蒺藜淫羊藿復(fù)合物對大鼠性功能及精子活力的影響

梁志健嚴家榮陳桂煌張建軍陳潤紅鄺少松*

(1.廣東省醫(yī)學實驗動物中心,廣東佛山 528248；2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學科學院,廣州 510080)

據(jù)統(tǒng)計40～70 歲男性中有約52%患有不同程度的性功能障礙,主要表現(xiàn)為性欲減退、陰莖勃起障礙、射精障礙及精子活力下降等[1-2]。 其原因可能與雄激素水平降低、機體疲勞、處于亞健康、疾病等有關(guān)。 尋找能改善性功能障礙的安全有效的藥物及保健食品具有深遠的意義。 中醫(yī)認為“腎藏精、主生殖”,“腎者作強之官,伎巧出焉”,因此,中醫(yī)補腎法是治療性功能障礙和精子異常的基本治法[3-5]。 蒺藜淫羊藿復(fù)合物便是根據(jù)這一治法,由淫羊藿、蒺藜、西洋參提取物組方而成。 本課題在半去勢雄性大鼠模型基礎(chǔ)上,通過觀察蒺藜淫羊藿復(fù)合物對模型大鼠的交配行為、睪酮含量、精子活力等指標的影響,綜合評價其是否具有增強性功能,改善性功能障礙的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級 SD 大鼠,100 只,雌雄各半,8 周齡,271～298 g；購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002], 合 格 證 號 為: 44007200039469、44007200039470。 實驗于廣東省醫(yī)學實驗動物中心進行[SYXK (粵) 2018-0002],實驗證明號為:00169157、00169158。 飼養(yǎng)條件:5 只/籠,自由進食飲水,采用12 h ∶12 h 晝夜間斷照明,飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定。 本研究經(jīng)廣東省醫(yī)學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審核(B201704-8),符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

十一酸睪酮軟膠囊(藥品級,浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)；戊巴比妥鈉(分析純,德國默克公司)；苯甲酸雌二醇注射液(藥品級,寧波第二激素廠)；黃體酮注射液(藥品級,赤峰博恩藥業(yè)有限公司)；睪酮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

BL-420 S 型生物機能儀(成都泰盟軟件有限公司)；CX21 型生物顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 實驗方法

1.3.1 劑量設(shè)計與樣品配制

蒺藜淫羊藿復(fù)合物由湯臣倍健股份有限公司提供,由蒺藜、淫羊藿、西洋參和輔料組成,其中每100 g 含總皂苷不低于2.0 g、淫羊藿苷不低于0.5 g。 根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003 年版),蒺藜淫羊藿復(fù)合物以成人推薦用量的10 倍、30 倍設(shè)為大鼠的低、高劑量,即分別為0.51、1.52 g/kg。 配制方法:稱取8.36 g 蒺藜淫羊藿復(fù)合物粉末,用純凈水溶解至55 mL,得質(zhì)量濃度0.152 g/mL的蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量溶液。 取14 mL 的高劑量溶液,用純凈水稀釋至42 mL,得0.051 g/mL 的低劑量溶液。

陽性對照品選用十一酸睪酮,以成人推薦用量的10 倍設(shè)為大鼠的劑量,即0.02 g/kg。

1.3.2 動物分組及處理

雄鼠的處理:50 只大鼠隨機分為正常對照組10只和造模組40 只。 造模組動物按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘除右側(cè)睪丸、左側(cè)不做處理。正常對照組大鼠做假手術(shù)處理。 術(shù)后各組動物肌肉注射青霉素鈉,每只80000 U,每天1 次,連續(xù)3 d。 術(shù)后3 d,造模組動物按體重隨機分為模型對照組、陽性對照組、蒺藜淫羊藿復(fù)合物低、高劑量組,每組10 只。 陽性對照組動物灌胃給予十一酸睪酮,蒺藜淫羊藿復(fù)合物低、高劑量組灌胃給予相應(yīng)濃度的蒺藜淫羊藿復(fù)合物溶液,其余組別給予純凈水,灌胃體積均為10 mL/kg,1 次1 d,共40 d。

雌鼠的處理:50 只大鼠按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘除雙側(cè)卵巢。 術(shù)后按上述方法肌注青霉素鈉進行抗感染處理。

1.3.3 交配實驗

為使去勢的雌鼠同時發(fā)情,進行交配實驗前2 d,皮下注射給予苯甲酸雌二醇,劑量為0.2 mg/kg；交配實驗前4 h,皮下注射給予黃體酮,劑量為2 mg/kg。 雄鼠在灌胃第30 天晚上按1 只/籠放入飼養(yǎng)籠中,適應(yīng)環(huán)境5 min 后,然后每籠投入1 只發(fā)情雌鼠。 記錄投入雌鼠起40 min 內(nèi),雄鼠首次捕捉雌鼠的時間、首次射精的時間、捕捉及射精的次數(shù),并計算每組雄鼠的捕捉率和射精率[6]。

1.3.4 陰莖勃起實驗

雄鼠在結(jié)束第35 天灌胃的1 h 后,檢測動物的陰莖勃起潛伏期。 將生物機能儀的電極固定于陰莖根部,以35 V、35 Hz 的電流進行刺激,記錄刺激開始到陰莖充血勃起的時間,記為陰莖勃起潛伏期[6]。

1.3.5 睪酮、臟器系數(shù)檢測

雄性大鼠第40 天末次灌胃1 h 后,動物腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈采血,離心,取上清,根據(jù)試劑盒說明書檢測其中睪酮的含量。 大鼠采血、安樂死后,取睪丸、包皮腺、提肛肌、腎上腺、精囊腺+前列腺,稱重后按公式計算臟器系數(shù)。

1.3.6 精子數(shù)量、活動率與活力檢測

取左側(cè)附睪,用剪刀中間剪開,放入1 mL 生理鹽水中,振揺并放置10 min,使精子充分溢出,取1滴該液體置于血細胞計數(shù)板中,在顯微鏡下計數(shù),得到每毫升稀釋液中含有的精子數(shù)量。 再取1 滴該液體置于血細胞計數(shù)板中,顯微鏡下觀察200 個精子,記錄活動精子數(shù)目,按下列公式計算精子活動率[7]。

在觀察活動率的同時,觀察精子活力,精子活動分為 a、b、c、d 四個級別,a 級:精子呈快速直線前向運動；b 級:慢速或呆滯的前向運動；c 級:非前向運動；d 級:死精子。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實驗的影響

如表1 所示,模型對照組雄性大鼠的捕捉率較正常對照組降低(P＜0.01)。 與模型對照組比較,陽性對照組捕捉率升高(P＜0.01),精力能低、高劑量組的捕捉率、射精率和射精次數(shù)升高,具有顯著差異(P＜0.05)。

表1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實驗的影響(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

表1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實驗的影響(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups捕捉率(%)Capture rate射精率(%)Ejaculation rate捕捉次數(shù)(次)Capture times射精次數(shù)(次)Ejaculation times正常對照組Normal control group 80 60 9.2±6.3 11.3±10.0模型對照組Model control group 60** 50 11.8±14.1 10.2±5.4陽性對照組Positive control group 100＃＃ 60 21.3±13.1 25.0±11.5＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 100＃＃ 80＃＃ 30.4±19.9 26.8±15.8＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 100＃＃ 70＃＃ 30.9±26.4 28.0±18.8＃

2.2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢雄性大鼠性功能、激素及生殖系統(tǒng)的影響

如表2 及表3 所示,蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組能顯著提高去勢雄性大鼠血清中睪酮的含量(P＜0.05),同時顯著增加精囊腺和前列腺系數(shù)(P＜0.05)。 而高劑量組可見縮短陰莖勃起潛伏期的趨勢,但無顯著性(P＞0.05)。

表2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠勃起潛伏期、血清睪酮的影響(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

表2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠勃起潛伏期、血清睪酮的影響(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups勃起潛伏期(s)Erectile times睪酮(nmol/L)Testosterone正常對照組Normal control group 5.01±4.01 24.1±3.7模型對照組Model control group 9.27±3.01 17.6±3.8**陽性對照組Positive control group 8.72±3.65 24.6±5.0＃＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 9.48±4.48 21.2±3.3＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 7.05±3.09 20.7±3.3

表3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠性器官臟器系數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

表3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠性器官臟器系數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,*P＜0.05；與模型對照組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with the normal control group,*P＜0.05. Compared with the model control group,＃P＜0.05.

組別Groups臟器系數(shù)(mg/g)Organ coefficient睪丸Testicles包皮腺Preputial glands精囊腺和前列腺Seminal vesicles and prostate glands正常對照組Normal control group 3.68±0.16 0.33±0.10 5.97±0.45模型對照組Model control group 3.59±0.30 0.31±0.08 5.29±0.74*陽性對照組Positive control group 3.76±0.64 0.32±0.11 5.98±0.89＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 3.86±0.19 0.35±0.12 6.03±0.64＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 3.69±0.57 0.35±0.13 5.84±0.85

2.3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢雄性大鼠精子數(shù)量、精子活動率及精子活力的影響

如表4 所示,與正常對照組比較,模型對照組的精子數(shù)量減少(P＜0.01)、精子活動率降低(P＜0.01)、呈快速直線前向運動的精子減少(P＜0.01)、非前向運動的精子和死精子增多(P＜0.01)。 與模型對照組比較,蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組的精子活動率升高(P＜0.01),呈快速直線前向運動的精子增多(P＜0.05),死精子數(shù)量減少(P＜0.01)。

表4 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠精子數(shù)量、精子活動率和活力的影響(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

表4 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠精子數(shù)量、精子活動率和活力的影響(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups精子數(shù)量(×108/mL)Sperm count精子活動率(%)Motility rate精子活動強度(%)Motility rate a 級Level a b 級Level b c 級Level c d 級Level d正常對照組Normal control group 1.05±0.04 73.5±2.4 125±10 14±6 9±3 53±5模型對照組Model control group 0.78±0.12** 66.4±3.0** 105±7** 15±4 13±3** 67±6**陽性對照組Positive control group 0.94±0.05＃ 70.9±3.6 116±8 13±2 13±3 58±7蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 0.92±0.02 68.7±2.7 114±5 11±1 13±2 63±5蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 0.91±0.02 70.1±2.1＃＃ 116±5＃ 12±3 12±2 60±4＃＃

3 討論

隨著環(huán)境的污染、飲食習慣的改變及生活壓力的增加,男性的生殖功能障礙呈明顯的上升趨勢,主要表現(xiàn)性欲地下、勃起功能障礙、射精障礙、精子數(shù)量及活力降低等[8-10]。 其中多見于中老年人群,這可能與該類人群受到各種壓力的影響,機體處于疲勞的狀態(tài)有關(guān)。 此外,睪酮作為雄激素的主要成份,與男性性功能、生育功能有著密切關(guān)系,可促進性器官的發(fā)育、第二性征的維持、精子發(fā)生及成熟,而伴隨著年齡增長的睪酮分泌水平下降。 機體的疲勞狀態(tài)和睪酮分泌減少,共同影響著中老年男性的性功能健康。

中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)文化的瑰寶,具有十分重大的研究意義,根據(jù)中醫(yī)理論指導(dǎo)開發(fā)方藥及保健食品一直是研究熱點,本課題便是從傳統(tǒng)中醫(yī)理論出發(fā),尋找可以改善上述人群性功能的保健食品。 中醫(yī)認為腎藏精,主生殖,為先天之本。 腎精不足,命門火衰則會出現(xiàn)性欲減退、陰莖勃起困難等表現(xiàn),這與男性長期受到各種壓力而導(dǎo)致的疲勞狀態(tài)和伴隨年齡增長的雄激素分泌減少所導(dǎo)致的性功能障礙極為相似,所以補腎益精及補氣類中藥常用于開發(fā)為改善性功能障礙的產(chǎn)品[11-13]。

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物,有堅筋骨、益精氣、補腰膝、強心力等作用。 現(xiàn)代藥理研究表明,淫羊藿的主要成分是黃酮類和多糖,淫羊藿總黃酮及其標志成分淫羊藿苷可減緩睪丸組織的退行性變化,具有雄激素樣作用,對下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)起正向調(diào)節(jié)作用,促進睪酮分泌[14-15]；此外,淫羊藿可以減輕大鼠受高強度運動量的影響,維持在正常生理水平,同時促進蛋白質(zhì)合成,抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解,提高運動訓練大鼠血紅蛋白含量和糖原的儲備,從而增強大鼠抗疲勞能力[16-17]。 西洋參具有補氣益血、清肺腎、涼心脾、清虛火、生津止渴、補陰退熱、調(diào)補五臟、安神除煩、固精等功效。 現(xiàn)代研究證明,西洋參主要有效成分為人參皂苷類成分,西洋參在抗疲勞、增強免疫力等方面均有良好的功效[18-19]。 蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的果實,具有平肝解郁、活血祛風、明目止癢的功效。 蒺藜主要含有皂苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類等化合物,其中的蒺藜總皂甙能促進精液產(chǎn)生,增加性欲,促進雌性大鼠發(fā)情,提高生殖能力；臨床研究發(fā)現(xiàn)可增加男人的精子數(shù)及活力,治療男性性功能低下,其作用可能與其提高體內(nèi)性激素的含量有關(guān)[20-23]。 這一功效可能與其中的原薯蕷皂甙在體內(nèi)通過代謝轉(zhuǎn)化成脫氫表雄酮有關(guān)。同時蒺藜可以促進蛋白質(zhì)合成,抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解,提高血紅蛋白含量和糖原的儲備,增強抗疲勞能力。 蒺藜淫羊藿復(fù)合物便是由淫羊藿提取物、西洋參提取物和蒺藜提取物組方而成,在增強機體抗疲勞能力的基礎(chǔ)上加以補腎益精的作用。

選擇合適的指標和合適的動物模型,是客觀評價樣品功效的關(guān)鍵。 大鼠交配過程中的捕捉次數(shù)、射精次數(shù)、捕捉率和射精率可直接反映其性功能的強弱,作為評價性功能常用的指標。 而附性器官,如包皮腺、精囊腺和前列腺等,在受到雄激素的影響時,會被促進發(fā)育而重量增加,所以附性器官的重量變化可反應(yīng)樣品的雄激素樣作用。 單側(cè)去勢雄鼠能模擬人體睪酮分泌減少的狀態(tài),雄性大鼠經(jīng)單側(cè)去勢后,交配過程中捕捉率降低,陰莖勃起潛伏期延長,精囊腺和前列腺系數(shù)降低,精子數(shù)量、精子活動率降低,死精子增加。 故本課題采用了這一動物模型對蒺藜淫羊藿復(fù)合物的改善性功能功效進行評價。

本課題研究發(fā)現(xiàn),由淫羊藿、西洋參和蒺藜提取物組方而成的蒺藜淫羊藿復(fù)合物可提高半去勢雄性大鼠交配過程中的捕捉率、射精率和射精次數(shù),促進精囊腺和前列腺的生長發(fā)育,同時改善睪酮缺乏所致的精子數(shù)量減少、精子活力低下,這些功能可能與蒺藜淫羊藿復(fù)合物增加睪酮分泌和雄激素樣作用有關(guān)。 因此,蒺藜淫羊藿復(fù)合物可適用于體力疲勞和年齡增長所致的雄激素分泌低下的人群,改善其性功能表現(xiàn)。