Caulobacter crescentus蔗糖水解酶突變體S271A的重組表達及其轉(zhuǎn)化蔗糖制備松二糖的研究

邢晨晨，王蕾，郭志勇，張康，陶秀梅，吳敬*

1(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

松二糖(turanose)分子式為C12H22O11，是一分子果糖和一分子葡萄糖以α-1,3糖苷鍵連接而成的還原性二糖，在自然界中基本以D-構(gòu)型存在，是蔗糖的同分異構(gòu)體[1]。松二糖存在于蜂蜜中，甜度是蔗糖的一半，其黏度、氣味和甜味持久性都和蔗糖相似[2-3]。與蔗糖相比，松二糖不能被致齲微生物發(fā)酵，具有不致齲齒的優(yōu)勢；同時，松二糖具有低熱量的特點，適合肥胖癥、高血脂、高血壓和糖尿病患者食用[4-5]。因此松二糖在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用于食品添加劑，并有可能取代蔗糖成為一種具有前景的新功能性甜味劑[6]。

用酶轉(zhuǎn)化法制備松二糖轉(zhuǎn)化率高，可控性強，并且反應(yīng)條件較溫和，因此有廣闊的前景。文獻報道制備松二糖的酶主要有2種：環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和淀粉蔗糖酶[2, 7-8]。SHIBUYA等[2]將α-環(huán)糊精和果糖作為底物，使用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶制備松二糖的產(chǎn)率為45%。WANG等[8]以2.5 mol/L蔗糖為底物，添加400 U/L多糖奈瑟球菌來源的淀粉蔗糖酶制備松二糖，其產(chǎn)率可達56%。AGARWAL等[9]將淀粉蔗糖酶在大腸桿菌中進行重組表達，經(jīng)酶轉(zhuǎn)化后松二糖產(chǎn)率為47%。SU等[7]構(gòu)建了多糖奈瑟球菌來源的淀粉蔗糖酶突變體(NpAS G396S)，在食品級菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中成功表達，經(jīng)酶轉(zhuǎn)化后松二糖產(chǎn)量為410 g/L，產(chǎn)率為60%，為單一底物制備松二糖的最高水平，但其產(chǎn)物中存在大量的副產(chǎn)物麥芽寡糖。此外，該酶的熱穩(wěn)定性較差，在30 ℃條件下半衰期僅為48 h，不利于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用[10]。

實驗室前期構(gòu)建了Caulobactercrescentus來源蔗糖水解酶的突變體S271A (CcSH S271A)，CcSH S271A是具有淀粉蔗糖酶特征的典型轉(zhuǎn)苷酶，可利用蔗糖為底物進行分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷(異構(gòu))反應(yīng)制備松二糖。GUO等[11]研究表明CcSH S271A還具有麥芽寡糖副產(chǎn)物少的特點，可代替淀粉蔗糖酶制備松二糖。本研究將ccshS271A的基因在B.subtilis中成功表達，然后利用該重組酶進行松二糖的制備，并對該酶催化蔗糖制備松二糖的酶轉(zhuǎn)化工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株B.subtilisWS11[12-13]、B.subtilisSCK6、含有ccsh和ccshS271A基因的重組質(zhì)粒pET-24a(+)-ccsh和pET-24a(+)-ccshS271A以及質(zhì)粒pUB110由本實驗室保藏；重組質(zhì)粒pUB110-ccshS271A和重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A由本研究構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 24，蛋白胨 12，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43，甘油 5。

2×Phanta Max Master Mix，諾唯贊(南京)生物科技技術(shù)股份有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌B.subtilis的構(gòu)建

依據(jù)質(zhì)粒pUB110和基因ccshS271A的核酸序列，設(shè)計以下引物(由5′→3′端，斜體代表同源臂序列)[14]。

P1：aaaaatcaaataaggagtgtcaagaatgattagtaccgcatcta-ttccgacc;

P2：agcttggaggtgtttttttattaccacgagcaactaaccaggtgatac;

P3：tggtatcacctggttagttgctcgtggtaataaaaaaacacctccaa-gctgagt;

P4：accgaagcagaaacagaacgccgccgatccaggagaacaaaa-acgattttttgag;

以質(zhì)粒pET-24a(+)-ccshS271A為模板，引物P1和P2擴增得到大小為1 827 bp的ccshS271A基因；以質(zhì)粒pUB110為模板，引物P3和P4擴增得到大小為7 276 bp的線性化質(zhì)粒。使用POE-PCR的方法將ccshS271A的基因片段和pUB110線性化質(zhì)粒進行連接[14]。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化B.subtilisSCK6[15-16]，獲得含有ccshS271A基因序列的重組質(zhì)粒pUB110-ccshS271A。重組質(zhì)粒進一步轉(zhuǎn)化B.subtilisWS11，對轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后由測序公司進行核酸序列檢測，獲得正確的重組質(zhì)粒和重組菌，并保存甘油菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A。

1.2.2 重組菌的搖瓶發(fā)酵及重組酶的制備

按2‰的接種量，將保存在甘油管中的菌液接種到LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。而后將培養(yǎng)8～10 h的種子液按5%的接種量接種到TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為33 ℃的恒溫搖床里，持續(xù)發(fā)酵24 h。重組酶為胞內(nèi)酶，收集發(fā)酵后的菌體，用50 mmol/L的pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液復(fù)溶后進行高壓勻漿破壁。破壁液體離心后收集上清液，即為重組酶的粗酶液。

1.2.3 蔗糖水解酶活力測定

使用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法對CcSH和CcSH S271A進行酶活力測定[17]。

用50 mmol/L的pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制0.3 mol/L蔗糖溶液作為底物。在具塞試管中加入1.9 mL的底物溶液，放置在水浴鍋中預(yù)熱10 min。預(yù)熱結(jié)束向具塞試管中加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的胞內(nèi)酶液后混勻，反應(yīng)10 min后加入3 mL的DNS溶液。而后在100 ℃水中煮沸7 min，并迅速放入冰水中進行冷卻。最后加入10 mL蒸餾水定容到15 mL，在OD540下測定吸光值。一個酶活力單位(U)為在上述條件下催化產(chǎn)生1 μmol/min還原糖當(dāng)量所需的酶量[8]。

1.2.4 蛋白質(zhì)的純化方法

采用Ni-Sepharose-HP柱將帶有His-Tag的重組酶粗酶液進行純化。粗酶液上樣結(jié)束后用A液進行沖洗，而后分別用體積分數(shù)為5%、10%和15% B液進行沖洗，最后用B液洗脫后收集所有的洗脫液，即為純化的重組酶。

結(jié)合緩沖液(A液)成分(mmol/L)：Tris-HCl 25，NaCl 500，調(diào)節(jié)pH至7.0。

洗脫緩沖液(B液)成分(mmol/L)：咪唑 300，Tris-HCl 25， NaCl 500，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

溫度對酶活力的影響：將酶在30、35、40、45、50、55 ℃條件下按照1.2.3所示方法進行酶活力測定。

溫度穩(wěn)定性的考察和半衰期的測定：將酶分別置于30、35、40、45 ℃的水浴鍋中，30、35 ℃每隔24 h取樣，40、45 ℃每隔8 h取樣，測定樣品的酶活力，考察酶的溫度穩(wěn)定性并測定半衰期。半衰期為酶活力下降為最初活力一半時所需的時間。

pH對酶活力的影響：用不同pH(5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液和不同pH(9.0、10.0、11.0)的50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制底物，并用上述不同pH的緩沖液將酶液稀釋至合適的倍數(shù)，在30 ℃的條件下測定酶活力。

pH穩(wěn)定性的考察：將上述用不同pH緩沖液稀釋的酶液在30 ℃水浴鍋中放置48 h后測定酶活力。

相對酶活力：定義最高酶活力為100%，其他條件下測得的酶活力與最高酶活力的相對值即為相對酶活力。

1.2.6 松二糖的酶轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

以不同濃度的蔗糖(1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)為底物，用不同pH (5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的緩沖液溶解底物，CcSH S271A分別以不同添加量(30、60、90、120、150 U/g蔗糖)添加至底物中，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、不同溫度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)的水浴搖床中反應(yīng)48 h。每次酶轉(zhuǎn)化工藝控制單一變量，逐步優(yōu)化。

1.2.7 HPLC檢測產(chǎn)物

將酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物離心取上清液，用水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后與乙腈等比例進行混合，并用0.22 μm的濾頭進行過濾。使用Agilent 1200 HPLC色譜儀的示差折光檢測器(refractive index detector，RID)進行檢測，色譜柱為(4.6 mm×250 mm，5 μm) Syncronis Amino Column，柱溫為35 ℃，流動相是體積分數(shù)為80%的乙腈和水的混合液，流速為0.8 mL/min，松二糖產(chǎn)率的計算如公式(1)所示：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖水解酶突變體在枯草芽孢桿菌中的構(gòu)建與表達

將1.2.1所示方法構(gòu)建成功的重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A按照1.2.2所示的方法獲得重組酶CcSH S271A，并進行SDS-PAGE分析。如圖1所示，泳道1在66.2 kDa附近有一條清晰的蛋白條帶，與CcSH S271A理論相對分子質(zhì)量(65.7 kDa)相符，且測得胞內(nèi)上清液的酶活力為3.0 U/mL，說明CcSH S271A在B.subtilisWS11中表達成功。

M-中分子質(zhì)量蛋白marker;1-重組菌胞內(nèi)上清液圖1 重組蛋白CcSH S271A的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CcSH S271A

2.2 C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的純化

對蔗糖水解酶野生型CcSH和突變體CcSH S271A進行純化，SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示，在泳道1和2的66.4 kDa附近有單一的蛋白條帶，與CcSH和CcSH S271A理論相對分子質(zhì)量相符，表明該酶達到電泳純。使用DNS法分別測定純化前后的野生型和突變體的酶活力，并用BRADFORD法[18]測定蛋白質(zhì)濃度，計算得出CcSH和CcSH S271A純化后的比活力分別為12.5、13.1 U/mg，說明單點突變S271A并未影響該酶的比活力。

M-低分子質(zhì)量蛋白marker;1-純化CcSH;2-純化CcSH S271A圖2 純化CcSH和CcSH S271A的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified CcSH and CcSH S271A

2.2.2 溫度對C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的影響

酶的三維結(jié)構(gòu)和分子熱運動會受溫度的影響，從而對酶結(jié)合和利用底物的能力產(chǎn)生影響，因此，酶促反應(yīng)的催化速率會受到溫度的影響[19-21]。如圖3所示，野生型和突變體的酶活力隨著溫度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢，最適溫度均為45 ℃，當(dāng)溫度超過50 ℃時酶活力驟降，說明酶促反應(yīng)時的溫度不宜過高。

圖3 溫度對CcSH和CcSH S271A反應(yīng)活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of CcSH and CcSH S271A

為了探究重組酶的熱穩(wěn)定性，分別測定該酶在30、35、40、45 ℃的半衰期。如圖4所示，在30、35、40、45 ℃時，野生型CcSH和突變體CcSH S271A半衰期分別為312、120、48、40 h。結(jié)果說明，30 ℃時野生型和突變體熱穩(wěn)定性最好。

a-30 ℃溫度穩(wěn)定性；b-35 ℃溫度穩(wěn)定性；c-40 ℃溫度穩(wěn)定性；d-45 ℃溫度穩(wěn)定性圖4 CcSH和CcSH S271A的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Thermostability of CcSH and CcSH S271A

2.2.3 pH對C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的影響

酶促反應(yīng)的pH會影響酶的解離狀態(tài)，影響酶促反應(yīng)的催化速率[22]。如圖5-a所示，CcSH和CcSH S271A的最適pH均為8.0，在偏酸和偏堿的條件下酶的催化活力均下降，pH在6.5～8.5時，相對酶活力均在85%以上，超過該pH范圍時，酶活力驟降。

a-CcSH和CcSH S271A的反應(yīng)活性；b-CcSH和CcSH S271A的穩(wěn)定性圖5 pH對CcSH和CcSH S271A反應(yīng)活性和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of CcSH and CcSH S271A

由圖4可知，CcSH和CcSH S271A在30 ℃時熱穩(wěn)定性最好，因此將上述不同pH的酶液在30 ℃水浴鍋中放置48 h后進行酶活力的測定，考察酶的pH穩(wěn)定性。如圖5-b所示，CcSH和CcSH S271A在偏堿或偏酸的條件下放置48 h后酶活力均下降明顯，pH在6.0～8.0酶活力較穩(wěn)定，相對酶活力均在80%以上，且在pH 8.0時該酶最穩(wěn)定。

2.3 C.crescentus蔗糖水解酶突變體制備松二糖的工藝優(yōu)化

以蔗糖為底物，突變體CcSH S271A合成的產(chǎn)物中松二糖占比最高，在初始酶轉(zhuǎn)化工藝條件下產(chǎn)率可達56.3%，而野生型在同等條件下松二糖產(chǎn)率僅為22.8%。因此選擇突變體CcSH S271A進行松二糖的制備，并從加酶量、初始pH、反應(yīng)溫度和蔗糖濃度4個方面對制備松二糖的工藝進行優(yōu)化。

加酶量對合成松二糖的影響：結(jié)果如圖6-a所示，松二糖的產(chǎn)量隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)加酶量為60 U/g蔗糖時，達到松二糖最高產(chǎn)率58.2%。過量添加酶會對松二糖的生成有負面影響，造成該現(xiàn)象的原因可能是CcSH S271A存在副反應(yīng)水解反應(yīng)[11]，在產(chǎn)物松二糖達到一定產(chǎn)量后，生成松二糖的轉(zhuǎn)苷(異構(gòu))反應(yīng)接近平衡狀態(tài)，此時加酶量的增加不會進一步增加松二糖的產(chǎn)量。但是，副反應(yīng)水解反應(yīng)隨加酶量的增加而增加，其水解底物蔗糖的能力加強，使得用于參與異構(gòu)反應(yīng)的底物量減少，導(dǎo)致松二糖的產(chǎn)量降低。

反應(yīng)溫度對合成松二糖的影響：在上述最優(yōu)加酶量的基礎(chǔ)上，對酶轉(zhuǎn)化的溫度進行優(yōu)化。結(jié)果如圖6-b 所示，在溫度為30 ℃時，達到松二糖的最高產(chǎn)率58.4%，隨著溫度的升高，松二糖的產(chǎn)率降低。此時的酶轉(zhuǎn)化最適溫度與酶促反應(yīng)的最適溫度不一致，分析推測原因主要有3點：第一，制備松二糖時利用的是CcSH S271A酶的轉(zhuǎn)苷活性，而利用DNS法檢測的是轉(zhuǎn)苷活性和水解活性的總活性，轉(zhuǎn)苷活性的最適溫度與該酶的轉(zhuǎn)苷和水解總活性的最適溫度不一致；第二，測定的酶活力考察的是短時間的酶催化性能，而酶轉(zhuǎn)化制備松二糖考察的是一段較長的時間內(nèi)酶的綜合性能，這段時間內(nèi)底物已經(jīng)部分轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，因此存在反應(yīng)的平衡問題；第三，如圖4所示，CcSH S271A在30 ℃時比在45 ℃時更穩(wěn)定，低溫下酶活力保持更久，使得松二糖產(chǎn)率較高。

初始pH對合成松二糖的影響：酶蛋白在一定的pH范圍內(nèi)酶活力相對穩(wěn)定，而pH過酸或者過堿時會導(dǎo)致酶蛋白的催化中心相同電荷的基團互相排斥，從而解離，這會使得酶蛋白變性失活。在上述最適加酶量和最適溫度的基礎(chǔ)上，對初始pH進行優(yōu)化。結(jié)果如圖6-c所示，當(dāng)pH為8.0時，達到松二糖的最高產(chǎn)率66.3%，隨著pH的升高，松二糖的產(chǎn)率迅速降低。

蔗糖濃度對合成松二糖的影響：在上述酶轉(zhuǎn)化工藝條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對底物蔗糖濃度進行優(yōu)化。結(jié)果如圖6-d所示，當(dāng)蔗糖濃度為2.0 mol/L時，松二糖的產(chǎn)量為453.5 g/L，產(chǎn)率可達66.3%，比SU等[7]報道的在相同的酶轉(zhuǎn)化條件下的松二糖產(chǎn)量提高了43.5 g/L。

a-催化制備松二糖的CcSH S271A加酶量優(yōu)化；b-催化制備松二糖的溫度優(yōu)化；c-催化制備松二糖的初始pH優(yōu)化；d-催化制備松二糖的初始蔗糖濃度優(yōu)化圖6 C.crescentus蔗糖水解酶突變體制備松二糖的工藝優(yōu)化Fig.6 Process optimization of the C.crescentus sucrose hydrolase mutant for the preparation of turanose

3 結(jié)論

本研究將C.crescentus來源蔗糖水解酶突變體ccshS271A的基因與表達載體pUB110連接轉(zhuǎn)入食品安全級菌株B.subtilisWS11，獲得重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A。對CcSH S271A的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，該酶在45 ℃、pH 8.0的條件下酶活力最高，且在30 ℃條件下熱穩(wěn)定性最好，半衰期為312 h，比常用作制備松二糖的淀粉蔗糖酶高264 h[10]。而后對CcSH S271A制備松二糖的酶轉(zhuǎn)化工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化，最終獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，在pH 8.0，30 ℃的條件下，以2.0 mol/L蔗糖為底物，添加60 U/g蔗糖的CcSH S271A制備松二糖，產(chǎn)率為66.3%，為目前報道的最高松二糖產(chǎn)率[7]，為工業(yè)上大體系進行酶轉(zhuǎn)化制備松二糖提供了理論依據(jù)。