一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定側(cè)柏葉中5種黃酮類成分的含量

劉星蕾，里艷茹，許函銖，李 映，尋 園，王 丹，周 驊，謝百波*

(1.北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司，北京102206；2.北京城市學(xué)院，北京100094)

側(cè)柏葉是臨床常用中藥之一，又名柏葉、扁柏、云片桕、叢柏葉等，是柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉[1]，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布。側(cè)柏葉為補(bǔ)陰要藥[2-3]，具有涼血止血、化痰止咳、消腫散毒、祛風(fēng)降濕、烏發(fā)生發(fā)等功效，臨床主要用于衄血、崩漏下血、吐血、略血、便血、血熱脫發(fā)、肺熱咳嗽、須發(fā)早白等。

側(cè)柏葉的化學(xué)成分復(fù)雜[4-8]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、萜類、無機(jī)元素等，具有抑菌、止血凝血、促進(jìn)血液循環(huán)、鎮(zhèn)咳祛痰、抗腫瘤和抗紅細(xì)胞氧化、抑制絡(luò)氨酸酶、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)靜、神經(jīng)保護(hù)、抑制腸道細(xì)菌生長(zhǎng)、烏發(fā)生發(fā)等多種藥理作用，其主要藥用有效成分是黃酮類和揮發(fā)油類。在側(cè)柏葉的多種黃酮類成分中，槲皮苷的含量最高，對(duì)于槲皮苷、蘆丁和穗花杉雙黃酮等成分的含量測(cè)定，也是側(cè)柏葉黃酮提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為常用的測(cè)定指標(biāo)[9-11]。

目前，關(guān)于黃酮類及揮發(fā)油成分提取、分離和含量測(cè)定的研究報(bào)道相對(duì)較多[7]，研究也相對(duì)充分，可以為中藥側(cè)柏葉中化學(xué)成分的一測(cè)多評(píng)研究提供一定參考。王娟弟等[12]采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了中藥側(cè)柏中楊梅苷、異槲皮苷、槲皮苷和穗花雙黃酮4種化學(xué)成分的含量；石典花等[13]以槲皮素為內(nèi)標(biāo)物，通過建立異槲皮苷、槲皮苷、山柰酚、穗花雙黃酮、扁柏雙黃酮的一測(cè)多評(píng)法，完善了側(cè)柏炭質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；丁航等[9]采用高效液相色譜法和紫外可見分光光度法兩種方法對(duì)側(cè)柏葉的黃酮含量進(jìn)行了比較；孟麗娟等[6]建立了4種成分包括楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的含量測(cè)定方法；宗珊珊等[14]測(cè)定了10批側(cè)柏葉藥材中楊梅苷、異槲皮苷、槲皮苷、穗花雙黃酮4種成分的含量，并建立了側(cè)柏葉的HPLC指紋圖譜。通過綜合分析已有研究成果，目前尚缺乏關(guān)于側(cè)柏葉一測(cè)多評(píng)的相關(guān)研究。因此，對(duì)中藥側(cè)柏葉中幾種含量較高的代表性成分進(jìn)行一測(cè)多評(píng)研究，對(duì)側(cè)柏葉資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

本研究擬采用高效液相色譜法建立側(cè)柏葉中5種黃酮類成分的一測(cè)多評(píng)方法。一測(cè)多評(píng)法(QAMS)以單味藥材或中成藥中的某一指標(biāo)成分作為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他待測(cè)成分之間的相對(duì)校正因子(RCF值)[15]，根據(jù)相對(duì)校正因子推算出該中藥幾種其他成分的含量，既能進(jìn)行多成分的質(zhì)量控制，又能解決對(duì)照品短缺和檢測(cè)成本過高的問題，是對(duì)中藥進(jìn)行含量測(cè)定和質(zhì)量控制的熱點(diǎn)和方向，目前該方法已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制[16]。

槲皮苷具有含量高、價(jià)格低廉、提取方法簡(jiǎn)單、分析結(jié)果準(zhǔn)確性高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，故本研究選擇槲皮苷為內(nèi)參物，測(cè)定5種成分間的相對(duì)校正因子，建立側(cè)柏葉中槲皮苷、楊梅苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等5種成分的一測(cè)多評(píng)分析方法。同時(shí)用外標(biāo)法測(cè)定5種成分的含量，與QAMS法測(cè)定的含量進(jìn)行比較，以考察方法的準(zhǔn)確度。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

側(cè)柏葉原藥材9批(見表1)，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李耀利博士鑒定為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉；試劑：甲醇、磷酸、乙腈、超純水，其中乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

表1 側(cè)柏葉藥材來源

對(duì)照品：楊梅苷(批號(hào)：PRF20051204)；槲皮苷(批號(hào)：PRF10010921)；阿福豆苷(批號(hào)：PRF10-122601)；穗花杉雙黃酮(批號(hào)：PRF20052701)；扁柏雙黃酮(批號(hào)：DST200522-099)。均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均≥98.00%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(Agilent Technologies)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；SPD-M20A高效液相色譜儀(島津企業(yè)管理有限公司)；電子天平(PL203，梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速多功能粉碎機(jī)(BJ-150，拜杰有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52AA，上海亞榮生化儀器廠)；超聲波清洗機(jī)(SB2512，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，10%～20% A；30～50 min，20%～40% A；50～90 min，40%～70% A；90～110 min，70%～100%A)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：355 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：按HPLC色譜條件精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，觀察峰形和對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間。專屬性試驗(yàn)：取空白溶劑陰性對(duì)照溶液，濾過，取續(xù)濾液10 μL，注入色譜儀，觀察空白溶劑對(duì)測(cè)定是否有干擾。結(jié)果顯示，混合對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同保留時(shí)間有相應(yīng)峰形，峰形對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象(見圖1)。根據(jù)測(cè)定后供試品溶液與混合對(duì)照品溶液的色譜圖所示，出峰順序依次為楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮。5種成分的分離度均>1.5，且與鄰近的雜質(zhì)分離度均>1.5?？瞻兹軇╆幮詫?duì)照溶液在測(cè)定峰位置無峰，表明空白溶劑對(duì)側(cè)柏葉的各組分含量測(cè)定無干擾。

注：A：空白溶劑陰性對(duì)照溶液；B：混合對(duì)照品溶液；C：側(cè)柏葉供試品溶液。1.楊梅苷；2.槲皮苷；3.阿福豆苷；4.穗花杉雙黃酮；5.扁柏雙黃酮。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取側(cè)柏葉藥材粗粉1.000 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，抽濾，取續(xù)濾液，減壓蒸干，加適量甲醇溶解，濾液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.619、0.958、0.557、0.597、0.133 mg/mL的各對(duì)照品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋制成6個(gè)適宜濃度的對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣濃度分別為：楊梅苷0.020、0.040、0.080、0.160、0.320、0.400 mg/mL，槲皮苷0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、0.958 mg/mL，阿福豆苷0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.100 mg/mL，穗花杉雙黃酮0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.200 mg/mL，扁柏雙黃酮0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.120 mg/mL，進(jìn)樣體積均為10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，考察結(jié)果見表2。

表2 5種黃酮類成分的線性關(guān)系和范圍

2.2.2 儀器精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，按照上述的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄峰面積，測(cè)定楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮5種成分的RSD值分別為0.130%、0.057%、0.064%、0.060%和0.192%，表明儀器精密度良好，符合測(cè)定要求。

2.2.3 日間精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，由1名實(shí)驗(yàn)人員，分別在3天內(nèi)，樣品每天按照上述色譜條件重復(fù)測(cè)定2次，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算側(cè)柏葉供試品溶液中楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮5種成分的RSD值分別為0.735%、0.581%、0.569%、0.928%和1.028%，表明此方法日間精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性考察 取同批購(gòu)買自安國(guó)市場(chǎng)的側(cè)柏葉樣品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成側(cè)柏葉供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，測(cè)得楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮每種成分平均含量分別為0.134%、0.282%、0.031%、0.040%、0.050%，其RSD值分別為2.110%、2.352%、2.352%、2.355%、2.339%，RSD值均≤3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在不同時(shí)間點(diǎn)，即0、2、4、8、12、24 h精密量取樣品10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮5種黃酮類成分的峰面積RSD值分別為1.145%、1.124%、1.431%、0.987%、0.987%，RSD值均≤2%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品6份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取并蒸干，用甲醇溶解，按樣品量的80%、100%、120%加入每種對(duì)照品儲(chǔ)備液，混勻，定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，分別精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD值。測(cè)得楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮5種黃酮類成分平均回收率分別為102.395%、101.111%、101.309%、99.331%、101.113%，RSD值分別為1.312%、1.120%、1.434%、0.855%、1.551%，RSD值均≤2%，表明該方法具有良好的回收率。

2.3 相對(duì)校正因子(RCF)考察

2.3.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 利用對(duì)照品溶液和確定的分析條件建立內(nèi)參物與待測(cè)成分之間的RCF。

校正因子計(jì)算公式為：fk/s=(Cs*Ak)/(Ck*As)

Cs為參照物質(zhì)量濃度，As為參照物色譜峰峰面積，Ck為其他對(duì)照組分質(zhì)量濃度，Ak為其他對(duì)照組分色譜峰峰面積[15]。

待測(cè)組分相對(duì)校正因子的計(jì)算：取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別按照“2.1.1”項(xiàng)下的HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL，進(jìn)樣6次，選擇槲皮苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算楊梅苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮4種成分的相對(duì)校正因子。測(cè)得4種成分的相對(duì)校正因子分別為0.938、1.119、0.553、0.663，RSD分別是0.076%、0.061%、0.044%、0.043%。

2.3.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 分別考察安捷倫1260 Infinity、島津SPD-M20A高效液相色譜儀2個(gè)品牌的高效液相色譜儀測(cè)定相對(duì)校正因子。分析發(fā)現(xiàn)，采用安捷倫1260 Infinity測(cè)定楊梅苷、阿福豆苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮的相對(duì)校正因子分別為0.938、1.119、0.553、0.663，RSD分別為0.076%、0.061%、0.044%、0.043%；采用島津SPD-M20A測(cè)定相對(duì)校正因子分別為0.940、1.117、0.553、0.662，RSD值分別為0.097%、0.046%、0.081%、0.054%，通過2個(gè)不同品牌的高效液相色譜儀測(cè)得各成分相對(duì)校正因子的RSD(n=6)均<3%，結(jié)果表明，不同的高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子影響較小。

2.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較

分別精密稱取9批不同產(chǎn)地的側(cè)柏葉藥材粉末1.000 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備，每批樣品平行制備6份，記錄各成分色譜峰峰面積，分別采用常規(guī)的外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各成分的含量，計(jì)算RSD值，比較兩種方法所得結(jié)果，計(jì)算相對(duì)誤差(RE)，見表3。根據(jù)一測(cè)多評(píng)法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)兩種測(cè)定方法所得9批不同產(chǎn)地側(cè)柏葉含量測(cè)定結(jié)果顯示，2種方法測(cè)定的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法可用于側(cè)柏葉中5種黃酮類化學(xué)成分的含量測(cè)定。

表3 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定5種成分的含量 (mg/g)

3 討論

一測(cè)多評(píng)法既能進(jìn)行多成分的質(zhì)量控制，又能解決對(duì)照品緊缺和檢測(cè)成本過高的問題，可作為中藥飲片、配方顆粒、中成藥等中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段，是中藥進(jìn)行含量測(cè)定和質(zhì)量控制的熱點(diǎn)方法和發(fā)展方向[16]。本研究首次將一測(cè)多評(píng)法用于側(cè)柏葉藥材的黃酮類化學(xué)成分含量測(cè)定，各項(xiàng)方法學(xué)考察結(jié)果均顯示實(shí)驗(yàn)方法符合定量分析要求。

一測(cè)多評(píng)法用于多成分的質(zhì)量控制，可同時(shí)解決對(duì)照品緊缺和檢測(cè)成本過高的問題，具有低成本的優(yōu)勢(shì)。因此，在內(nèi)參物的選擇上，本研究選擇經(jīng)濟(jì)易得、來源充足、含量較高且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的槲皮苷作為內(nèi)參物。

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)一測(cè)多評(píng)法與傳統(tǒng)的外標(biāo)法測(cè)定出的側(cè)柏葉中5種有效成分含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，兩者測(cè)定出的含量值沒有顯著性差異，準(zhǔn)確度良好。應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定側(cè)柏葉中黃酮類成分的含量，可有效應(yīng)對(duì)大量分離純化難度較高的化學(xué)對(duì)照品稀缺以及價(jià)格昂貴的局面，為側(cè)柏葉藥材以及相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了有力的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，填補(bǔ)了一測(cè)多評(píng)法測(cè)定中藥側(cè)柏葉黃酮類成分的研究空白。通過高效液相色譜法建立側(cè)柏葉中5種黃酮類成分的一測(cè)多評(píng)方法，實(shí)現(xiàn)了僅用槲皮苷1個(gè)對(duì)照品即可同時(shí)檢測(cè)側(cè)柏葉中5種黃酮化合物的含量，既進(jìn)行了多成分的質(zhì)量控制，又解決了對(duì)照品緊缺和檢測(cè)成本過高的問題，可為提高側(cè)柏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，為側(cè)柏葉的綜合利用與開發(fā)提供技術(shù)參考。