伴代謝綜合征精神分裂癥患者腸道菌群多樣性分析☆

邢夢娟 盛嘉玲 朱麗萍 陸穎 施凱 盧衛(wèi)紅

代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）是精神分裂癥患者最常見的代謝相關(guān)疾病，也是患者主要的致死因素[1]，然而精神分裂癥患者發(fā)生MetS的機(jī)制尚不明確。動物研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食飼喂引起肥胖的小鼠腸道微生物組成也顯著改變[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道菌群的構(gòu)成顯著改變[3]，還有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群構(gòu)成發(fā)生變化早于肥胖的發(fā)生[4]，因此，代謝紊亂與腸道菌群相關(guān)性的研究倍受關(guān)注[5]。然而，目前精神分裂癥伴MetS患者的腸道菌群特征尚未見報(bào)道。本研究用高通量測序檢測伴與不伴MetS的精神分裂癥患者腸道菌群16S rRNA，探索其腸道菌群特征，為精神分裂癥患者伴MetS的臨床診治和預(yù)防提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2021年6-12月在上海市第一民政精神衛(wèi)生中心住院的慢性精神分裂癥老年男性患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第五版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition, DSM-5）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡55～79歲；③病程≥10年，且維持目前抗精神病藥物治療方案半年以上；④血常規(guī)檢查在正常范圍。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重軀體疾病，如心肌梗死、腦梗死或感染；②近2個(gè)月內(nèi)有腹瀉；③近2個(gè)月內(nèi)使用過抗生素或益生菌類藥物；④存在精神活性物質(zhì)濫用或成癮物質(zhì)依賴；⑤共病符合DSM-5診斷標(biāo)準(zhǔn)的其它精神疾病。

根據(jù)是否伴有MetS將患者分組。MetS定義為符合以下標(biāo)準(zhǔn)的3條或以上：①肥胖，腰圍（WC）≥90 cm；②高血糖，空腹血糖（FPG）≥6.1 mmol/L和（或）確診為糖尿病并治療者；③高血壓，收縮壓/舒張壓≥130 mmHg/85 mmHg和（或）已確診為高血壓并治療者；④甘油三酯（TG）≥1.7 mmol/L；⑤高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）≤1.03 mmol/L。

共入組115例患者，其中伴MetS組57例，不伴MetS組58例。所有患者或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。本研究方案通過了上海市第一民政精神衛(wèi)生中心倫理委員會的倫理審查（編號：YJZXLL2022022）。

1.2 研究方法

1.2.1 腸道菌群DNA提取和16S rRNA測序 使用無菌糞便取樣器截取中段里部新鮮糞便3 g，置于5 mL EP離心管-20°C保存。腸道菌群基因組DNA使用CTAB法進(jìn)行提取，隨后檢測DNA的純度和濃度（1%瓊脂糖凝膠電泳法），使用無菌水將樣本的終濃度調(diào)整為1 ng/μL。對細(xì)菌V3-V4可變區(qū)的高保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用美國Bio-Rad公司的T100PCR儀器。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳純化，然后對目標(biāo)條帶割膠回收（Qiagen，Qiagen 膠回收試劑盒）。使用Illumina公司的建庫試 劑 盒（Illumina, USA，TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit）構(gòu)建文庫，以及用Qubit定量和檢測構(gòu)建好的文庫。文庫合格后在NovaSeq 6000 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。測序由深圳微科盟生物科技有限公司完成。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 使用QIIME2 dada2軟件對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控和修剪、去噪、拼接、去除嵌合體，得到用于生物信息學(xué)分析的特征序列表格[6]。將擴(kuò)增子序列變異（amplicon sequence variants，ASV）的代表序列比對到預(yù)先訓(xùn)練好的GREENGENES數(shù)據(jù)庫（13_8版本99%相似度）得到物種的分類信息表[7]。應(yīng)用ANCOM、ANOVA、Kruskal Wallis、LEfSe和DEseq2等方法鑒定兩組樣本間豐度有差異的細(xì)菌[8-10]。對檢測得到的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）使用Wilcox檢驗(yàn)進(jìn)行測序質(zhì)量的評估。采用觀察到的OTUs（observed OTUs）指數(shù)、Faith系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（Faith’s phylogenetics index, Faith_pd index）、Shannon指數(shù)等α多樣性指數(shù)評估樣本的多樣性程度。采用Bray Curtis指數(shù)、非加權(quán) UniFrac（unweighted UniFrac）指數(shù)等β多樣性指數(shù)評估兩組微生物群落結(jié)構(gòu)差異性。微生物群落與相關(guān)環(huán)境因子間的潛在關(guān)聯(lián)使用冗余分析（RDA）方法進(jìn)行分析，應(yīng)用PICRUSt2預(yù)測微生物群體可能的功能組成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組人口學(xué)資料及臨床資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分別采用Kruskal-Wallis法和ANOSIM法比較兩組患者腸道菌群的α和β多樣性指數(shù)。應(yīng)用線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）方法比較兩組患者腸道菌群物種類別。腸道菌群與空腹血糖、血脂、血壓等代謝指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。MetaCyc通路的比較首先采用ANOVA檢驗(yàn)，經(jīng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率法校正后結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再進(jìn)一步做Duncan檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況兩組患者年齡和舒張壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組的腰圍（t=62.648，P＜0.001）、空腹血糖（t=19.198，P＜0.001）、收縮壓（t=10.188，P=0.002）、高密度脂蛋白（t=38.166，P＜0.001）和甘油三酯（t=24.840，P＜0.001）水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 伴MetS組與不伴MetS組患者的基本情況

2.2 測序分析質(zhì)控及物種注釋與評估圖1示菌落Rank-Abundance曲線的形狀平緩，表明樣本的菌群群落均勻度和豐富度良好。該結(jié)果提示測序結(jié)果有效可靠，可進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 Rank-Abundance稀疏性曲線評估樣本測序的質(zhì)量 A為對全體115例樣本測序的OTU結(jié)果進(jìn)行分析來評估測序的質(zhì)量，B為對兩組樣本測序的OTU進(jìn)行分析來評估測序的質(zhì)量。

2.3 菌群α和β多樣性分析兩組α多樣性指標(biāo)中的 observed OTUs指數(shù)（H=3.811，P=0.051）和Faith_pd指數(shù)（H=2.920，P=0.088）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而綜合指數(shù)Shannon指數(shù)（H=6.853，P=0.009）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2A。

圖2 兩組精神分裂癥患者腸道菌群的α和β多樣性分析 A為腸道菌群α多樣性分析，B為腸道菌群β多樣性分析。ns，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；*，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

PCoA分析示，兩組的β多樣性指數(shù)Bray Curtis距離（R=0.140，P=0.001）和非加權(quán)Unifrac距離（R=0.083，P=0.003）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖2B。

2.4 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)差異分析伴MetS組精神分裂癥患者糞便擬桿菌門（Bacteroidetes）（LDA=4.158，P=0.015）、變形菌門（Proteobacteria）（LDA=3.992，P=0.031）及協(xié)同菌門（Synergistetes）（LDA=2.605，P=0.032）的相對豐度高于不伴MetS組患者；扁桃菌門（Lentisphaerae）（LDA=2.025，P=0.007）、梭桿菌門（Fusobacteria）（LDA=2.967，P=0.031）、厚壁菌門（Firmicutes）（LDA=4.486，P=0.001）及 CD12菌門（LDA=2.826，P=0.045）、SBR1093菌門（LDA=2.759，P=0.024）、GN04（LDA=2.373，P=0.004）、OP8菌門（LDA=2.226，P=0.002）及 NC10菌門（LDA=2.181，P=0.036）的相對豐度低于不伴MetS組患者。見圖3。

圖3 兩組的腸道菌群豐度差異 A為對LDA≥2的分類群進(jìn)行可視化；B為物種分類分支圖，展示兩組在門水平豐度差異最大的菌群。

2.5 菌群多樣性關(guān)聯(lián)分析所有患者空腹血糖與疣微菌門（Verrucomicrobia）（r=-0.215，P=0.021）、梭桿菌門（Fusobacteria）（r=-0.212，P=0.023）、扁桃菌門（Lentisphaerae）（r=-0.101，P=0.018）呈負(fù)相關(guān)，與OP3菌門呈正相關(guān)（r=0.187，P=0.046）。收縮壓與厚壁菌門（Firmicutes）（r=-0.256，P=0.006）、協(xié)同菌門（Synergistetes）（r=-0.204，P=0.028）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與螺旋菌門（Spirochaetes）（r=0.245，P=0.008）、氯菌門（Chlorobi）（r=0.202，P=0.030）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（r=0.245，P=0.008）呈正相關(guān)。舒張壓與硝化螺旋菌門（Nitrospirae）呈正相關(guān)（r=0.226，P=0.015）。HDL-c與OP3菌門（r=-0.218，P=0.019）及GAL15菌門（r=-0.230，P=0.014）呈負(fù)相關(guān)，與梭桿菌門（Fusobacteria）（r=0.234，P=0.012）、SAR406菌門（r=0.197，P=0.035）、OP8菌門（r=0.268，P=0.004）呈正相關(guān)。TG與疣微菌門（Verrucomicrobia）（r=-0.296，P=0.001）、梭桿菌門（Fusobacteria）（r=-0.209，P=0.025）呈負(fù)相關(guān)。見圖4。

圖4 精神分裂癥患者M(jìn)etS組份與門水平腸道菌群豐度的相關(guān)性熱圖 *表示MetS組份與菌群豐度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P＜0.05），紅色表示正相關(guān)性，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)性。

2.6 腸道菌群代謝通路的差異分析利用PICRUSt2對兩組精神分裂癥患者的腸道菌群進(jìn)行MetaCyc代謝通路的功能預(yù)測。MetaCyc途徑主要富集在生物合成途徑，如氨基酸生物合成、核苷生物合成等生物途徑。兩組間6條MetaCyc途徑的代謝差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），包括乙酸鹽產(chǎn)甲烷途徑（METH-ACETATE-PWY），嘌呤核堿降解I（厭氧）途徑（P164-PWY），腺苷核苷酸降解IV途徑（PWY-5532），甘油降解為丁醇途徑（PWY-7003），鈷（II）酰亞胺a，c-二酰胺的生物合成I（早期鈷插入）途徑（PWY-7377），硝酸鹽還原 VI（同化作用）途徑（PWY490-3）。見表2。

表2 伴MetS組與不伴MetS組在MetaCyc通路上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的通路

3 討論

微生物組是人類健康的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，被認(rèn)為是人體的“基本器官”，在維持健康中發(fā)揮非常重要的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)一些有意義的結(jié)果，如伴與不伴MetS的精神分裂癥患者腸道菌群分布存在顯著差異，腸道菌群與空腹血糖、血脂、血壓等存在相關(guān)性，機(jī)制預(yù)測發(fā)現(xiàn)腸道菌群可能通過影響糖代謝途徑、脂代謝途徑和氨基酸代謝途徑引起精神分裂癥患者出現(xiàn)MetS。

既往研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者（患或不患2型糖尿病組）在減重手術(shù)3個(gè)月后，兩組糞便菌群的α多樣性增加，而β多樣性下降至接近健康者[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常對照，2型糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，且微生物數(shù)量和多樣性下降[13-14]。本研究也發(fā)現(xiàn)伴與不伴MetS兩組患者存在腸道菌群的多樣性分布差異，這與既往的研究結(jié)論一致，提示不同代謝狀態(tài)存在腸道菌群的多樣性分布差異。

在腸道菌群與糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，前驅(qū)期糖尿病或2型糖尿病患者比正常血糖人群表現(xiàn)較低豐度的疣微菌門[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腹血糖與疣微菌門、梭桿菌門及熱敏菌門等存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，這在一定程度上與之前的研究結(jié)果相一致。然而，有研究提出糖尿病患者與非糖尿病人群的梭桿菌門并無差異[16]。本研究結(jié)果與之并不一致，分析出現(xiàn)腸道菌群構(gòu)成差異的可能原因是：其一，代謝綜合征的代謝紊亂與糖尿病的代謝異常并不完全一致；其二，精神分裂癥患者與正常人群相比本身呈現(xiàn)特異性的腸道菌群分布特征；其三，精神分裂癥伴MetS多因素相互作用也可能干擾腸道菌群的菌落結(jié)構(gòu)。

有研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者的厚壁菌門與擬桿菌門比例升高，腸道微生物的豐富度降低，在預(yù)防動脈粥樣硬化中有非常重要的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門及去鐵桿菌門等與血壓相關(guān)，在一定程度上支持腸道菌群在高血壓中的作用。其它研究還發(fā)現(xiàn)腸道菌群在肥胖形成過程中有重要作用[18]，如研究發(fā)現(xiàn)高脂膳食導(dǎo)致肥胖鼠腸道中厚壁菌門豐度增加、擬桿菌門豐度下降[19]。

生理狀態(tài)下，腸道微生物定殖于腸道粘膜表面以保持其正常的生理功能。高脂飲食攝入可引起腸道微物紊亂，表現(xiàn)為擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門豐度增加，使腸道通透性增加，更多內(nèi)毒素進(jìn)入血液，導(dǎo)致各種炎癥，進(jìn)而引起肥胖和胰島素抵抗等代謝相關(guān)疾病的形成[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)腸道菌群與血脂存在一定的相關(guān)性，如HDL-c與梭桿菌門豐度存在負(fù)相關(guān)性，TG與疣微菌門、梭桿菌門等呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，以及TC和LDL-c與疣微菌門等存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，綜上結(jié)果提示腸道菌群在精神分裂癥患者的血脂代謝紊亂中可能具有作用。

本研究也存在一定的局限性。如研究對象僅來自于一個(gè)醫(yī)療中心，可能代表性欠佳。本研究是橫斷面的數(shù)據(jù)分析，無法解釋MetS與腸道微生物多樣性間的因果關(guān)系。此外，本研究的對象為老年男性患者，由于性別也是引起腸道菌群分布差異的重要因素[21]，因此，將本研究結(jié)論推廣到精神分裂癥女性患者中需要謹(jǐn)慎。同時(shí)必須指出的是，本研究的對象是老年群體，年齡與代謝狀態(tài)和代謝效率是明確相關(guān)的，本研究結(jié)論如果推廣到非老年群體中需要進(jìn)一步地研究論證。

綜上所述，本研究探索了伴MetS精神分裂癥患者的腸道菌群多樣性差異，并對腸道菌群在MetS的作用進(jìn)了初步探索，識別出了伴MetS精神分裂癥患者的腸道菌群特征，為后續(xù)MetS的防治與診斷提供了可供參考的方法，也為深入研究精神分裂癥伴MetS的機(jī)制研究提供部分建議。