果顯示，TSPO在肺上皮細胞中有大量表達［65］，提示TSPO在肺中可能發(fā)揮重要作用。吸煙是COPD的主要誘因，研究報道，煙霧中的物質可通過降低TSPO的結合水平來調控細胞凋亡，從而降低其相關的促凋亡和抗癌活性［66］。早在1999年，Das等［67］便發(fā)現(xiàn)苯二氮配體Ro5-4864可以抵消異丙腎上腺素引起的豚鼠肺泡Ⅱ型細胞游離Ca2+水平升高，從而調節(jié)細胞表面活性物質的分泌。Zeineh等［68］分別用TSPO低親和力配體CB204和高親和力配體CB86預防氯化鈷誘導的肺癌細胞H1299的缺氧。結果顯示，CB204可以顯著抑制缺氧誘導的細胞毒性、ROS生成和MMP去極化等，表明TSPO可能是COPD治療藥物的一個重要靶點。

3 TSPO可能的作用機制

3.1 調節(jié)mPTP的開放

線粒體是一種動態(tài)的細胞器，具有多種功能，包括ATP合成、維持體內Ca2+平衡、衰老和細胞死亡等。線粒體具有獨特的雙膜結構，包括OMM、膜間隙、IMM和基質［69］。OMM允許大量的營養(yǎng)物質、離子和能量分子進入IMM，而IMM向內形成褶皺，大分子相對不易滲透。線粒體膜的完整性對線粒體的正常功能至關重要。mPTP是一個Ca2+增多誘導開放的通道，作為線粒體膜內外物質轉運的通道，其正常開放具有重要意義。在MMP的驅動下，Ca2+可通過單向轉運體轉運到線粒體基質中。MMP下降導致Ca2+內流增加，從而導致mPTP的異常開放［70］。反之，如果mPTP異常開放，則會導致IMM和OMM之間的離子紊亂，從而導致MMP的下降。

研究證實，TSPO主要位于OMM，并與VDAC和ANT相互作用，構成mPTP的主要組成部分，在調節(jié)mPTP開放中發(fā)揮重要作用［24-26］。李敬遠等［71］對激動大鼠心肌細胞線粒體TSPO是否能抑制Ca2+誘導的mPTP開放進行了研究。結果顯示，Ro5-4864與TSPO結合后改變了ANT的構象，使其在IMM基質側與ADP和ATP結合，最終抑制mPTP的開放。此外，研究發(fā)現(xiàn)，一種抗TSPO抗體，在阻斷mPTP的開放方面比環(huán)孢素A更有效，提示TSPO可能直接參與mPTP開放的形成和調控。

多種藥物可通過TSPO調控mPTP的開放發(fā)揮藥效。在老年群體以及AD患者的大腦中，高濃度Ca2+和ROS可激活TSPO，從而激活mPTP，導致MMP下降，ROS產生持續(xù)增加、心肌磷脂氧化以及Cyt c釋放（圖2）［72］。Paradis等［35］發(fā)現(xiàn)，心臟IRI大鼠線粒體氧化磷酸化水平降低，mPTP開放敏感性增加，膽固醇攝取增加，而選擇性TSPO配體4'-氯地西泮可抑制氧化應激，降低mPTP開放的敏感性，從而改善線粒體功能，消除膽固醇的累積，保護心臟。

圖2 Ca2+或活性氧（ROS）增多導致線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放.高濃度Ca2+和ROS的產生激活TSPO，從而使mPTP開放，導致MMP降低、ROS產生和細胞色素c（Cyt c）釋放。VDAC：電壓依賴性陰離子通道；ANT：腺嘌呤核苷酸轉運蛋白.

3.2 參與調控細胞凋亡

3.2.1 通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡

線粒體是細胞生命活動的控制中心，是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化過程的重要場所，并且調控細胞凋亡［73-74］。研究表明，線粒體中Cyt c的釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，激活TSPO可促進線粒體釋放Cyt c，激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，從而誘導細胞凋亡［75-76］。Kugler等［77］將人源惡性膠質瘤細胞系U87MG，A172和U118MG暴露于芥酸磷酸膽堿同源物芥酸磷酸高膽堿（erucylphosphohomocholine，ErPC3），誘導細胞凋亡（圖3）。結果顯示，TSPO配體PK11195和Ro5-4864可抑制ErPC3導致的MMP降低、Cyt c釋放及胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3激活，從而抑制ErPC3誘導的細胞凋亡。Sun等［78］在聲動力學治療誘導的THP-1巨噬細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，PK11195預處理可以抑制聲動力學治療誘導的Cyt c從線粒體釋放至細胞質的過程，進而抑制細胞早期凋亡。

圖3 TSPO通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡.芥酸磷酸高膽堿（ErPC3）刺激TSPO，導致線粒體膜電位降低，Cyt c釋放，從而激活胱天蛋白酶9和3，最終導致細胞凋亡.

3.2.2 通過P53途徑誘導細胞凋亡

20世紀70年代末期，p53首次被發(fā)現(xiàn)［79］，最初認為是一種促癌基因［80］，但隨后30年的深入研究逐漸證明，p53是一種重要的抑癌基因［81］，參與細胞周期和分化過程中基因的轉錄調控，可被多種應激信號激活。p53主要分布于細胞核內，能與DNA特異性結合。正常p53的生物功能如同“基因組衛(wèi)士”，在G1期檢查DNA的損傷點，監(jiān)視基因組的完整性。如有損傷，P53蛋白則阻止DNA復制，以提供足夠的時間修復損傷的DNA；如果修復失敗，P53蛋白則引發(fā)細胞凋亡［82］。

研究發(fā)現(xiàn)，超過50%惡性腫瘤的p53基因發(fā)生突變［83］。因此，p53被視為許多腫瘤的治療靶點。Daniele等［84-85］在多形性膠質母細胞瘤治療藥物研究中發(fā)現(xiàn)，新合成的吲哚基乙醛二肽及其衍生物結合TSPO后，可將P53從其與生理性抑制物鼠源性雙微粒體2的結合中解離出來，從而恢復P53的功能，進而長期、不可逆地誘導癌細胞凋亡。Ohshima等［86］運用RNA測序技術證實，211At-MABG（meta-211At-astato-benzylguanidine）的抗癌活性是通過P53信號通路實現(xiàn)的，在用211At-MABG治療的過程中，TSPO基因和蛋白表達明顯增加，提示TSPO可作為211At-MABG潛在的治療效應生物標志物。

大量研究表明，P53也可以直接影響線粒體的功能［87-88］。在對應激信號的反應中，P53從細胞質中快速地轉移至線粒體，并與抗凋亡和促凋亡Bcl-2家族成員相互作用，從而導致OMM通透性增強，釋放胱天蛋白酶誘導凋亡。由于P53的轉位先于MMP改變、Cyt c釋放和胱天蛋白酶激活［89］，提示該途徑誘導的細胞凋亡由P53介導，其具體機制尚不清楚。Green等［90］研究發(fā)現(xiàn)，靶向于線粒體基質的重組P53蛋白在線粒體功能障礙后迅速被釋放并轉移至細胞核，誘導細胞調亡。該過程伴隨著微管破壞、ROS蓄積和轉錄后修飾，而這些反應大多可被PK11195抑制，表明TSPO也參與其中（圖4）。

圖4 TSPO通過P53途徑誘導細胞凋亡.當TSPO受到刺激因子刺激導致線粒體功能障礙時，P53迅速從線粒體基質轉移到細胞核，從而啟動凋亡信號.

綜上，目前對于TSPO的研究集中于誘導各類異常細胞的凋亡，其機制主要依賴于對線粒體功能的調控，通過增加ROS的產生、Cyt c和P53釋放誘導細胞凋亡。因此，TSPO可作為一個理想的藥物靶點應用于腫瘤和相關心臟疾病的治療。

4 結語

TSPO與心血管疾病、神經退行性疾病、神經病理性疼痛、腫瘤和COPD等疾病密切相關，但現(xiàn)有的大量研究只關注TSPO與疾病的相關性，深入探討其具體作用機制的報道相對較少，這可能是由于TSPO在不同的組織或不同的腫瘤細胞中表達的差異比較大，給科研人員在研究其作用機制上帶來了困難。另一方面，將TSPO作為藥物作用靶點的研究不夠深入，對于TSPO結構的變化也鮮有報道。特定的空間結構決定了特定的生物學功能，在深入研究TSPO作用機制的同時，應探究其空間結構的變化對其生物學功能的影響。了解TSPO空間結構的變化有利于了解其在疾病中的作用，也有利于開發(fā)具有特異性和靶向性的藥物。

綜上所述，TSPO作為藥物靶點是一個可行的選擇，但仍需進一步明確TSPO與各種相關疾病之間的內在聯(lián)系。