深綠木霉TA-9 分生孢子固體發(fā)酵的響應(yīng)曲面法優(yōu)化

劉世祥, 張榮勝, 劉永鋒, 谷祖敏, 于俊杰*,

(1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，南京 210014)

木霉在土壤中和植物上分布廣泛，是一種具有生防潛力且資源豐富的微生物，以木霉屬真菌為核心開發(fā)的生物防治菌劑是目前主要的生物農(nóng)藥類型之一[1-3]。目前已報(bào)道具有較好生防作用的木霉屬真菌包括哈茨木霉Trichoderma harzianum、棘孢木霉T. asperellum、康寧木霉T. koningii、擬康寧木霉T. pseudokoningii、綠色木霉T. virens、深綠木霉T. atrovirens和長(zhǎng)枝木霉T. longibrachiaum等[4-5]，其中多種深綠木霉被發(fā)現(xiàn)具有拮抗、重寄生、誘導(dǎo)植物抗病性等作用[6-10]。在前期研究中分離到一株深綠木霉TA-9，該菌株對(duì)稻曲病菌和水稻紋枯病菌具有重寄生作用，將其發(fā)酵混合物稀釋后噴施水稻，對(duì)稻曲病和水稻紋枯病均具有較好的防控效果[11]。木霉的分生孢子相較其菌絲具有抗逆性強(qiáng)、易貯存等優(yōu)點(diǎn)，通?？衫媚久狗稚咦舆M(jìn)一步開發(fā)形成相關(guān)植物病害生防制劑[12-13]。初步固體發(fā)酵結(jié)果表明，深綠木霉TA-9 能產(chǎn)生大量的分生孢子，但是較已報(bào)道的木霉分生孢子產(chǎn)量稍低，應(yīng)仍有一定的優(yōu)化提高產(chǎn)量的空間。

目前，國(guó)內(nèi)外通過固體發(fā)酵獲得木霉菌分生孢子的研究很多，通常是采用當(dāng)?shù)匾撰@得的廉價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)基或者農(nóng)業(yè)加工中產(chǎn)生的廢料[14-15]，如米糠、玉米秸稈、稻麥秸稈、椰子殼粉、酒糟等。本研究中，使用在我國(guó)稻麥種植區(qū)常見農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)品麥麩和谷殼作為主要發(fā)酵基質(zhì)，并在其中添加低價(jià)值、易獲得的補(bǔ)充碳氮源、無(wú)機(jī)鹽和微量元素。Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法是優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的重要研究方法，本研究擬通過系統(tǒng)的研究探索，以期獲得低成本、高產(chǎn)出的深綠木霉分生孢子的固體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并為該深綠木霉生防菌劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

深綠木霉Trichoderma atrovirideTA-9 菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害研究室分離和保存。

1.2 培養(yǎng)基

PSB 培養(yǎng)基：將200 g 去皮馬鈴薯煮沸濾出液和20 g 蔗糖混合，定容至1 L。PSA 培養(yǎng)基：在PSB 培養(yǎng)基中加入16～20 g 瓊脂粉。

發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液：將蔗糖40%、硫酸銨2%、磷酸二氫鉀2%、微量元素母液 (體積比) 1%、酶水解酪蛋白0.6%和黃豆粉2%混合，加熱后備用。

微量元素母液 (1 L)：H3BO3、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O 和Na2MoO4·2H2O 各100 mg[16]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵種子液的制備 將深綠木霉TA-9 分生孢子在PSA 培養(yǎng)基中涂布均勻，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，從菌落邊緣挑取適量菌絲接種于PSB 培養(yǎng)液中，于25 ℃、120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)6 d 后，用無(wú)菌紗布過濾除去菌絲，獲得深綠木霉分生孢子，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)至每毫升1 × 107個(gè)孢子，待用。

1.3.2 深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵產(chǎn)物中分生孢子含量的測(cè)定 固體發(fā)酵物于45 ℃烘干3 h 至完全干燥。稱取1 g 發(fā)酵物，用含0.1%吐溫-80 的無(wú)菌水稀釋，渦旋振蕩1min 后，用移液槍吸取適量菌液，使用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)深綠木霉TA-9 孢子的數(shù)量，3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 深綠木霉TA-9 產(chǎn)分生孢子固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.3.1 培養(yǎng)基關(guān)鍵因素的篩選 培養(yǎng)基組分關(guān)鍵因子篩選：采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)(PB)[17]。從A1-蔗糖 (10%～30%)、B1-硫酸銨 (0.8%～1.2%)、C1-磷酸二氫鉀 (0.8%～1.2%)、D1-混合礦物質(zhì)(0.2%～0.8%)、E1-酪氨酸 (0.1%～0.5%)和F1-黃豆粉 (0.8%～1.2%) 6 個(gè)因素中篩選關(guān)鍵因子。試驗(yàn)中每因素取2 水平：即高水平 “1” (范圍區(qū)間最大值)和低水平 “?1” (范圍區(qū)間最小值)。試驗(yàn)中設(shè)計(jì)5 個(gè)冗余變量：G1、H1、I1、J1、K1。

培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子篩選：采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)。從A2-溫度 (20～28 ℃)、B2-發(fā)酵時(shí)間 (6～8 d)、C2-接種濃度 (1 × 104～1 × 106個(gè)孢子/mL)、D2-含水率 (35%～55%)、E2-攪拌周期 (24～60 h)和F2-種子液菌齡 (6～8 d) 6 個(gè)因素中篩選對(duì)菌株TA-9 生長(zhǎng)具有顯著影響的因子。試驗(yàn)中每因素取2 水平：即高水平 “1” 和低水平 “?1”。試驗(yàn)中設(shè)計(jì)5 個(gè)冗余變量：G2、H2、I2、J2和K2。每組試驗(yàn)3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.3.2 最陡爬坡的試驗(yàn) 參考培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子試驗(yàn)篩選結(jié)果，分別從以上因素中篩選出3 個(gè)最關(guān)鍵影響因子，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)模型中各變量的系數(shù)確定關(guān)鍵因素的爬坡方向和步長(zhǎng)[18]，確定關(guān)鍵因素的最優(yōu)范圍，以此得到的深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量最大點(diǎn)成為中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心點(diǎn)，從而確定培養(yǎng)基關(guān)鍵組分的添加質(zhì)量比范圍和培養(yǎng)條件的范圍。

對(duì)承包人制定的施工方案內(nèi)容和完整度進(jìn)行考核；技術(shù)方案要求嚴(yán)格執(zhí)行專家組匯商、領(lǐng)導(dǎo)審批的流程，對(duì)是否執(zhí)行審批流程情況進(jìn)行考核；對(duì)承包人交底流程及監(jiān)控力度進(jìn)行考核；對(duì)重點(diǎn)環(huán)節(jié)的驗(yàn)收制度進(jìn)行考核；對(duì)井隊(duì)進(jìn)行特殊環(huán)節(jié)作業(yè)的負(fù)責(zé)人進(jìn)行考核。

1.3.3.3 關(guān)鍵因素中心組合的試驗(yàn) 以Box-Behnken 響應(yīng)曲面法(BBD)設(shè)計(jì)3 因子2 水平設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。以深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。預(yù)測(cè)深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量達(dá)到最大值所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵因子參數(shù)。

1.3.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 培養(yǎng)基關(guān)鍵因素的篩選設(shè)計(jì)和Box-Behnken 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)。利用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分中的顯著影響因子

由于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中麥麩和谷殼的比例在前期試驗(yàn)中已經(jīng)過優(yōu)化，本試驗(yàn)中將通過Plackett-Burman 法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以明確發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)組分。對(duì)初始發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、微量元素母液、酶水解酪蛋白和黃豆粉共6 組影響分生孢子產(chǎn)生的因素進(jìn)行考察，同時(shí)設(shè)置空項(xiàng)以估計(jì)試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示，每個(gè)因素取高低2 個(gè)水平。在接種量1%、溫度25 ℃光照培養(yǎng)的條件下發(fā)酵7 d。檢測(cè)結(jié)果如表1 所示，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析得到最佳擬合方程為Y1= 106.52?63.43A1+10.39B1+ 11.54C1+ 1.89D1+ 0.94E1?4.39F1，公式中Y1為深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值。由校正系數(shù)可知Y1的變化有91.32%能被回歸方程解釋，表明該模型對(duì)培養(yǎng)基關(guān)鍵影響因子有作用。表2 中顯示的數(shù)據(jù)證明擬合的回歸方程是合理的(P<0.05)，6 個(gè)因素中關(guān)鍵影響因子為蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀，這3 個(gè)關(guān)鍵因子變化顯著影響深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量 (P<0.05)。

表1 培養(yǎng)基關(guān)鍵因素PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of PB test on key factors of culture medium

表2 培養(yǎng)基關(guān)鍵因素PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Table 2 Variance analysis of the design of PB test for key factors of culture medium

由試驗(yàn)分析結(jié)果可知，培養(yǎng)基組分中影響深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵孢子產(chǎn)量的關(guān)鍵因子為蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀。關(guān)鍵因子的爬坡方向由方程的各變量系數(shù)確定，培養(yǎng)基組分最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，關(guān)鍵因素組合不同，深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量不同，深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量最大值的編號(hào)為2，響應(yīng)曲面試驗(yàn)的中心值選擇該組編號(hào)數(shù)據(jù) 。

表3 培養(yǎng)基組分最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of the steepest climb of medium components

2.2 培養(yǎng)基組分關(guān)鍵因子的最優(yōu)配比

以蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀3 個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，得到關(guān)鍵因子編碼方程為Y2= 236.55?1.24A1+ 2.42B1+ 0.85C1+8.83A1B1+ 0.97A1C1+ 8.83B1C1? 6.12A12?30.43B12?12.96C12。公式中Y2為孢子產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值。檢驗(yàn)表明R2= 0.9977，校正R2= 0.9836；關(guān)鍵因子對(duì)Y的影響中有98.36%能被回歸方程解釋，回歸方程的方差分析結(jié)果顯示回歸方程具有顯著性 (P<0.05)。繪制蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線，圖1可直觀反映出深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量受到的影響。通過回歸方程計(jì)算得出，培養(yǎng)基中蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀質(zhì)量比分別為24.75%、0.88%和0.88%時(shí)響應(yīng)值最大。對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基組分最優(yōu)配比為：麥麩30%，谷殼20%，蔗糖24.65%，硫酸銨0.88%，磷酸二氫鉀0.88%，黃豆粉1%，混合礦物質(zhì)0.5%，酶水解酪蛋白0.3%。

2.3 培養(yǎng)條件中的顯著影響因子

按照培養(yǎng)基最優(yōu)配比配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，隨后對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種孢子濃度、含水率、攪拌周期和種子液菌齡共6 組影響分生孢子產(chǎn)生的培養(yǎng)條件因素進(jìn)行考察，同時(shí)設(shè)置空項(xiàng)以估計(jì)試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4 所示，每個(gè)因素取高低2 個(gè)水平。通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的影響關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表4。關(guān)鍵培養(yǎng)條件因素編碼方程為Y3= 212.40 ? 6.87A2+ 1.71B2+ 25.97C2+77.36D2+ 1.97E2+ 3.25F2，R2= 0.9745，校正R2=0.9206。公式中Y3為深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值。由校正系數(shù)可知，Y3的變化中92.06%能被回歸方程解釋，表明該模型對(duì)培養(yǎng)基關(guān)鍵影響因子有作用，最大產(chǎn)孢量為編號(hào)為10 的組合，孢子產(chǎn)量為2.2 × 1010個(gè)/g。從表5 可以得知，回歸方程顯著 (P<0.01)。溫度、接種濃度和含水率在6 個(gè)培養(yǎng)因素中是關(guān)鍵因子，其變化顯著影響深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量。

2.4 培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子的最優(yōu)范圍

影響深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量的關(guān)鍵因子為溫度、接種濃度和含水率，得到培養(yǎng)條件因素編碼方程，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。關(guān)鍵因子的爬坡方向由方程各變量系數(shù)確定，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表中可以看出，不同組合深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量不同，產(chǎn)量最大組合編號(hào)為3，孢子產(chǎn)量為2.1 × 1010個(gè)/g，響應(yīng)曲面試驗(yàn)的中心值選擇該編號(hào)，繼續(xù)開展試驗(yàn)。

表6 培養(yǎng)條件最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of steepest climb test under culture conditions

2.5 培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子的最優(yōu)配比

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果 (表6) 確定了Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各水平取值 (表7)，以溫度、接種濃度和含水率3 個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，對(duì)深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到關(guān)鍵因子動(dòng)態(tài)模型為Y4= 298.01 +4.96A2? 6.79B2? 0.083C2+ 1.08A2B2? 2.17A2C2?21.50B2C2? 46.29A22?39.29B22? 22.88C22。R2= 0.9951，校正R2= 0.9852。公式中Y4為深綠木霉TA-9 孢子產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值。表明該回歸方程有98.52%的概率去解釋關(guān)鍵因素對(duì)Y4的影響，顯示回歸方程具有顯著性。

表7 培養(yǎng)條件BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Culture conditions BBD test design and results

由Design Expert8.0.6 根據(jù)表7 數(shù)據(jù)得到的響應(yīng)曲面圖 (圖2)，揭示了溫度、接種濃度和含水率3 種關(guān)鍵因子兩兩相互作用對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響。由響應(yīng)曲面規(guī)范分析可知，回歸模型存在最大值，當(dāng)接種濃度5.2 × 105個(gè)/g 和含水率48.1%時(shí)，在種子液菌齡6 d、24.1 ℃光照培養(yǎng)、接種60 h 后攪拌、靜置發(fā)酵至8 d 條件下，預(yù)測(cè)分生孢子產(chǎn)量最大值為2.24 × 1010個(gè)/g。

圖2 培養(yǎng)溫度、接種濃度和含水率影響深綠木霉TA-9 分生孢子產(chǎn)量的等高線(A、C、 E)和響應(yīng)曲面（B、D、F）Fig. 2 Contour (A, C, E) and response surface (B, D, F) of culture temperature, concentration of inoculated conidia and moisture content affecting conidial yield of Trichoderma atroviride TA-9

2.6 試驗(yàn)結(jié)果的發(fā)酵驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的可靠性，根據(jù)預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件進(jìn)行4 次重復(fù)試驗(yàn)，深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量為2.44 × 1010個(gè)/g，實(shí)際值比預(yù)測(cè)值略高 (P<0.01)，表明所構(gòu)建的模型可靠，能夠較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)真實(shí)值。初始培養(yǎng)條件下，深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量為1.84 × 1010個(gè)/g，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件與初始培養(yǎng)條件相比，其分生孢子產(chǎn)量提高了30.98%，顯示了較好的優(yōu)化效果。為了進(jìn)一步檢測(cè)分生孢子的萌發(fā)活性，通過涂布PSA 培養(yǎng)基測(cè)定了文中所述最佳發(fā)酵條件下獲得的分生孢子的萌發(fā)率。結(jié)果顯示，發(fā)酵完成后收集的深綠木霉TA-9 分生孢子平均萌發(fā)率為99.2%；在45 ℃熱風(fēng)處理3 h 并完全烘干后，其平均萌發(fā)率仍可達(dá)93.6%，可用于進(jìn)一步劑型加工。

3 討論

由于木霉的分生孢子具有易發(fā)酵、易保存、易加工制劑的優(yōu)點(diǎn)，目前木霉生防制劑大多是利用其固體發(fā)酵產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)一步加工形成的[10,19]，但目前大多數(shù)木霉固體發(fā)酵響應(yīng)曲面優(yōu)化研究主要集中在固體發(fā)酵產(chǎn)生工業(yè)用酶、次生代謝產(chǎn)物等方面[20-22]，研究涉及木霉的分生孢子發(fā)酵的優(yōu)化不多，且大多使用單因素或正交法優(yōu)化木霉的分生孢子固體發(fā)酵。僅有少數(shù)研究通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化綠色木霉的分生孢子發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[23]，但該研究并未涉及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。本研究前期分離獲得生防深綠木霉菌株TA-9，為進(jìn)一步開發(fā)基于TA-9 的木霉生防菌劑，通過響應(yīng)曲面法較為全面地優(yōu)化了固體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。考慮結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)，本研究采用在我國(guó)稻麥種植區(qū)成本低廉的麥麩和谷殼作為主要發(fā)酵原料，通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)行篩選；通過最陡爬坡試驗(yàn)確定關(guān)鍵因子的最適濃度范圍；選取蔗糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀作為發(fā)酵基質(zhì)中重要影響因子，選取培養(yǎng)溫度、接種濃度和含水率作為發(fā)酵條件中的重要影響因子，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并借助Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并確定優(yōu)化條件，通過試驗(yàn)驗(yàn)證得到最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，提高了分生孢子產(chǎn)量30%以上。鑒于本研究中探索深綠木霉固體發(fā)酵工藝是為進(jìn)一步進(jìn)行木霉制劑加工作準(zhǔn)備，因而不僅要提高分生孢子產(chǎn)量，而且需要保證其具有較高萌發(fā)活性。研究中檢測(cè)了新鮮發(fā)酵和烘干后分生孢子的萌發(fā)率，確認(rèn)了發(fā)酵獲得的分生孢子具有較好的萌發(fā)活性，并適合進(jìn)一步的制劑加工。本研究為進(jìn)一步的工業(yè)化發(fā)酵提供了理論基礎(chǔ)。

前期單因素研究中，已確定了谷殼和麩皮的使用質(zhì)量比為2:3 時(shí)分生孢子產(chǎn)量最高，其中谷殼具有疏松固體培養(yǎng)基、調(diào)節(jié)通氣量的作用，本研究中作為培養(yǎng)基中的固定成分，不在響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基的研究中進(jìn)行評(píng)估。前期研究中同時(shí)確定了蔗糖為主要碳源、麩皮為輔助碳源；硫酸銨為主要氮源、酶水解酪蛋白和黃豆粉作為輔助氮源；其中蔗糖和硫酸銨作為可直接利用的碳、氮源，有助于發(fā)酵前期木霉的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)生分生孢子。此外，磷酸二氫鉀和微量元素混合液對(duì)深綠木霉TA-9 的分生孢子形成也具有較好的促進(jìn)作用。通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化，最終確定了最優(yōu)培養(yǎng)基為：麥麩30%、谷殼20%、蔗糖24.65%，硫酸銨0.88%，磷酸二氫鉀0.88%，黃豆粉1%，混合礦物質(zhì)0.5%，酶水解酪蛋白0.3%。

本研究也進(jìn)一步優(yōu)化了固體發(fā)酵條件，最終確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為：接種濃度每克基質(zhì)含5.2 ×105個(gè)孢子、含水率48.1%、種子液菌齡6 d、24.1 ℃光照培養(yǎng)、接種60 h 后攪拌，隨后靜置發(fā)酵至8 d。鑒于本研究前期通過單因素試驗(yàn)考察了多種光照條件下深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子的產(chǎn)量，結(jié)果如下：全光照培養(yǎng) >光暗交替(光18 h，暗6 h) >光暗交替 (光12 h，暗12 h) >光暗交替 (光6 h，暗18 h) >全黑暗培養(yǎng)，因而本研究中使用全光照條件進(jìn)行固體發(fā)酵，并未將其作為重要發(fā)酵條件因子通過響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化。然而，已報(bào)道的木霉菌固體發(fā)酵相關(guān)研究結(jié)果表明，光暗交替條件通常有利于木霉菌分生孢子形成[24-26]，與本研究結(jié)果并不一致。提示木霉菌菌株個(gè)體在產(chǎn)生分生孢子時(shí)對(duì)光照條件的反應(yīng)可能會(huì)有所差異，針對(duì)不同的木霉菌菌株個(gè)體，仍需要考察光照周期對(duì)其產(chǎn)生分生孢子的影響。此外，光照強(qiáng)度、偏好波長(zhǎng)等因素對(duì)木霉菌分生孢子形成的影響也需要進(jìn)一步研究。

在響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件后，預(yù)測(cè)分生孢子產(chǎn)量最大值為每克培養(yǎng)基含2.24 × 1010個(gè)孢子，而以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)，深綠木霉TA-9 固體發(fā)酵實(shí)際獲得分生孢子產(chǎn)量為2.44 × 1010個(gè)/g，且分生孢子在烘干后仍具有較好的萌發(fā)活性，有利于進(jìn)行木霉菌劑的制備和生產(chǎn)。本研究結(jié)果可為大規(guī)模發(fā)酵提供依據(jù)，但在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)仍需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)，本研究還可為其他木霉以及真菌的固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的優(yōu)化提供參考。