河南省假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性

殷消茹, 徐建強*,, 孫 瑩, 朱 凱, 楊 霞,熊 姿, 鄭 偉, 侯 穎

(1. 河南科技大學 園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471003；2. 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

近年來，由于秸稈還田等耕作栽培措施的推廣，主要由假禾谷鐮刀菌Fusarium pseudograminearum引起的小麥莖基腐病成為一個日益嚴重的病害[1]。該病害在我國的黃淮麥區(qū)和華東麥區(qū)已普遍發(fā)生，帶來的產(chǎn)量損失越來越嚴重[2-3]。由于目前尚無免疫及高抗品種可用，且尚無登記應(yīng)用在小麥莖基腐病防治上的農(nóng)化產(chǎn)品，生產(chǎn)中急需篩選一批對小麥莖基腐病有防治效果的化學藥劑[4]。

多菌靈是20 世紀70 年代研發(fā)的苯并咪唑類類殺菌劑，對20 多種重要作物的重大病害均有很好的防治效果[5]。目前，共有6 種劑型被廣泛應(yīng)用在麥類、水稻、棉花、油菜、花生等多種作物上。盡管有些病菌對多菌靈已產(chǎn)生了嚴重的抗性[6-8]，但截至目前尚未見有關(guān)假禾谷鐮刀菌對多菌靈敏感性的報道。本研究采用菌絲生長速率法測定了2019 年采自河南省8 個地市的90 株假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性，建立了敏感性基線，并分析不同地市菌株對多菌靈的敏感性差異，以評估多菌靈在小麥莖基腐病防治上的應(yīng)用前景，旨在為生產(chǎn)中小麥莖基腐病的高效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：于2019 年4–5 月份，從河南省8 個地市采集具有典型發(fā)病癥狀的莖基腐病株。將接近地面莖節(jié)交界處有霉層的部位剪下，放在加有乳酸的PSA 平板上，待長出菌落后轉(zhuǎn)接保存。共分離439 株鐮刀菌。從各地市選取有代表性的菌株，共150 株進行單孢分離，對獲得的單孢菌株利用假禾谷鐮刀菌 (Fpg-F，5′-CGGGGTAGTTT CACATTTCCG-3′/Fpg-R，5′-GAGAATGTGAT GACGACAATA-3′；擴增長度520 bp) 和禾谷鐮刀菌 (Fg-F，5′-TTCTTTGACATCTGTTCAACC CA-3′/Fg-R，5′-ACAGATGACAAGATTCAGG CACA-3′，280 bp) 特異性引物進行分子鑒定，共獲得假禾谷鐮刀菌菌株105 株[9-10]。選取其中的90 株供試。

供試小麥品種：鄭麥366，由河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所楊麗榮研究員提供。

供試藥劑：98%多菌靈 (carbendazim) 原藥，山東雙星農(nóng)藥廠；98%戊唑醇 (tebuconazole) 原藥，廣西田園生化股份有限公司；97.9%咯菌腈(fludioxonil) 原藥，先正達 (中國) 投資有限公司。多菌靈原藥預溶于0.2 mol/L 的稀鹽酸中，戊唑醇和咯菌腈原藥均預溶于丙酮中，均配制成1.0×104μg/mL 的母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。50%多菌靈可濕性粉劑，江蘇揚農(nóng)化工集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多菌靈對假禾谷鐮刀菌最低抑制濃度測定

隨機選取漯河舞鋼菌株JFLW-8 和JFLW-10、信陽市菌株JFXY-17 和JFXY-19，采用菌絲生長速率法[11]測定多菌靈對假禾谷鐮刀菌菌絲生長的最低抑制濃度 (minimum inhibitory concentration，MIC)。將新鮮菌餅接入藥劑質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、1.2、2.4 μg/mL 的PSA 平板上，以不含藥劑的PSA 平板作對照。每處理3 個重復。28 ℃培養(yǎng)3 d 后，觀察各藥劑濃度處理下的菌落形態(tài)，以供試的全部菌株菌絲生長受到抑制的最小濃度作為多菌靈對假禾谷鐮刀菌的MIC[11]。用十字交叉法測量菌落的直徑，計算每種濃度處理下藥劑對菌絲的生長抑制率。

1.2.2 假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性測定 根據(jù)測定的MIC 值，將多菌靈原藥溶于0.1 μg/mL的稀鹽酸中，設(shè)置0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 和0.8 μg/mL 的系列質(zhì)量濃度，依次測定多菌靈對90 株假禾谷鐮刀菌的毒力[12]。利用Excel 2007 和DPS6.55 計算藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和有效中濃度 (EC50)。

1.2.3 敏感性分布圖繪制及敏感性基線確定 將多菌靈對假禾谷鐮刀菌菌絲生長的EC50值從低到高分為4 個區(qū)間，從最小值開始，統(tǒng)計EC50值在每個區(qū)間的菌株數(shù)和頻率。以每個區(qū)間的EC50平均值為橫坐標，菌株分布頻率為縱坐標，繪制假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性頻率分布圖，并利用DPS6.55 進行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗。以多菌靈對正態(tài)性分布菌株的EC50平均值作為該病菌對多菌靈的敏感性基線[12]。

1.2.4 假禾谷鐮刀菌對多菌靈和對戊唑醇、咯菌腈敏感性之間的相關(guān)性 從90 株假禾谷鐮刀菌中隨機選擇對多菌靈敏感性不同的40 株病菌，采用菌絲生長速率法[13]，分別測定其對戊唑醇和咯菌腈的敏感性，戊唑醇的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 和1.0 μg/mL，咯菌腈的設(shè)置為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 μg/mL。每處理設(shè)3 個重復，以不含藥劑的PSA 平板作對照。將多菌靈對菌株的EC50值作為x軸，戊唑醇或咯菌腈對菌株的EC50值作為y軸，進行線性回歸分析，求出線性回歸方程y=bx+a，根據(jù)決定系數(shù) (R2) 、b值及F檢驗的顯著水平 (P值) ，分析多菌靈對假禾谷鐮刀菌的毒力和戊唑醇、咯菌腈之間的相關(guān)性：若P<0.05，b值為正，R2>0.8，則兩種藥劑之間存在正相關(guān)；若b值為負，R2>0.8，則兩種藥劑之間存在負相關(guān)；若P>0.05，兩種藥劑之間無相關(guān)[14]。

1.2.5 多菌靈對小麥莖基腐病的溫室防治效果 分生孢子懸浮液制備：將菌株LYXA-8 (2019 年分離自洛陽市新安縣) 的新鮮菌餅接入50 mL 綠豆湯培養(yǎng)液中，5 個/瓶，在25 ℃、150 r/min 搖床上光/暗交替培養(yǎng)5 d 后過濾，收集濾液，再經(jīng)5000 r/min 離心后用無菌水重懸，制備孢子懸浮液，孢子濃度調(diào)整為1×106個/mL。

參照賀小倫的方法[15]，略有改動。稱取5 份籽粒飽滿的鄭麥366 種子，每份2 g，用75%乙醇消毒1 min 后用無菌水沖洗晾干；將其中3 份放在有效成分為1.17、2.34 和3.90 mg/g 的50%多菌靈可濕性粉劑溶液中，依次標記為T1、T2和T3，浸泡3 h 后晾干；另2 份種子作為空白對照與發(fā)病對照，分別標記為CK0和CK，其中CK0為經(jīng)無菌水浸泡后直接播種，CK 為經(jīng)無菌水浸泡后接種孢子懸浮液。將孢子懸浮液與無菌土按照質(zhì)量比為0.75 : 100 的比例混勻，每一塑料杯分裝200 g，將T1、T2、T3和CK 的麥種播種在塑料杯里，每杯播種7 粒，覆土30 g，置于25 ℃溫室中培養(yǎng) (光照12 h，黑暗12 h) ，21 d 后觀察發(fā)病程度和小麥生長情況，測定發(fā)芽率、株高、根長及鮮重，統(tǒng)計發(fā)病率和級數(shù)。病情分級參照王莉莉等的標準[16]，計算病情指數(shù)和防治效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同地區(qū)菌株間對藥劑的敏感性差異采用DPS6.55 中的最小顯著差異法 (least significant difference，LSD) 檢驗，并采用SPSS 20.0 軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈對假禾谷鐮刀菌菌絲生長的最低抑制濃度

結(jié)果 (圖1) 表明：在0.3～2.4 μg/mL 范圍內(nèi)，隨著多菌靈質(zhì)量濃度的升高，菌絲生長抑制率逐漸增加，當多菌靈的質(zhì)量濃度為2.4 μg/mL 時，其對4 個供試菌株的抑制率均達到100%，說明多菌靈抑制病菌菌絲生長的MIC 為2.4 μg/mL。

圖1 多菌靈對假禾谷鐮刀菌菌絲生長的最低抑制濃度Fig. 1 Minimum inhibitory concentration of carbendazim on mycelial growth of Fusarium pseudograminearum

2.2 假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性及敏感基線

供試90 株病菌對多菌靈的EC50值在0.436～1.73 μg/mL 之間，最大值是最小值的3.98 倍，平均EC50值為 (0.750±0.291) μg/mL。Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗的結(jié)果顯示，供試菌株對多菌靈的敏感性頻率不符合正態(tài)分布 (W=0.8195，P=0.0000<0.05) ，但大部分菌株 (61 株，占67.78%) 位于相應(yīng)的主峰范圍內(nèi)，敏感性頻率分布仍為連續(xù)單峰曲線，故仍可將 (0.750±0.291) μg/mL 作為假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性基線 (圖2)。

圖2 假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性(A)及頻率分布(B)Fig. 2 Sensitivity (A) and frequency(B) of F.pseudograminearum to carbendazim

2.3 不同地市假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性差異

由表1 可知，同一地市菌株對多菌靈的敏感性差異較大。其中南陽內(nèi)鄉(xiāng)的菌株間敏感性差異最大，敏感性最高是最低菌株EC50值的3.98 倍；商丘虞城、洛陽洛龍兩地菌株，以及漯河舞鋼、新鄉(xiāng)紅旗和信陽商城3 地菌株，兩組之間差異不太明顯；差異最小的為新鄉(xiāng)輝縣菌株，為1.84 倍。

表1 河南省不同地市假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性Table 1 Sensitivity to carbendazim of F. pseudograminearum from different areas in Henan Province

多菌靈對各地市菌株平均EC50值變化范圍為0.604～1.04 μg/mL。新鄉(xiāng)輝縣菌株對多菌靈的敏感性最低，EC50均值為1.04 μg/mL，與其他地市菌株存在顯著差異；而新鄉(xiāng)紅旗和信陽商城菌株，對多菌靈最為敏感，EC50均值分別為0.603 和0.619 μg/mL。新鄉(xiāng)輝縣和新鄉(xiāng)紅旗菌株，敏感性相差1.72 倍。其他5 個地市菌株，對多菌靈的敏感性不存在顯著性差異。各地區(qū)菌株EC50均值與所有供試菌株的EC50均值相比，新鄉(xiāng)紅旗和信陽商城的敏感性高于河南省平均水平；新鄉(xiāng)輝縣、南陽內(nèi)鄉(xiāng)和商丘虞城低于河南省平均水平；而洛陽洛龍、漯河舞鋼和鄭州中牟則近于河南省平均水平。

2.4 不同地市菌株對多菌靈敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

從8 地市菌株各隨機選擇4 株，共32 株，采用S P S S 軟件對多菌靈抑制病菌菌絲生長的EC50值進行聚類分析。由圖3 可知，多菌靈對32 個菌株的EC50值分在5 個聚類組中。第1 組有來源于5 個地市的12 株菌株；第2 組有來源于3 個地市的4 株菌株；第3 組有來源于5 個地市的10 株菌株；第4 組有來源于2 個地市的5 株菌株；第5 組僅1 株菌株。除新鄉(xiāng)紅旗的菌株只聚類在第一組，輝縣的菌株只聚類在第四組外，其他6 個地市的菌株均出現(xiàn)在不同的聚類組中，說明河南省同一地市的菌株對多菌靈的敏感性差異較大 (圖3) ；而不同地市的菌株出現(xiàn)在同一聚類組中，說明假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性差異與菌株來源地理位置無明顯相關(guān)性。這與LSD 法的分析結(jié)果相一致。

圖3 河南省不同地市假禾谷鐮刀菌對多菌靈敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析Fig. 3 Hierarchical cluster analysis on EC50 values of carbendazim to F. pseudograminearum from different areas in Henan Province

2.5 假禾谷鐮刀菌對多菌靈、戊唑醇和咯菌腈敏感性之間的相關(guān)性

多菌靈對40 株病菌的EC50平均值為 (0.755±0.336) μg/mL，戊唑醇對40 株病菌的平均值為(0.890±0.143) μg/mL，F(xiàn)檢驗的顯著水平P=0.000 1<0.05，即兩者在P=0.05 水平上差異顯著；線性回歸方程為y=0.183 9x?0.049 9，b為負值，R2=0.187 7，小于0.8 (圖4)，說明假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性與其對戊唑醇不存在相關(guān)性。

圖4 假禾谷鐮刀菌對多菌靈與其對戊唑醇、咯菌腈敏感性之間的相關(guān)性Fig. 4 Correlation of the sensitivity of F.pseudograminearum between carbendazim and tebuconazole or fludioxonil

多菌靈對40 株病菌的EC50平均值為 (0.755±0.336) μg/mL，咯菌腈對40 株病菌的平均值為(0.028 0±0.009 6) μg/mL，F(xiàn)檢驗的顯著水平P=0.000 1<0.05，即兩者在P= 0.05 水平上差異顯著；線性回歸方程為y= 3 × 10?5x+ 0.027 9，b為正值，R2= 9 × 10?7，小于0.8 (圖4)，說明假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性與其對咯菌腈不存在相關(guān)性。

2.6 多菌靈對小麥莖基腐病的溫室防治效果

溫室試驗結(jié)果(表2)表明：多菌靈有效成分劑量3.90 mg/g 拌種處理的防效最高，達到76.66%；其次為1.17 mg/g 拌種和2.34 mg/g 拌種，防治效果分別為51.32%和49.32%，且病情指數(shù)與對照差異顯著。說明多菌靈在合理濃度下對小麥莖基腐病具有很好的防效。

表2 多菌靈對小麥莖基腐病的溫室防治效果Table 2 Control efficacy of carbendazim on wheat stem rot

由圖5 可知，未經(jīng)藥劑拌種處理、且未接種莖基腐病菌 (孢子懸浮液) 的小麥幼苗長勢最好，莖基部呈綠色，根系正常，生長狀況良好 (圖5-CK0)。未經(jīng)藥劑拌種處理，接種莖基腐病菌 (孢子懸浮液) 的小麥幼苗長勢最差，莖基部呈褐色，呈現(xiàn)典型的莖基腐癥狀，根系發(fā)黃，生長不良，整個植株表現(xiàn)壞死癥狀 (圖5-CK)。經(jīng)藥劑拌種處理且接種病菌孢子懸浮液的小麥幼苗，根、莖、葉均生長正常，無壞死現(xiàn)象，說明用50%多菌靈可濕性粉劑拌種對假禾谷鐮刀菌的侵染和擴展具有很好的抑制效果 (圖5-T1, T2, T3)。

圖5 多菌靈對小麥莖基腐病的溫室防治效果Fig. 5 Greenhouse control efficacy of carbendazim on wheat stem rot

3 結(jié)果與討論

本研究表明：多菌靈對假禾谷鐮刀菌有很強的抑制作用，敏感性基線為 (0.585 ±0.083) μg/mL；假禾谷鐮刀菌對多菌靈和對戊唑醇、咯菌腈敏感性間無明顯相關(guān)性，生產(chǎn)中可以輪換使用這些藥劑；多菌靈在溫室條件下對小麥莖基腐病表現(xiàn)出較高的防效，顯示出在病害防治上的應(yīng)用潛力。

本研究中假禾谷鐮刀菌對多菌靈的敏感性基線與周明國等建立的禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum對多菌靈的敏感性基線為 (0.575±0.013) μg/mL基本一致[17]。這表明多菌靈也可以應(yīng)用在以禾谷鐮刀菌為主要病原的麥田。但由于禾谷鐮刀菌對多菌靈的抗藥性風險較高，實際應(yīng)用時可和戊唑醇、咯菌腈等藥劑輪換應(yīng)用，并監(jiān)測病原菌對藥劑的敏感性變化；或者使用多菌靈的復配劑。

禾谷鐮刀菌對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的風險較高，抗藥性主要是由其β2-tubulin 上167、198 及200 位氨基酸的突變引起[18]。假禾谷鐮刀菌基因組序列尚未公布，其體內(nèi)β-tubulin 的基因數(shù)目尚不清楚，對多菌靈的抗藥性機制可能與禾谷鐮刀菌有所不同。假禾谷鐮刀菌對多菌靈的抗藥性風險評估正在進行中，抗藥性菌株的獲得及病菌基因組序列的公開將有助于揭示假禾谷鐮刀菌對多菌靈抗藥性機制。

多菌靈可導致禾谷鐮刀菌體內(nèi)乙酰輔酶A 的積累，上調(diào)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素的生物合成，故多菌靈在防治小麥赤霉病時會帶來麥粒里毒素含量的增加[19]。病菌產(chǎn)生抗藥性后，不僅造成防效下降，且抗藥性菌株體內(nèi)毒素含量較多，小麥受毒素污染更加嚴重[20]。多菌靈在小麥莖基腐病防治上的應(yīng)用是否會帶來毒素污染也應(yīng)受到重視。由于病菌無法擴展到麥穗，產(chǎn)生的毒素也很難從莖稈向上轉(zhuǎn)移，故發(fā)生莖基腐病的麥株，毒素多集中在第4 莖節(jié)下面的節(jié)間處[21]。田間應(yīng)用多菌靈防治小麥莖基腐病時不會對糧食造成毒素污染，但對小麥秸稈做成的動物飼料有潛在威脅。

由于大面積實行輪作倒茬、秸稈還田等耕作栽培措施，土壤中的菌源量會逐年積累。所以單純地依靠化學藥劑秋季拌種或種子包衣措施防治小麥莖基腐病，不足以實現(xiàn)對莖基腐病的長期控制。以使用化學藥劑為基礎(chǔ)，深翻、輪作及其他栽培措施的綜合利用將為持續(xù)治理小麥莖基腐病提供一條有效的解決途徑[22]。