具有萬古霉素高產(chǎn)能的東方擬無枝酸菌誘變株的選育研究

陳德剛，牛 春，李春玲

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司， 銀川 750101)

目前,國內(nèi)萬古霉素發(fā)酵生產(chǎn)中普遍存在產(chǎn)率不高、質量不穩(wěn)定等問題，根本原因在于缺少優(yōu)良的發(fā)酵菌株[9-11]。因此，亟待開展萬古霉素發(fā)酵高產(chǎn)菌株的選育研究。阮麗軍等[12]通過UV(紫外)誘變，選育出一株效價、萬古霉素抗性得到顯著提高的突變菌株A.orientalis6-21。陳代杰等[13]運用UV誘變、激光誘變、NTG誘變及其復合誘變，結合卡那霉素、萬古霉素和甘油抗性篩選，選育出生產(chǎn)能力極大提高的高產(chǎn)突變株。雖然萬古霉素發(fā)酵菌種選育已取得長足進步，發(fā)酵效價達到4000 μg/L，但與發(fā)達國家約10000 μg/L效價水平還存在較大差距，菌株發(fā)酵特性還有待進一步提升。鑒于此，本研究以引進保存的產(chǎn)萬古霉素的(Amycolatopsisorientalis)V-1806菌株作為原始菌株，利用EMS (甲基磺酸乙酯)、UV以及ARTP(常壓室溫等離子體誘變)、激光誘變及其復合誘變的方法，對菌株進行誘變處理，選育出優(yōu)良發(fā)酵菌株，以期提升萬古霉素發(fā)酵水平。根據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號》，萬古霉素及其鹽、酯在食品動物中禁止使用，此研究亦可為其他產(chǎn)品發(fā)酵菌種的選育提供借鑒。

1 材 料

1.1 材料 原始菌株為萬古霉素的東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)菌株，由本實驗室保藏。試劑為國產(chǎn)和國外分析純；恒溫振蕩搖床(武漢科學儀器廠，編號：HQL150C)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱(江蘇杰瑞爾電器有限公司，編號：LHP160)、ARTP等離子體生物育種機(北京思清源生物科技有限公司，編號：ARTP-Ⅱ型)，紫外分光光度計(編號：BECKMANDU-600)、高效液相色譜儀(Watesr)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 斜面和分離培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 5，麥芽提取物 1，酵母提取物 1，瓊脂 20， pH 6.0，26 ℃，培養(yǎng)10 d[7]。

種瓶培養(yǎng)基(g/L)：淀粉10，葡萄糖 10，蛋白胨 5，酵母粉 3，氯化鈉 2，碳酸鈣 2， pH7.0，斜面挖塊接種于種子培養(yǎng)基中，250 mL的三角瓶裝量 40 mL，置于26 ℃搖床，220 rpm振蕩培養(yǎng) 26 h[6]。發(fā)酵瓶培養(yǎng)基(M/V)：黃豆餅粉3%，玉米漿3%，葡萄糖6%，硫酸銨 0.1%，磷酸氫二鉀 0.1%，碳酸鈣 0.4%，pH自然，裝量為500 mL錐形瓶裝量80 mL，26 ℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)[9]。

中試(500 L)培養(yǎng)基(g/L)：淀粉20，蔗糖53，玉米漿98，酵母粉10，硫酸銨4，磷酸二氫鉀 1，氯化鈣 2，碳酸鈣 0.5，純水1 L，pH自然，培養(yǎng)溫度26 ℃，培養(yǎng)濕度36%，培養(yǎng)時間7 d[10]。

2 方 法

2.1 孢子液的制備 參考文獻[14]的方法。取成熟斜面孢子，用4.5 mL無菌水沖洗，將沖洗的孢子液用研磨器研磨，然后將菌液用濾紙過濾，離心管收集濾液，稀釋至1×10-6濃度備用。

2.2 菌株誘變方法

2.2.1 甲基磺酸乙酯(EMS)誘變 取20 mL的孢子液于滅菌三角瓶(50 mL)中，加入EMS (終濃度0.2%)，放在搖床上振蕩培養(yǎng)，誘變處理時間分別為1、2、4、6、8、10 h，然后將孢子液均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，以未經(jīng)EMS處理的孢子液作為對照，于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10 d。

2.2.2 紫外線(UV)誘變 取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，打開預熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min，將離紫外燈管置于培養(yǎng)皿垂直高度35 cm處，然后打開皿蓋，分別采用照射0 s(對照)、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s進行處理，蓋上皿蓋，誘變處理過程在黑暗條件下進行。誘變結束后，再將培養(yǎng)皿在黑暗處條件下放置2 h，然后吸取孢子液，均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計致死率。

2.2.3 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變 ARTP的工作氣體為純度為99.99%的氦氣，處理功率為80 W，等離子體發(fā)生器待處理樣品與出口之間的距離為4 mm，氣體的流量9.0 L/min。將準備好的50 μL孢子液均勻涂布于載片上，然后進行照射，照射的時間分別為0 s(對照)、50 s、100 s、150 s、200 s、250 s，用50 μL 無菌水沖洗，將照射后的菌液洗脫倒入平皿中，反復洗脫4次，均勻涂布在平皿中，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計致死率。

2.2.4 激光(Laser)誘變 將0.5 mL的孢子懸液倒入專用玻璃小瓶(內(nèi)有磁力攪拌轉子)，然后用波長532 nm、50 mj/pulse/s的YGA倍頻脈沖激光儀照射各小瓶，照射次數(shù)分別為200、400、600、800、1000。對不同照射次數(shù)的懸液梯度稀釋后涂布平板，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計致死率。

2.2.5 EMS+UV誘變 取20 mL的孢子液于滅菌三角瓶(50 mL)中，加入EMS (終濃度0.2%)，放在搖床上振蕩培養(yǎng)，誘變處理6 h，然后從中取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，打開預熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min，將離紫外燈管置于培養(yǎng)皿垂直高度35 cm處，然后打開皿蓋，照射80 s，蓋上皿蓋，誘變處理過程在黑暗條件下進行。誘變結束后，再將培養(yǎng)皿在黑暗處條件下放置2 h，然后吸取孢子液，均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計分析致死率。

2.2.6 UV+ Laser誘變 取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，打開預熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min，將離紫外燈管置于培養(yǎng)皿垂直高度35 cm處，然后打開皿蓋，照射80 s，蓋上皿蓋，誘變處理過程在黑暗條件下進行。誘變結束后，再將培養(yǎng)皿在黑暗處條件下放置2 h，然后吸取0.5 mL的孢子懸液倒入專用玻璃小瓶(內(nèi)有磁力攪拌轉子)，然后用波長532 nm、50 mj/pulse/s的YGA倍頻脈沖激光儀照射各小瓶，照射次數(shù)1000，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計致死率。

2.2.7 UV+ ARTP誘變 取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，打開預熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min，將離紫外燈管置于培養(yǎng)皿垂直高度35 cm處，然后打開皿蓋，照射80 s，蓋上皿蓋，誘變處理過程在黑暗條件下進行。誘變結束后，再將培養(yǎng)皿在黑暗處條件下放置2 h，然后從中將取50 μL孢子液均勻涂布于載片上，然后進行照射，照射的時間分別為0 s(對照)、50 s、100 s、150 s、200 s、250 s，用50 μL 無菌水沖洗，將照射后的菌液洗脫倒入平皿中，反復洗脫4次，均勻涂布在平皿中，同時取未經(jīng)誘變的孢子懸液作為對照，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計致死率。

2.3 致死率和正突變率 每個誘變處理36孔培養(yǎng)皿，重復3次，以未經(jīng)誘變處理的孢子液為對照，致死率等于(對照處理平皿菌落-誘變處理平皿菌落)/對照處理平皿菌落×100%；正突變率等于誘變處理效價高于對照6%的菌株數(shù)/誘變處理的菌株總數(shù)×100%。利用SPSS_21.0軟件(獨立樣本T檢驗)進行統(tǒng)計分析。

2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性測定 參考文獻[6]的方法，將選育出的高產(chǎn)菌株以斜面形式保存，產(chǎn)生孢子后取少許孢子轉入另一斜面，此為一代，連續(xù)傳代 3次，使用搖瓶檢測法測定每一代菌株的萬古霉素效價，分析其遺傳的穩(wěn)定性。

2.5 菌株萬古霉素抗性測定 孢子懸液稀釋后涂布于含有5000、10000、15000 mg/L萬古霉素的平板上，于29 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d，檢測菌株的萬古霉素抗性。

2.6 Cu2+濃度對發(fā)酵效價的影響 在搖瓶發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)基中分別添加10、20、30、40、50 mg/L的CuSO4·5H2O或CaCl2，分析不同濃度Cu2+、Ca2+對菌株發(fā)酵效價的影響。

2.7 HPLC測定 定量吸取發(fā)酵液，加入 7 倍體積的無水乙醇，充分振蕩 0.5 h，5000 r/min 離心15 min，過濾，取上清液，利用HPLC測定效價。HPLC 測 定的條件：色 譜 柱Agilent Extend-C 18(4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇∶0.1%醋酸(80∶30)；檢測的波長為 250 nm；柱子溫度為 40 ℃。MPA 對照品為 Sigma 公司的產(chǎn)品[8]。

3 結果與分析

3.1 原始菌株的復壯篩選 將引進保存的12株菌株進行復壯，經(jīng)過傳代3次，結果發(fā)現(xiàn)編號V-1806菌株發(fā)酵效價最高，為4402 mg/L，而且菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，作為后續(xù)誘變處理的原始菌株(表1)。

表1 原始菌株的效價及遺傳穩(wěn)定性

3.2 菌株誘變及篩選

3.2.1 EMS誘變 V-1806菌株經(jīng)EMS誘變處理，結果發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增加，菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢，處理時間為1 h時，致死率為24.7%，正突變率為5.6%；處理時間為2 h時，致死率為37.2%，正突變率為6.3%；處理時間為4 h時，致死率為68.5%，正突變率為13.7%；處理時間為6 h時，致死率為78.5%，正突變率為19.6%；處理時間為8 h時，致死率為88.5%，正突變率為14.7%；處理時間為10 h時，致死率為96.4%，正突變率為16.3%(圖1)。綜合考慮，確定誘變處理適宜時間為6 h。采用EMS誘變處理6 h，初篩出22株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到3株效價顯著升高的菌株(編號為Ve-1、Ve-18、Ve-21)，其效價分別為4956、5145、5174 mg/L。

圖1 EMS誘變不同處理時間的致死率和正突變率

3.2.2 UV誘變 V-1806菌株經(jīng)UV誘變處理，結果發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增加，菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢，處理時間為20 s時，致死率為10.9%，正突變率為2.3%；處理時間為40 s時，致死率為22.3%，正突變率為5.8%；處理時間為60 s時，致死率為58.5%，正突變率為17.9%；處理時間為80 s時，致死率為85.8%，正突變率為20.6%；處理時間為100 s時，致死率為93.1 %，正突變率為19.2%(圖2)。綜合考慮，確定誘變處理適宜時間為80 s。采用EMS誘變處理80 s，初篩出15株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到2株效價顯著升高的菌株(編號為Vu-5、Vu-13)，其效價分別為5256、5533 mg/L。

圖2 UV誘變不同處理時間的致死率和正突變率

3.2.3 ARTP誘變 V-1806菌株經(jīng)ARTP誘變處理，結果發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增加，菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢，處理時間為50 s時，致死率為8.1%，正突變率為32.4%；處理時間為100 s時，致死率為32.4%，正突變率為12.7%；處理時間為150 s時，致死率為58.7%，正突變率為12.9%；處理時間為200 s時，致死率為88.6%，正突變率為20.3%；處理時間為250 s時，致死率為90.4 %，正突變率為16.5%(圖3)。綜合考慮，確定誘變處理適宜時間為200 s。采用ARTP誘變處理200 s，初篩出16株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到2株效價顯著升高的菌株(編號為Va-10、Va-12)，其效價分別為4856、5424 mg/L。

圖3 ARTP誘變不同處理時間的致死率和正突變率

3.2.4 Laser誘變 V-1806菌株經(jīng)激光誘變處理，結果發(fā)現(xiàn)隨著照射次數(shù)的增加，菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢，照射次數(shù)為200時，致死率為14.5%，正突變率為3.1%；照射次數(shù)400時，致死率為23.6%，正突變率為7.7%；照射次數(shù)為600時，致死率為55.6%，正突變率為8.9%；照射次數(shù)800 時，致死率為68.6%，正突變率為15.3%；照射次數(shù)為1000時，致死率為88.4 %，正突變率為16.5%；(圖4)。綜合考慮，確定誘變照射次數(shù)為1000次。采用ARTP誘變處理1000次，初篩出18株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到3株效價顯著升高的菌株(編號為Vl-4、Vl-13、Vl-17)，其效價分別為5044、5438、5103 mg/L。

圖4 Laser誘變不同處理時間的致死率和正突變率

3.2.5 EMS+UV誘變 V-1806菌株經(jīng)EMS+UV復合誘變處理，菌體致死率為91.4%，正突變率為13.6%。通過初篩出13株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到2株效價顯著升高的菌株(編號為Veu-4、Veu-12)，其效價分別為5562、5621 mg/L。

3.2.6 UV+Laser誘變 V-1806菌株經(jīng)UV+Laser復合誘變處理，菌體致死率為92.9%，正突變率為8.6%。通過初篩出11株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到1株效價顯著升高的菌株(編號為Vul-4)，其效價為5684 mg/L。

3.2.7 UV+ARTP誘變 V-1806菌株經(jīng)UV+Laser復合誘變處理，菌體致死率為89.7%，正突變率為14.2%。通過初篩出17株正突變菌株，經(jīng)搖瓶效價檢測復篩，得到2株效價顯著升高的菌株(編號為Vua-4、Vua-15)，其效價分別為5742、5751 mg/L。

比較分析不同誘變方法的誘變效果，結果發(fā)現(xiàn)，復合誘變的致死率顯著高于單一誘變，而正突變率低于單一誘變，但其篩選出的正突變菌株的最高效價顯著高于單一誘變。

表2 不同誘變方法誘變效果的比較

3.3 選育菌株遺傳穩(wěn)定性的檢測 對獲得的優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性及生長特性進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)菌株Ve-21、Vu-13、Va-12、Veu-4、Vua-4、Vua-15的遺傳穩(wěn)定性較好(表3)。而且Ve-21、Veu-4、Vua-4、Vua-15菌落直徑明顯增大，呈白色“褶皺”狀(表3、表4、圖5)。

表3 優(yōu)良菌種遺傳穩(wěn)定性分析

表4 優(yōu)良菌種生長特性分析

圖5 萬古霉素優(yōu)良菌種菌落形態(tài)

3.4 選育菌株萬古霉素抗性檢測 對菌株Ve-21、Vu-13、Va-12、Veu-4、Vua-4、Vua-15的萬古霉素進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，與原始菌株相比，Ve-21、Veu-4、Vua-15菌株在含萬古霉素濃度5000、10000、15000 mg/L的培養(yǎng)基上均能較好生長，表明這三株菌株具有較好的萬古霉素抗性(表5)。

表5 菌種萬古霉素耐受性檢測

3.5 Cu2+對菌株發(fā)酵效價的影響 在搖瓶發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的CuSO4·5H2O，結果發(fā)現(xiàn)Ve-21、Veu-4、Vua-15菌株在發(fā)酵效價均有所提高，CuSO4·5H2O濃度為40 mg/L時，這三株菌株發(fā)酵效價增加最大(表6)。

表6 Cu2+對發(fā)酵效價的影響

3.6 菌株SA-2 中試發(fā)酵性能的檢測 以原始菌株S-225為對照，對菌株Ve-21、Veu-4、Vua-15的中試發(fā)酵性能檢測進行，結果發(fā)現(xiàn)菌株Vua-15的效價最高，為7863 mg/L，較出發(fā)菌株V-1806的效價4512 mg/L，提高了74.3%；而且顯著高于Ve-21、Veu-4的效價。Vua-15的發(fā)酵液菌絲呈現(xiàn)“舒展網(wǎng)密”，表明其具有較好的發(fā)酵生長性能(表7)。

表7 菌株中試性能檢測

4 討論與結論

誘變技術是選育萬古霉素優(yōu)良發(fā)酵菌種的主要途徑，但目前僅見UV誘變、激光誘變相關報道[12-13]。本研究采用EMS、UV、ARTP、Laser單一誘變，以及EMS+UV、UV+Laser、UV+ARTP復合誘變的方法，選育出了優(yōu)良東方擬無枝酸菌菌株Vua-15，極大的提高了菌株發(fā)酵效價。就選育效果而言，復合誘變選育的菌株性能明顯高于單一誘變，這與陳代杰等[13]研究結果類似。其可能的原因是復合誘變產(chǎn)生的突變更多，正突變率更高，其對應的表型可能更豐富，更容易選育出符合預期的優(yōu)良菌株[15]。

東方擬無枝酸菌菌株在發(fā)酵過程中易受萬古霉素的反饋抑制，因此萬古霉素的抗性是其關鍵選育指標。Vua-15具有較強的萬古霉素抗性，適應發(fā)酵過程中萬古霉素的積累濃度。同時，Cu2+等無機鹽離子可以有效的提升東方擬無枝酸菌菌株的萬古霉素發(fā)酵效價[16]。本研究對Cu2+的濃度進行了篩選，確定了40 mg/L為適宜的添加濃度，這與陳代杰等[13]、彭哲[16]的研究結論較一致。研究對菌株 Vua-15的中試發(fā)酵性能進行了初步評價，表明Vua-15具有較好的生產(chǎn)應用潛能，后續(xù)還需對該菌株的性能開展深入研究，以期為其他產(chǎn)品發(fā)酵菌種的選育提供參考。