基于化學(xué)誘導(dǎo)炎癥性腸病動物模型的中藥研究進(jìn)展

曹喻靈宋厚盼曾建國廖端芳*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),長沙 410128)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病,因遺傳、環(huán)境及免疫等多種因素共同作用而發(fā)病。 IBD 以克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)兩種主要形式為特征,臨床均可表現(xiàn)為慢性腹瀉和腹痛,甚至便血,但在疾病病理方面,UC的炎癥主要發(fā)生于結(jié)腸的粘膜和粘膜下層[1],CD的炎癥通常表現(xiàn)為跨壁和不連續(xù)性,可發(fā)生于胃腸道的任何部分,其中又以回腸末端、升結(jié)腸和直腸最常見[2]。 IBD 可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痢疾”、“腸澼”范疇。 基于循證醫(yī)學(xué)的臨床研究表明,IBD 雖被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難治疾病,但中醫(yī)藥在改善IBD 患者臨床癥狀、促進(jìn)緩解、抑制復(fù)發(fā)、減少并發(fā)癥和提高生活質(zhì)量方面呈現(xiàn)出一定特色和優(yōu)勢[3]。 IBD 的臨床常見證型包括大腸濕熱證、脾氣虛弱證、脾腎陽虛證、肝郁脾虛證、寒熱錯雜證、熱毒熾盛證[4]。

在IBD 發(fā)病機(jī)制的探索過程中,IBD 的疾病模型的建立是極其關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。 目前已經(jīng)建立了至少66 種不同的動物模型[5],這些模型分為化學(xué)誘導(dǎo)模型、細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型、基因突變模型和基因工程模型。 其中,化學(xué)誘導(dǎo)模型是最常用的 IBD 疾病模型,因?yàn)樵擃惸Ｐ途哂锌焖僬T導(dǎo)炎癥、易操作性和花費(fèi)少的基本特點(diǎn),更重要得是它模擬人類IBD 的典型臨床癥狀的同時也具備一些關(guān)鍵免疫學(xué)和組織病理學(xué)特征。 本文綜述近6 年中醫(yī)藥在常見化學(xué)誘導(dǎo)IBD 模型應(yīng)用的進(jìn)展,旨在為中醫(yī)藥在IBD 的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 TNBS 誘導(dǎo)的 IBD 模型

2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的IBD 模型是由動物直腸灌注TNBS 和乙醇混合液,乙醇損傷腸黏膜屏障,提供TNBS 穿透腸壁,進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的通道,TNBS在腸黏膜作為半抗原與大分子物質(zhì)結(jié)合形成全抗原以啟動免疫應(yīng)答[5],是一種以Th1 亞群細(xì)胞占優(yōu)勢的腸粘膜局部免疫紊亂的模型。 該模型既可以模擬急性炎癥,也可模擬慢性炎癥,此外,作為自限性腸道炎癥模型,TNBS 誘導(dǎo)的IBD 模型可用于更為復(fù)雜的IBD 緩解和復(fù)發(fā)的研究。 安腸湯是廣西中醫(yī)藥大學(xué)肖振球教授治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗(yàn)方。 該方基于肖教授認(rèn)為,UC 屬中醫(yī)“痢疾”范疇,疾病致脾腎陽虛為主,濕毒瘀邪停滯胃腸為標(biāo),創(chuàng)立安腸湯旨在扶正祛邪[6]。 安腸湯可緩解TNBS 誘導(dǎo)UC 模型大鼠的炎癥程度,促進(jìn)腸黏膜的修復(fù),其作用機(jī)制可能與安腸湯通過 miRNA-146a 調(diào)控IRAK-1/NF-κB 信號通路有關(guān)[7]。 烏梅丸是寒熱錯雜證的基礎(chǔ)方[8],近年來經(jīng)方-烏梅丸加減方在臨床和實(shí)驗(yàn)中均被廣泛地有效用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療,針對烏梅丸在IBD 中作用機(jī)制的探索研究多以TNBS 誘導(dǎo)的UC 模型,在該模型中證明烏梅丸核心作用為保護(hù)與修復(fù)腸道黏膜屏障和抗炎鎮(zhèn)痛,其機(jī)制探索關(guān)聯(lián) STAT6 信號通路、Notch 信號通路、TLR4/NF-κB 信號通路和 IL-6/JAK/STAT3 通路等多個信號通路[9]。 在近期的研究中,郭琴等[10]基于該模型探索了烏梅丸中酸、苦、甘、辛4 類藥物對UC大鼠的治療作用及相互關(guān)系,其結(jié)果提示酸味藥物(烏梅)對大鼠UC 模型具有主要的調(diào)節(jié)作用,體現(xiàn)了其作為方中君藥的作用,其次為甘、辛,而苦味藥物對大鼠UC 模型具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。 這項(xiàng)研究為進(jìn)一步研究TNBS 誘導(dǎo)的IBD 大鼠模型的陽虛證證候?qū)傩蕴峁┝藚⒖肌?/p>

2 DSS 誘導(dǎo)的 IBD 模型

葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium salt,DSS)是一種水溶性、帶負(fù)電荷的硫酸多糖。 予飲用水中添加分子量40×103～50×103的 DSS,根據(jù)其給藥濃度、持續(xù)時間和頻率的不同,可建立急性、慢性和復(fù)發(fā)性的 IBD 模型[11]。 DSS 誘導(dǎo) IBD 模型的發(fā)生機(jī)制還不清楚,目前認(rèn)為是DSS 中的硫酸基團(tuán)生成高負(fù)電荷破壞腸黏膜屏障完整性,使腸上皮通透性增加進(jìn)而誘導(dǎo)腸道炎癥；此外,DSS 的抗凝血特性會進(jìn)一步加重腸道出血[12]。 四君子湯作為健脾益氣經(jīng)典方,在該模型中發(fā)現(xiàn)可通過增加腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)以修復(fù)腸黏膜的機(jī)械屏障[13-15]。 芍藥湯治療IBD 以清熱燥濕,調(diào)和氣血為目的,在研究中證實(shí)芍藥湯能夠有效的抑制DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠的腸道炎癥反應(yīng),進(jìn)一步機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路中 Notch-1 和 Hes-1 的表達(dá)下降,Math-1 和 Muc-2 的表達(dá)增加[16]。 中藥有效成分在DSS 誘導(dǎo)IBD 模型中的作用更廣泛和深入。 實(shí)驗(yàn)表明,與DSS 治療的小鼠相比,姜黃素和白藜蘆醇治療可延長UC 小鼠的生存期,減少體重減輕的比率,減輕疾病的嚴(yán)重程度。 姜黃素和白藜蘆醇可顯著下調(diào)結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白12(ATG12)、Beclin-1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3II(LC3II)的表達(dá),并上調(diào)磷酸化mTOR 和SIRT1 的表達(dá)。 這些結(jié)果提示姜黃素和白藜蘆醇對DSS 誘導(dǎo)的UC 具有保護(hù)作用,其機(jī)制跟減少自噬和調(diào)節(jié)SIRT1/mTOR 信號通路有關(guān)[17]。 小檗堿具有抗菌、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和修復(fù)腸道屏障等作用[18],在治療IBD 顯示出重要價值。 因?yàn)槠涠喾矫娴淖饔?小檗堿在IBD 相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,模型的選擇亦是多樣性的。 在DSS 誘導(dǎo)的 IBD 模型中,已經(jīng)證實(shí)小檗堿可通過抑制TLRs/NF-κB、JAK/STAT 信號通路和激活胰島素樣生長因子1(IGF-1)/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs) 信號通路,緩解 IBD 引起的腸黏膜損傷[19]。

在DSS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中,T 細(xì)胞和B 細(xì)胞在結(jié)腸炎的發(fā)展中是非必需的[20],這使得急性DSS結(jié)腸炎模型對研究先天免疫系統(tǒng)在腸道炎癥發(fā)展中的機(jī)制有特別優(yōu)勢。 Sun 等[21]使用帶有WT 和T細(xì)胞缺陷RAG 小鼠(RAG-/-)的DSS 結(jié)腸炎模型,廣泛評估青蒿琥酯對先天免疫的影響。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示[21],青蒿琥酯顯著改善WT 和RAG1-/-小鼠的DSS 結(jié)腸炎,其作用效果相似,表明其機(jī)制主要涉及先天免疫而非適應(yīng)性免疫。 青蒿琥酯可顯著誘導(dǎo)DSS 結(jié)腸炎固有層中巨噬細(xì)胞(MΦ)和樹突狀細(xì)胞(DC)凋亡,且抑制 MΦs 分泌 TNF-α 和 DCs 分泌 IL-12p40/70。

與大多數(shù)其他IBD 模型相比,DSS 模型的一個明顯不同之處在于腸道菌群與該模型的緊密聯(lián)系。早在Okayasu 等[11]建立DSS 誘導(dǎo)的IBD 模型時,就觀察到受DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠的結(jié)腸中腸桿菌科、擬桿菌科和梭狀芽胞桿菌的數(shù)量增加。 許多研究表明證實(shí)中藥具有改善IBD 腸道菌群紊亂的作用。 中藥復(fù)方中,大黃牡丹湯[22]、半夏瀉心湯[23]、黃連解毒湯[24]、黃芩湯[25]和八味錫類散[26]等均有清熱的功效,且在不同實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可調(diào)節(jié)DSS 誘導(dǎo)IBD 的腸道菌群紊亂。 小檗堿的最新研究則顯示其可以緩解DSS 誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎的腸道菌群失調(diào),且進(jìn)一步的靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胃腸道微生物色氨酸分解代謝產(chǎn)物水平發(fā)生顯著變化,而小檗堿可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群相關(guān)色氨酸代謝物激活A(yù)hR 來治療大鼠結(jié)腸炎,從而大大改善被破壞的腸道屏障功能。 這項(xiàng)研究闡明了小檗堿改善腸道屏障功能的新機(jī)制[27]。

3 噁唑酮誘導(dǎo)的IBD 模型

噁唑酮誘導(dǎo)的IBD 模型是基于Th2 細(xì)胞因子過度產(chǎn)生探索IBD 發(fā)病機(jī)制的理想模型[28]。 造模時,直腸給藥溶于30%～50%乙醇的噁唑酮,乙醇破壞腸黏膜屏障后,噁唑酮作為半抗原介導(dǎo)Th2 驅(qū)動的免疫應(yīng)答以誘導(dǎo)結(jié)腸急性炎癥反應(yīng)。 穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide, AND)是藥用植物穿心蓮的主要活性成分,Zhang 等[29]的研究通過噁唑酮(OXZ)誘導(dǎo)UC 大鼠模型,探討了AND 對 UC 的作用。 結(jié)果顯示AND 治療該模型大鼠后,明顯改善了損傷組織的隱窩結(jié)構(gòu)和減少了炎癥細(xì)胞的浸潤,抗炎機(jī)制則可能通過減少IL-4/IL-13 與IL-4R 的特異性結(jié)合,從而抑制信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子6(p-STAT6)的磷酸化,阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 康復(fù)新液是由美洲大蠊(Periplaneta Americanal)提取物制得的一種純中藥制劑,具有通利血脈,養(yǎng)陰生肌之功效,在臨床應(yīng)用中對胃腸道黏膜的保護(hù)及修復(fù)作用明確,但是其作用機(jī)制尚不清楚[30]。 杜雯雯等[31]通過噁唑酮誘導(dǎo)UC 大鼠,初步探索康復(fù)新液對IBD 的作用發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與上調(diào)IL-4 表達(dá)水平和下調(diào)IL-13水平有關(guān)。 蒲公英作為一種藥食兩用的菊科植物,具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用。 陳金虎等[32]依據(jù)中醫(yī)治療UC 的特點(diǎn)將美洲大蠊與具有抗炎功效的蒲公英進(jìn)行配伍,組成抗炎和促修復(fù)作用更為顯著的動植物藥復(fù)方Ento-PB,通過噁唑酮誘導(dǎo)的大鼠UC 模型評價復(fù)方Ento-PB 對活動期UC 的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)方Ento-PB 可以降低TNF-α、IL-13 水平,而 IL-4、IL-10 和 EGF 水平升高,且在促進(jìn)黏膜修復(fù)方面優(yōu)于柳氮磺吡啶。 陸允敏[33]的研究同時使用了兩種化學(xué)誘導(dǎo)的IBD 模型,即TNBS誘導(dǎo)的CD 大鼠模型和噁唑酮誘導(dǎo)的UC 小鼠模型。實(shí)驗(yàn)首先從細(xì)胞凋亡、Th1/Th2 比值檢測兩方面證實(shí)了TNBS 誘導(dǎo)的CD 大鼠模型是一種以Th1 亞群細(xì)胞占優(yōu)勢的腸粘膜局部免疫紊亂的模型；而噁唑酮誘導(dǎo)的UC 小鼠模型是一種以Th2 亞群占優(yōu)勢的腸粘膜局部免疫紊亂的模型。 在加入不同濃度的川芎嗪后,發(fā)現(xiàn)2 mg/mL 川芎嗪可顯著誘導(dǎo)LPMC凋亡和抑制 IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-33、VCAM-1、IL-2、 IL-12、 IFN-γ、 TNF-ɑ、 ICAM-1、 iNOS 和 P-selectin 細(xì)胞因子的表達(dá),提示川芎嗪可能具有誘導(dǎo)LPMC 凋亡以及干預(yù)Th1/Th2 動態(tài)平衡的作用。

4 其他化學(xué)誘導(dǎo)的IBD 模型

4.1 乙酸誘導(dǎo)的IBD 模型

動物經(jīng)直腸給予乙酸,可導(dǎo)致上皮損傷、黏膜通透性增加以及透壁炎癥反應(yīng),其病變局限于結(jié)腸,病變程度與劑量和濃度相關(guān)。 乙酸誘導(dǎo)的IBD模型雖然具備易于誘導(dǎo),價格低廉的特點(diǎn),但該模型對IBD 的免疫特性的影響有限,且不適宜建立觀察慢性或復(fù)發(fā)的IBD 動物模型。 康復(fù)新液的研究是先證實(shí)其對經(jīng)典TNBS[34]及2,4-二硝基氯苯聯(lián)合乙酸誘導(dǎo)的慢性大鼠UC 模型[35]具有顯著的療效,再使用乙酸誘導(dǎo)的大鼠UC 模型[36]探索康復(fù)新液灌腸對急性UC 的作用及機(jī)制。

4.2 碘乙酰胺誘導(dǎo)的IBD 模型

碘乙酰胺(iodoacetamide,IA)是一種巰基化合物的阻滯劑。 該模型的建立是基于Satoh 等[37]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性的巰基化合物(如谷胱甘肽)具有保護(hù)胃黏膜的作用。 經(jīng)結(jié)腸內(nèi)注入可以誘發(fā)結(jié)腸炎癥,并且隨著巰基化合物的減少,會出現(xiàn)腹瀉、結(jié)腸擴(kuò)張及粘連、黏膜損傷、體重減輕等。 該模型因?yàn)榇笫蟮捏w質(zhì)量、IA 劑量、實(shí)驗(yàn)周期以及是否采用麻醉均會影響IA 誘導(dǎo)UC 模型的成功率[38],且模型病理改變會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,故該模型現(xiàn)在已較少使用。

5 小結(jié)

近年來,炎癥性腸病因其發(fā)病率的逐年上升,日益受到學(xué)者們的關(guān)注。 中醫(yī)藥對IBD 治療具有療效穩(wěn)定、副反應(yīng)少、價格親民等優(yōu)勢,因此中醫(yī)藥治療IBD 的實(shí)驗(yàn)藥效學(xué)研究及分子生物學(xué)機(jī)制研究亟待更深入的探討。 在以往研究中[39-41],有學(xué)者使用IBD 中醫(yī)證候模型進(jìn)行基礎(chǔ)研究,這些模型雖以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為前提,但是模型干預(yù)措施復(fù)雜且不具一致性,在模型評價中亦缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),因此,作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式下的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,更傾向使用經(jīng)典的IBD 模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

現(xiàn)今,分子生物學(xué)方法在中醫(yī)藥治療IBD 的實(shí)驗(yàn)研究中已十分普遍,化學(xué)誘導(dǎo)的IBD 模型作為運(yùn)用最廣泛的IBD 模型在實(shí)驗(yàn)研究中也很常見。 因此,在中醫(yī)藥治療IBD 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,選擇該類模型時應(yīng)考慮以下幾點(diǎn):(1)實(shí)驗(yàn)所選模型癥狀及病理特征與中醫(yī)藥的IBD 臨床證型的相似性；(2)不同化學(xué)誘導(dǎo)IBD 動物模型的免疫反應(yīng)特點(diǎn)中醫(yī)藥治療IBD 臨床證型的相關(guān)性；(3)綜合考慮實(shí)驗(yàn)動物的遺傳背景,尤其是在混合型小鼠IBD 模型建立中；(4)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)施對造模的干擾情況。 隨著遺傳學(xué)及免疫學(xué)研究的不斷深入,IBD 發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)比先前預(yù)測的復(fù)雜,無論中醫(yī)還是西醫(yī),目前都沒有單一的IBD 模型與人類IBD 的所有方面相吻合,不斷積累來自每個模型系統(tǒng)的數(shù)據(jù)將彌補(bǔ)彼此的缺陷,并為實(shí)驗(yàn)合理選擇模型以及臨床開發(fā)新的治療措施提供有效參考。