動脈粥樣硬化病證結(jié)合動物模型研究進展

全文娟廖端芳*庹勤慧

(1.湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室,湖南中醫(yī)藥大學藥學院,長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院,長沙 410208)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)以動脈粥樣硬化斑塊形成為特征,是缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)、缺血性中風(ischemic stroke)、外周動脈疾病(peripheral arterial disease, PAD)[1]等多種疾病的病理基礎(chǔ)。 據(jù)最新統(tǒng)計,AS 相關(guān)疾病每年占全球死亡人數(shù)的1/3,其發(fā)病率和流行率居高不下,給全球醫(yī)療保健帶來巨大負擔[2-4]。

中醫(yī)在防治動脈粥樣硬化上發(fā)揮重要作用,根據(jù)癥狀和疾病的不同,動脈粥樣硬化歸屬于中醫(yī)“胸痹”“脈痹”“血痹”、“中風-中經(jīng)絡”等范疇[5]。外邪入侵、飲食失調(diào)、情志不節(jié)、勞倦久病等均可導致“痰”、“瘀”、“ 毒”、“濁”沉積脈管,痹阻陽氣[6],隨阻滯部位不同,發(fā)為“胸痹”、“脈痹”、“血痹”等。中醫(yī)從整體觀念入手,注重病證結(jié)合,辯證論治,療效顯著,但具體分子機制不明。 深入探究中醫(yī)藥分子作用機制離不開病證結(jié)合動物模型的精準建立,近年來,病證結(jié)合動物模型的研究取得了一定的進展,本文旨在對目前動脈粥樣硬化病證結(jié)合動物模型進行綜述,為動物模型的制備提供依據(jù)。

1 常用的病癥結(jié)合模型(9 種)

1.1 痰濕血瘀毒損證

“痰”、“瘀”、“毒”存在于 AS 病理過程的各個階段,應根據(jù)病邪的輕重主次遣方用藥,臨床可表現(xiàn)為眩暈頭痛、痰多氣短、胸悶作惡,身熱、口渴等癥。 白云綺等[7]結(jié)合中西醫(yī)理論評價ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型的中醫(yī)證型為痰濕血瘀毒損證。 通過檢測血清血脂水平,觀察主動脈和肝臟的病理變化,評價是否為血瘀痰濕證；通過IL-6、TNF-α 炎癥因子免疫組學變化評價是否為毒損證。 該模型選用客觀指標評價痰濕、血瘀、毒損證型的建立,并用具有清熱解毒功效的四妙勇安湯進行反證,從正反兩個方面對模型進行驗證,模型的建立方法有一定的可取性。

1.2 氣滯血瘀證

情志不節(jié)是動脈粥樣硬化的始因,憂思傷脾,脾失健運,津液不布,聚而生痰；或郁怒傷肝,進而化火,灼津成痰,均可使血行失暢,脈絡不利,而致氣滯血瘀。 臨床可見胸悶脅脹、喜太息,可見刺痛,隨情緒波動,舌紫暗,可見瘀斑瘀點。 樊華[8]采用高脂飼料喂養(yǎng)和應激性刺激聯(lián)合誘導SD 大鼠氣滯血瘀型動脈粥樣硬化模型。 采用高脂飼料飼喂成年 SD 大 鼠 12 周, 在 第 1 ～ 3 天 腹 腔 注 射600 000 IU/kg維生素D3,并對大鼠施加額外物理刺激,刺激因素包括光刺激:每2 h 給予閃爍光刺激大鼠5 min,每天2 次；聲刺激:每2 h 給予聲音刺激大鼠 5 min,每天 2 次；電刺激:每 2 h 在 30～35 V 電壓下給予電刺激大鼠5 min,刺激過程中每25 s 通電流刺激0.3 s,每天2 次。 通過組織血流量、血流動力學、凝血因子及生物學表征指標和胸主動脈病變情況評價氣滯血瘀證及斑塊形成情況,以血脂指標、動脈硬化指數(shù)、肝腎功能指標及肝組織病理學檢查評價體內(nèi)脂代謝和肝脂肪變情況。 采用聲、光、電等因素對大鼠進行慢性刺激,使大鼠產(chǎn)生緊張焦慮情緒,模擬現(xiàn)代快節(jié)奏生活對機體產(chǎn)生的慢性刺激,符合中醫(yī)學對氣滯證的理解,氣滯久則血瘀,形成氣滯血瘀證,具有創(chuàng)新性。

1.3 穢濁痰阻證

“高粱之變,足生大丁”,飲食不節(jié),嗜食肥甘厚味之品,以致脾胃損傷,聚濕生痰,阻滯氣血,損傷脈絡,清氣不升,濁氣不降,發(fā)為穢濁痰阻證,臨床可見痰多氣短,肢體沉重,舌胖大,邊有齒痕,苔濁膩或白滑。 古麗加瑪力等[9]采用寒燥環(huán)境聯(lián)合高脂飼喂對ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化穢濁痰阻證動物模型進行探索性造模。 將雄性ApoE-/-小鼠每天定時放入氣候箱(溫度:(6±2)℃,濕度:25%～32.8%)11 h 并予高脂飼料喂養(yǎng)。 采用宏觀表現(xiàn)(體重、飲水量、進飼量、情緒變化、大便、舌象、被毛)與微觀表現(xiàn)(血脂、主動脈形態(tài)學)相結(jié)合的方式對模型進行評價,符合穢濁痰阻證的表現(xiàn)。 病證造模方式聯(lián)合中醫(yī)多病因因素進行造模,考慮新疆地區(qū)氣候差異對模型的影響,針對性強,具有因地制宜的優(yōu)點。

1.4 痰瘀互結(jié)證

《醫(yī)宗必讀》云“脾土虛弱,清者難升,濁者難降,留中滯膈,瘀而成痰”。 “痰”、“瘀”皆為陰邪,兩者常兼夾致病,病程較長,膠著難解,臨床表現(xiàn)為神疲乏力、身體困重、痰多、唇色紫暗,舌黯有瘀點,苔滑膩,脈滑澀。 陳麗娟等[10]采用高脂飼料飼喂聯(lián)合腹腔注射維生素D3 的方法復制SD 大鼠動脈粥樣硬化痰瘀互結(jié)證模型。 高脂飼料喂飼SD 大鼠,并同時一次性腹腔注射400000 IU/kg 維生素D3。 陳潔等[11]同樣采用高脂飼喂聯(lián)合大劑量腹腔注射VD3 方法,但在此基礎(chǔ)上配合球囊損傷內(nèi)膜可加快脂質(zhì)斑塊的快速形成。 張方申等[12]采用腹腔注射大劑量維生素D3 聯(lián)合高脂乳劑長期灌胃的方法建立痰瘀互結(jié)型AS 大鼠模型。 6 周齡Wistar 大鼠按700000 IU/kg 的總劑量分3 次腹腔注射VD3,1 次/天,連續(xù) 3 d:第 1、2 天給予萬 200000 IU/kg,第 3 天300000 IU/kg。 第4 天采用高脂乳劑灌胃,10 mL/kg,1 次/天,連續(xù) 60 d。 灌胃第 60 天,大鼠禁食 12 h,斷尾取血,離心后取血漿。 酶法測定TC、選擇性沉淀法測定HDL,根據(jù)公式(TC-HDL)/HDL 計算動脈硬化指數(shù)(AI)。 將 AI≥4.0 并且爪、唇、舌體暗紫,舌下脈絡紫脹,苔膩或黃或白滑,流涎者確定為痰瘀互結(jié)型AS 成模大鼠。 痰瘀互結(jié)證是動脈粥樣硬化中常見的證候表現(xiàn),高脂飲食損傷脾胃,久而釀濕成痰,阻滯氣血,痰瘀互結(jié),無需外界刺激因素誘導,造模方式相對簡單。

1.5 熱毒證

毒邪致病,若自外而來,其勢必急,灼血傷津；若自內(nèi)發(fā),則是日久化熱之故,臨床可見身熱較甚。王縣委等[13]采用靜脈注射脂多糖(LPS)聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)建立熱毒型動脈粥樣硬化模型。 逐漸添加高脂飼料對新西蘭白兔進行適應性喂養(yǎng),1 周后更換高脂飼料喂養(yǎng),同時靜脈注射200 ng/kg LPS,1 次/周,第5 周始給予不同藥物或蒸餾水灌胃處理。 通過血脂水平、心組織病理形態(tài)觀察AS 形成情況；通過骨髓穿刺對自體內(nèi)皮祖細胞(EPCs)進行體外培養(yǎng),并制備黃連解毒湯含藥血清進行干預,觀察黃連解毒湯對EPCs 的影響。 LPS 加高脂飼料聯(lián)合應用是動脈粥樣硬化的造模方法之一[14-15],模型組可見顯著斑塊形成,但LPS 靜注過快容易造成高死亡率,注射時應注意小劑量緩慢靜注。 LPS 是強致炎性物質(zhì),符合中醫(yī)“熱毒致病”理論。

1.6 濕熱證

因于濕,首如裹,濕熱不攘,濕與熱相兼致病,熱勢不揚,臨床表現(xiàn)可見口渴,痛如針刺,舌質(zhì)暗紅夾瘀紫,苔黃膩或厚,脈數(shù)或澀。 李亮[16]采用高脂高糖飼喂 SD 大鼠,并連續(xù) 3 d 給予維生素 D3(700000 U/kg),在此基礎(chǔ)上尾靜脈注射LPS(2 μg/kg,2 次/周,持續(xù)6 周)復制 SD 大鼠濕熱證動脈粥樣硬化模型,大鼠出現(xiàn)食欲欠佳和(或)便溏和(或)小便黃濁即可判定為濕熱證。 濕熱證與熱毒證的造模方式類同,但從證候辨析,熱毒證與濕熱證,均有熱,獨異在濕邪輕重,在臨床上濕熱證在熱證的基礎(chǔ)上同時兼具身熱不揚、出汗粘膩不爽等癥狀,故在造模上也應予以辨析。

1.7 氣虛血瘀證

病至后期,心氣不足,陰血虧耗,血行澀滯,臨床表現(xiàn)為胸悶氣短,神倦乏力,舌質(zhì)淡黯或有瘀斑瘀點,脈弱而澀。 潘繼興等[17]采用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射垂體后葉素制備冠心病氣虛血瘀證模型。 高糖高脂飼料喂養(yǎng)5 周,第6 周給予垂體后葉素6 U/kg(濃度為2 U/mL)進行造模給藥,30 min后對大鼠體溫、心電圖等指標觀察。 若大鼠出現(xiàn)以下癥狀為造模成功:(1)體征:大鼠唇周、爪子顏色紫暗,爪溫下降,耳殼、尾巴變白發(fā)涼,大便濕爛。(2)體溫:體溫顯著下降。 (3)心電圖:J 點位移顯著增加,心率減慢。 單次腹腔注射垂體后葉素誘導AS 模型容易出現(xiàn)造模不穩(wěn)定的情況[18],該造模方式在此基礎(chǔ)上進行改進,通過多次腹腔注射垂體后葉素聯(lián)合高脂飼料成功建立疾病模型,并通過具體指標對疾病、氣虛證、血瘀證模型建立進行評價,造模方法具有創(chuàng)新性。

1.8 脾虛痰濁證

“脾虛不運清濁,停留津液而痰生”,且脾居中州,為全身水道、氣機之樞紐,脾之一病,百病叢生,從而產(chǎn)生痰、飲、濕等病理產(chǎn)物。 臨床可表現(xiàn)為頭身困重,食少納呆、短氣懶言、乏力,苔白膩、脈滑。王佳等[19]采用中醫(yī)經(jīng)典復合因素造模法:飲食不節(jié)加勞倦過度造脾虛模型,配合現(xiàn)代醫(yī)學冠脈內(nèi)皮損傷手術(shù)造動脈粥樣硬化模型,建立動脈粥樣硬化脾虛痰濁證動物模型。 根據(jù)6 ～8 月雄性廣西巴馬小型豬體重的不同,每天給予體重3%的高脂高熱量喂飼共喂養(yǎng)48 周(每周稱重1 次更改喂飼量)；第2周予冠脈機械損傷干預建立AS 模型:LAD 中遠段l/3 處進行球囊擠壓伴拉傷手術(shù)；第6 周開始加入跑步過勞干預建立脾虛模型。 第24 周末行冠脈血管內(nèi)超聲(IVUS)檢查見斑塊明顯增大,平均面積狹窄率(39.55±4.56)%,提示 AS 模型構(gòu)建成功。 LDLC、TC 等指標數(shù)值均顯著升高,提示模型動物脂質(zhì)代謝異常亦切合中醫(yī)的痰濁證的概念。 同時根據(jù)自制脾虛痰濁證模型評價量表進行打分,統(tǒng)計結(jié)果有顯著差異。 飲食不節(jié)最易損傷脾胃,脾在體合肉,在此基礎(chǔ)上加入跑步損傷肌肉,誘導脾虛模型建立,該法值得借鑒。

1.9 陽虛血瘀證

陽虛不振,陰寒之邪趁虛上乘,阻滯氣血,脈絡不暢,臨床可見胸悶氣短,面色晄白,四肢欠溫。 常艷鵬[20]采取高脂飲食、腦垂體后葉素皮下注射及寒冷刺激的造模方法,建立陽虛血瘀證動物模型。 造模方法為高脂飲食+腦垂體后葉素(Pit)大劑量皮下注射+可調(diào)冰柜(-2℃～4℃ 2 h/d 冷藏。 同時運用彩色多譜勒、心電圖等診察方法及生化、光鏡等現(xiàn)代檢測技術(shù),分析驗證模型的成功建立。 該方法主要采用高脂飼喂藥物誘導聯(lián)合寒冷刺激造模,模擬冠心病人發(fā)病病機,避免了手術(shù)損傷內(nèi)膜對機體造成應激反應。

2 總結(jié)與展望

動物是科學研究的主要手段之一,有效動物模型的建立是保障實驗順利進行的基石。 目前中醫(yī)藥的相關(guān)實驗以病證結(jié)合模型為主,在建立疾病模型的基礎(chǔ)上給予不同證型的病因刺激。 動脈粥樣硬化的病證結(jié)合模型主要有以上9 種,疾病的造模方式與文獻報道一致,主要是通過高脂飲食聯(lián)合機械損傷、藥物誘導或選用易感型ApoE-/-基因敲除小鼠進行復刻[21-22],動脈斑塊的顯著形成、血脂水平的顯著升高標志著疾病模型的成功建立。 相較于手術(shù)和藥物造模方式,筆者建議采用ApoE-/-基因敲除小鼠,造模更穩(wěn)定成功率更高。 證型的造模方式主要是聯(lián)系中醫(yī)理論施加刺激因素,可根據(jù)不同證型給予單因素或復合因素進行造模:氣滯證采用聲光電慢性刺激,脾虛證采用跑步過勞干預,熱毒證采用LPS 靜注,陽虛證采用低溫刺激等,通過血脂水平評價痰濁證的建立,炎癥因子水平評價熱毒證的建立,并綜合體征、心電圖、心臟超聲及模型評價量表評價證型模型的建立。

但中醫(yī)病證結(jié)合動物模型存在以下問題:(1)無標準量化指標評價不同證型動物模型成功與否；(2)無標準量化指標區(qū)分相近證型動物模型,缺乏證型金指標；(3)實驗模型穩(wěn)定性、重復性差；(4)所造模型能否真正反映疾病的病理機制存疑。 筆者認為可以從以下幾點對模型的評價指標進行完善:(1)使用特定功效方劑對模型進行反證時可以設置相反功效的方劑進行輔助證明證型模型的成功建立。 (2)熱毒證和濕熱證在使用炎癥因子進行體內(nèi)評價時可以輔助紅外探測儀對小鼠體溫進行整體評估,從體內(nèi)體外兩個方面說明熱證模型的建立。未來隨著科技的飛躍進步,研究者們能對評價體系進行不斷完善,使病證結(jié)合模型更接近疾病發(fā)病機制,中醫(yī)證型發(fā)病機理,為深入挖掘中醫(yī)藥的廣袤寶庫夯實基礎(chǔ)。