病證結(jié)合模式下肺癌實驗動物模型的研究進展

譚駿嵐易 健王飛英萬佳婧覃 麗戴愛國*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院-血管生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點實驗室,長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)干細胞中藥調(diào)控與應(yīng)用實驗室,長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科,長沙 410021)

肺癌(lung cancer)主要包括小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),是臨床常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤。 據(jù)最新的全球癌癥流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]:全球肺癌的總體發(fā)病率排所有癌癥中的第2 位,約占11.4%,而我國肺癌的發(fā)病率和死亡率仍位居所有腫瘤中的第1 位。 化療、靶向治療、手術(shù)治療、放療以及新興的免疫治療是當(dāng)前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肺癌的主要治療手段[2],但治療的有效性、復(fù)發(fā)率及藥物所產(chǎn)生的耐藥問題和不良反應(yīng),尤其是相當(dāng)一部分患者無法承擔(dān)高昂的治療費用,使肺癌的治療仍面對較大挑戰(zhàn)。 中醫(yī)藥作為肺癌綜合治療中的重要組成部分,在提高肺癌晚期患者的生存期[3]及生活質(zhì)量[4]、減輕放化療毒副反應(yīng)[5-6]、緩解臨床癥狀[7]、調(diào)節(jié)免疫[8-9]方面發(fā)揮了重要作用。

動物模型是醫(yī)學(xué)實驗研究的重要載體。 由于當(dāng)前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的肺癌動物模型并不能較好的貼合中醫(yī)臨床辨證論治的核心特點,使得當(dāng)前中醫(yī)藥治療肺癌的機制研究零散及滯后,且缺乏全面系統(tǒng)的深入研究[10]。 近年來,隨著既符合西醫(yī)疾病特征又具備中醫(yī)證候特點的肺癌病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建成功,并逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥治療肺癌的機制研究,為充分揭示中醫(yī)藥治療肺癌的療效及深入了解其作用的相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。

1 肺癌動物模型

臨床上,肺癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜,因其高發(fā)病率與高死亡率,所以肺癌一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。 經(jīng)過長期的研究探索,肺癌動物模型的構(gòu)建技術(shù)已趨于成熟和穩(wěn)定。 目前肺癌動物模型的種類較多,常用的動物也具有多樣性,常用的有裸鼠、A/J 小鼠、C57BL/6 小鼠、SD 大鼠、Wistar 大鼠、BABL/c 小鼠、轉(zhuǎn)基因鼠等。 目前肺癌動物模型中應(yīng)用最多的為小鼠,因為其基因與人類的同源性高達90%以上,常被用于制備移植性肺癌模型。 其中肺癌鼠類模型如:化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肺癌模型(苯并芘誘導(dǎo)[11-12]、香煙煙霧誘導(dǎo)[13-14]、N-甲基-N-硝基亞脲(MNU)誘導(dǎo)[15-16]、氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)法[17-18]、反式-2,4-癸二烯醛(tt-DDE)誘導(dǎo)[19]、4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)誘導(dǎo)[20])、化學(xué)誘導(dǎo)大鼠肺癌模型(3-甲基膽蒽(MCA)+二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)[21]、二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)[22]等)、肺癌異位移植模型[23-26]、肺癌原位移植模型[27-29]、基因修飾肺癌模型[30-31]、肺癌轉(zhuǎn)移模型[32-34](見表1)。 不同肺癌動物模型的造模時間具有較大區(qū)別,化學(xué)誘導(dǎo)的肺癌模型和基因修飾肺癌動物模型的成瘤周期較長,而肺癌移植模型成瘤周期較短。 不同的肺癌動物模型因研究的內(nèi)容不同而具有各自不同的特點,如化學(xué)誘導(dǎo)的大、小鼠肺癌模型常適用于腫瘤預(yù)防藥物的相關(guān)研究。 轉(zhuǎn)基因及移植性肺癌模型常用于肺癌病因?qū)W的研究。肺癌轉(zhuǎn)移模型可用于新藥研發(fā)。 總的來說,理想的肺癌模型需具備以下特點:(1)模型的構(gòu)建方法簡單,可操作性強,造模周期適中,能較好的模擬肺癌病理過程。 (2)模型具有較強的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,能較好的反映人體的機能狀態(tài),且模型構(gòu)建費用適合。 目前對于肺癌動物模型的評價方法主要通過動物的癥狀、生物熒光顯像、腫瘤組織病理學(xué)及影像學(xué)的檢查來進行評價[35]。

表1 肺癌常見動物模型的構(gòu)建方法Table 1 Common animal model construction method for lung cancer

2 病證結(jié)合肺癌動物模型

中醫(yī)古籍中雖沒有出現(xiàn)“肺癌”這一病名,但在眾多古書籍中所記載的“肺癰”、“肺積”、“息賁”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中肺癌的臨床特點相符。 正氣不足是肺癌的主要發(fā)病機制和病因,正如《內(nèi)經(jīng)》云“正氣存內(nèi),邪不可干”、“邪之所湊,其氣必虛”。 當(dāng)機體肺氣虧虛,邪毒可乘虛入肺,進而邪滯胸中,肺氣郁閉,宣降功能失調(diào),氣機不暢,血行瘀滯,津液輸布失調(diào),聚而為痰,痰凝氣滯,阻塞絡(luò)脈,久則痰瘀膠結(jié)于肺而形成肺積。 肺癌的發(fā)生發(fā)展是多個臟腑共同作用所致,病位雖在肺,與脾、腎密切相關(guān)。肺、脾、腎3 臟相互聯(lián)系、相互影響,共同參與肺癌的病理生理全過程。 總的來說,肺癌屬“本”虛“標(biāo)”實,虛實夾雜性疾病,“本”虛為氣陰兩虛,“標(biāo)”實為痰濁、瘀血、氣滯。 肺癌虛證以氣陰兩虛證、陰虛證為多見,實證以血瘀、氣滯、痰凝為主。 中醫(yī)藥治療肺癌療效確切,臨床上根據(jù)肺癌的病因病機特點常以“扶正祛邪”為主要治法,“扶正”以補肺益氣養(yǎng)陰、健脾益腎為主,“祛邪”以活血化瘀、清熱解毒、化痰散結(jié)為要[36],姜怡等[37]研究表明通過益氣養(yǎng)陰以扶正固表,清熱解毒標(biāo)本兼顧的方法并基于此理論指導(dǎo)下的益氣養(yǎng)陰解毒方可以抑制小鼠肺癌原位移植瘤模型的腫瘤生長,并延長小鼠的生存期,其他的經(jīng)典名方如具有清燥潤肺、益氣養(yǎng)陰功效的清燥救肺湯的臨床療效同樣顯著[38],并能通過干擾肺癌細胞的能量代謝來抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠腫瘤的增殖[39]。 陳曉波等[40]根據(jù)“腎為先天之本、脾為后天之本”的理論創(chuàng)立的脾腎顆粒,具有培補脾腎、益氣生血功效,可通過增強NK 細胞的活性、提高CD4+T 細胞數(shù)目和CD4+/CD8+比值來抑制Lewis 肺癌小鼠腫瘤的增殖。

動物模型已成為醫(yī)學(xué)研究的重要手段。 近年來,不斷有研究者在基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論上建立了具有中醫(yī)特色的病證結(jié)合肺癌動物模型。 目前肺癌病證結(jié)合動物模型有4 種:氣陰兩虛證、脾氣虛證、腎虛證、氣滯血瘀證(見表2)。

表2 肺癌常用病證結(jié)合模型總結(jié)Table 2 Summary of the syndrome combination model commonly used in lung cancer

2.1 氣陰兩虛證

氣陰兩虛證是肺癌患者臨床最為常見的證型[41],通過肺癌病證結(jié)合動物模型對該證型的模擬具有廣泛的應(yīng)用價值。 吳海良等[42]采用溫?zé)嶂兴幗o予小鼠灌胃加“刨花煙熏”與Lewis 肺癌荷瘤模型結(jié)合起來構(gòu)建了肺癌氣陰兩虛病證結(jié)合模型,并通過觀察小鼠的癥狀體征, 檢測白細胞介素 1(interleukin-1,IL-1)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平及對腫瘤組織進行病理學(xué)檢測等方法對模型進行評價。 與對照組相比,病證結(jié)合模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)逐漸脫落,無光澤,運動量下降,飲食減少,疲倦乏力,體重下降,氣短等氣陰兩虛癥狀,且IL-1、MDA 水平升高,病理學(xué)觀察瘤組織均呈現(xiàn)中低分化的腺癌特征,腫瘤細胞呈浸潤生長,壞死較少。 同時進行以方測證,采用具有益氣養(yǎng)陰作用的金復(fù)康口服液進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰中藥組的小鼠腫瘤相比較對照組明顯縮小,進一步驗證了氣陰兩虛肺癌模型的構(gòu)建成功。 除此之外,后續(xù)逐漸也有學(xué)者在此模型基礎(chǔ)上,進行了益氣養(yǎng)陰中藥治療肺癌的作用機制研究[43-48]。 因此初步判斷,該造模方法具有一定的穩(wěn)定性和可靠性。

2.2 脾氣虛證

脾為肺之母,“脾氣散精,上歸于肺”,所以肺癌病位雖在肺,但與脾密切相關(guān),脾氣虛證在肺癌患者中也是十分常見[41,49]。 錢鈞等[50]采用“苦寒瀉下法+饑餓法+疲勞法”建立小鼠脾氣虛證模型,可在造模3、4 d 后陸續(xù)觀察到小鼠的脾虛癥狀,并在造模后第15 天通過血清檢測發(fā)現(xiàn)脾氣虛模型組小鼠血清D-木糖和胃泌素水平明顯低于對照組。 隨后將小鼠Lewis 肺癌腫瘤細胞株接種于小鼠右腋皮下構(gòu)建脾氣虛肺癌模型。 該課題組的其他成員也同樣采取此方法構(gòu)建脾氣虛證肺癌模型,并以此為基礎(chǔ)來對益氣健脾中藥如黃芪建中湯[51]、加味黃芪建中湯[52]、加味四君子湯[53]進行抗肺癌的作用機制研究。

2.3 腎虛證

肺癌乃“本虛標(biāo)實”之疾病,而正氣虧虛之根本在于腎虛[54],因此腎虛所形成的機體內(nèi)環(huán)境也可能是導(dǎo)致肺癌發(fā)生發(fā)展的重要病因。 豆萌萌等[55]采用手術(shù)去勢和Lewis 肺癌荷瘤模型結(jié)合構(gòu)建肺癌腎虛病證結(jié)合模型,并動態(tài)觀察小鼠的行為表現(xiàn)、腫瘤生長情況,檢測雌二醇、睪酮和腫瘤組織病理等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎虛肺癌模型小鼠出現(xiàn)怕光、膽小易驚,毛發(fā)干枯且光澤度降低,體重下降,活動時間減少等腎虛證候。 與假手術(shù)組相比,腎虛肺癌模型組小鼠的腫瘤增長速度明顯增快、腫瘤體積明顯增大,血清雌二醇、睪酮明顯下降,肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率升高和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量增多,結(jié)果表明此模型是可行的,并且干擾因素較少,使模型的可操作性和可控性較強。

2.4 氣滯血瘀證

吸煙、環(huán)境污染等可導(dǎo)致肺失宣降,氣機失常,血行瘀滯,瘀毒氣血膠結(jié)導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[56],所以氣滯血瘀證也是肺癌患者主要證型之一。 彭召云等[57]采用“腎上腺素+束縛法”與Lewis 肺癌荷瘤模型結(jié)合構(gòu)建了肺癌氣滯血瘀病證結(jié)合模型,動態(tài)觀察小鼠的行為表現(xiàn)、并通過檢測小鼠的瘤體體積和重量來進行評價。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀肺癌模型組小鼠出現(xiàn)聚堆、易激惹、形體消瘦,進食量和活動量減少,口周、爪甲、肛周及耳緣出現(xiàn)散在脈絡(luò)瘀血等與臨床證候類似的氣滯血瘀證候表現(xiàn),與對照組相比,氣滯血瘀肺癌模型組小鼠的腫瘤體積增大,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達升高,該模型在一定程度上與臨床的發(fā)病特點相符合,具備可行性。

3 討論和展望

病證結(jié)合動物模型是病證結(jié)合藥理學(xué)研究體系中的關(guān)鍵一環(huán),也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的重要組成部分。

3.1 病證結(jié)合肺癌動物模型的關(guān)鍵問題

肺癌病證結(jié)合動物模型在當(dāng)前已有的疾病造模的基礎(chǔ)上雖取得了一定的研究進展與成績,但同時也存在較多的問題與爭議。 (1)造模思路單一,均采用“先證后病”的造模方法。 目前肺癌的病證結(jié)合動物模型基本都是在先根據(jù)中醫(yī)的病因建立證候模型,然后再通過皮下注射LEWIS 肺癌細胞細胞復(fù)制肺癌疾病模型。 該方法可能存在人為所施加的干預(yù)因素對疾病模型造成改變,且病與證二者相互影響并非獨立,增加了干擾因素從而降低了模型的穩(wěn)定性和準確性。 “先證后病”的復(fù)合造模方法與中醫(yī)臨床的病證結(jié)合存在偏差。 臨床上辨證常通過“望、聞、問、切”四診合參全面收集患者的診療信息,而在肺癌病證結(jié)合動物模型中,研究者大多只通過對動物的簡單觀察或進行一些相關(guān)檢測來收集證候信息,因而無法對肺癌臨床證型進行客觀的復(fù)制。 此外,“先證后病”的造模方法無法闡明不同肺癌病理類型與證型之間的關(guān)聯(lián)性。 (2)缺乏客觀、統(tǒng)一的模型評價標(biāo)準。 在肺癌病證結(jié)合動物模型中,造模目前主要采用腫瘤組織病理學(xué)、血液學(xué)指標(biāo)檢測等手段,對動物的證候評價主要通過觀察動物的一般行為、宏觀表征及行為學(xué),缺乏成熟完善的證候指標(biāo)評價體系。 所以,目前學(xué)術(shù)界對病證結(jié)合動物模型的認可度不高。 (3)肺癌疾病模型單一,病證結(jié)合模型應(yīng)用較少。 目前報道的肺癌病證模型中肺癌的疾病模型均是采用的肺癌異位移植模型,且細胞原位移植模型等其他肺癌疾病模型未見報道。 目前報道的肺癌病證結(jié)合模型有4 種,運用較多的為氣陰兩虛證、和脾氣虛證,而“瘀血”致病理論在肺癌的發(fā)病中同樣意義重大,但目前報道較少。 此外,肺癌本質(zhì)上來說是本虛標(biāo)實,虛實夾雜性疾病,而目前虛證與實證相結(jié)合的復(fù)合證型模型尚未見報道。

續(xù)表2

3.2 病證結(jié)合肺癌動物模型的發(fā)展思路

在未來肺癌病證結(jié)合動物模型的研究中,筆者認為:(1)造模思路與方法上認為可以嘗試采用將病因和證因同時干預(yù)模型動物,從而達到病證同期的造模效果。 這樣更為貼合臨床上病證的演變規(guī)律,減少了干擾因素。 但同時也得注意多因素的同時干預(yù)可能會造成動物的死亡,從而降低模型構(gòu)建的成功率。 同時可以引入單因素造模方法,即在不同病理類型的肺癌動物模型上動態(tài)觀察動物的行為表征以及進行相關(guān)的指標(biāo)檢測等來判斷“證”的類型,這樣表現(xiàn)出來的“證”是疾病演變過程中自然的證候表現(xiàn),符合中醫(yī)臨床“證”的概念,同時也能觀察到不同病理類型的肺癌模型所表現(xiàn)出來的證的異同,并能在一定程度上能揭示肺癌不同證型與病理類型的關(guān)系。 (2)動物的物種存在差異,造模因素繁雜各異,不同證型之間界定存在分歧等問題,可借助臨床指南的制定思路對動物的類別的選擇及不同證型的干預(yù)手段進行標(biāo)準化建設(shè)去實現(xiàn)肺癌病證結(jié)合動物模型的“病-證-癥”統(tǒng)一。 (3)在模型評價方面,可以借助現(xiàn)代的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)。系統(tǒng)生物學(xué)的“整合”思想與中醫(yī)學(xué)的整體觀念相切合,且彌補了傳統(tǒng)四診方法的不足與局限[58]。 當(dāng)肺癌病證結(jié)合模型建立后,一方面收集小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)特征,另一方面利用代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)篩選模型動物不同證候的特異性生物標(biāo)記物從而將中醫(yī)的證候指標(biāo)進行客觀的量化,并可以此為藥物靶點用以檢驗方藥的有效性。 同時,“以方測證”反向驗證評價肺癌模型缺乏針對性,且方證之間的緊密性不足,所以當(dāng)使用“以方測證”反向驗證法時,應(yīng)當(dāng)充分考慮到中藥多靶點和一方可治療對證的特點,因此需設(shè)置對照試驗來增加研究結(jié)果的特異性。

綜上所述,肺癌病證結(jié)合動物模型目前仍處于起步的摸索階段,動物模型的總體穩(wěn)定性較差,且模型構(gòu)建操作技術(shù)不夠成熟。 因此,必須在遵循動物模型必備的穩(wěn)定性、可重復(fù)性、可行性、客觀真實性等原則條件下,不斷去優(yōu)化現(xiàn)有的肺癌病證結(jié)合模型構(gòu)建技術(shù)和方法,并借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)完善模型的評價標(biāo)準,加大研發(fā)力度,提高肺癌病證模型的創(chuàng)新性,構(gòu)建出符合中醫(yī)臨床辨證特點的高認可度的肺癌病證結(jié)合動物模型。