檳榔對(duì)小鼠的抗抑郁作用影響及機(jī)制研究

裴海月姜 寧王孟迪王鳳忠敖冬梅王 瓊*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國(guó)際合作中心/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,四川 瀘州 646000；3.北京城市學(xué)院,北京 100094；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193)

抑郁障礙(depressive disorder)是以顯著而持久的心境低落為主要特征,表現(xiàn)出持續(xù)的情緒低落,興趣減退或樂(lè)趣喪失等癥狀的精神疾病。 現(xiàn)代社會(huì)節(jié)奏快、壓力大,使人們身心健康受到嚴(yán)重威脅,易出現(xiàn)抑郁癥。 WHO 對(duì)抑郁癥患者的統(tǒng)計(jì)顯示,全球約3.5 億人被此癥折磨,平均發(fā)病率在4.4%左右[1],終生患病率為5.2%～16.2%[2]。 黃悅勤教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表“中國(guó)抑郁障礙患病率及衛(wèi)生服務(wù)利用的流行病學(xué)現(xiàn)況研究”最新數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)成人抑郁障礙終生患病率達(dá)6.8%,其中抑郁癥患病率為3.4%[3]。 據(jù)“全球疾病負(fù)擔(dān)研究”報(bào)告顯示,在精神障礙類疾病中,抑郁障礙所致的疾病負(fù)擔(dān)在中國(guó)乃至全球均居首位[4]。 在全球所有疾病的疾病負(fù)擔(dān)中抑郁障礙排名第13 位,中國(guó)處于第11 位之高,可見(jiàn)此癥給社會(huì)、家庭和個(gè)人都造成了嚴(yán)重心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前的抗抑郁藥物療效有限,與其出現(xiàn)的副作用有關(guān)[5-6]。 臨床上治療抑郁癥主要以化學(xué)合成藥物為主,具有治療效果但常伴隨不良反應(yīng)的發(fā)生,存在抗抑郁譜窄、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)[7-8],使其安全性存在隱患,臨床應(yīng)用具有局限性。 故開發(fā)高效、低毒、機(jī)制明確的抗抑郁中藥產(chǎn)品成為治療抑郁癥的一大思路與方向,也將在未來(lái)成為神經(jīng)精神疾病的研究熱點(diǎn)。

四大南藥之首的檳榔(Areca catechuL.,以下簡(jiǎn)稱:ACL)作為一大常用中藥,具有“殺蟲消積,降氣,行水,截瘧”之功效[9],在古方及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中均得到廣泛應(yīng)用[10]。 研究顯示,檳榔的提取物對(duì)抑郁癥可能有治療作用[11],但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)檳榔抗抑郁作用開展系統(tǒng)研究。 因此,本研究利用經(jīng)典的抗抑郁藥物模型及篩選方法(懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、利血平拮抗實(shí)驗(yàn)),評(píng)價(jià)檳榔的抗抑郁作用療效,并采用利血平拮抗模型對(duì)其作用機(jī)制(神經(jīng)遞質(zhì)含量變化和氧化應(yīng)激水平)進(jìn)行初步探索,以挖掘檳榔抗抑郁作用的潛能及在神經(jīng)精神領(lǐng)域可提供的有利價(jià)值,為開發(fā)抗抑郁新藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 ICR 小鼠 120 只,體重 18 ～ 22 g(3周齡),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK(京)2016-0011]。 實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(室溫22℃～25℃,濕度55%±5%,12 h 照明/12 h 黑暗,照明時(shí)間為:8:00 am ～20:00 pm),動(dòng)物房持續(xù)保持安靜無(wú)雜音。 自由進(jìn)食SPF 級(jí)動(dòng)物飼料及動(dòng)物飲用水。 實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所進(jìn)行[SYXK(京)2017-0020],經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利委員會(huì)審查批準(zhǔn)( SLXD-2021052117),實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守3R 原則。

小鼠根據(jù)體重進(jìn)行隨機(jī)分配,以確保各組間體重基線相似。 每組12 只,小鼠給藥體積:20 mL/kg。適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d 后開始實(shí)驗(yàn),每3 d 進(jìn)行1 次體重監(jiān)測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

檳榔(全果超微粉,湖南口味王集團(tuán))；氟西汀(鹽酸氟西汀膠囊,fluoxetine hydrochloride,法國(guó)禮來(lái)公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；利血平注射液(reserpine,天津金耀藥業(yè)有限公司)。 超氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào):20210811)；過(guò)氧化氫酶(CAT)(批號(hào):20210901)；丙二醛(MDA)(批號(hào):20210810),以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。 乙腈、甲醇色譜純(美國(guó)Merck 公司)；甲酸銨分析純(北京化工廠)；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT,貨號(hào):H7752)；5-羥吲哚乙酸(5-hydroxy indoleacetic,5-HIAA,貨號(hào):H8876)；多巴胺(Dopamine,DA,貨號(hào):H8502)；γ-氨基丁酸(γ amino acid butyric acid,GABA)；3,4-二羥基芐胺(DHBA,貨號(hào):A7000),以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

小鼠自主活動(dòng)測(cè)定儀(KSME01)及小鼠自主活動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng),小鼠恒溫游泳儀(KSQT6),小鼠懸尾儀(KSXS01)及小鼠懸尾實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng),以上均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心和北京康森益友科技有限公司聯(lián)合研制開發(fā)；Q-Trap5500 型質(zhì)譜分析儀(美國(guó)應(yīng)用技術(shù)公司)；電子直腸式體溫計(jì)(OMRON MC-347)；AL104 電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；Vibra-Cell 型超聲波破碎儀(美國(guó)Sonics公司)。

1.3 方法

ICR 小鼠60 只,實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5 組,每組12 只,共60 只。 分別為空白對(duì)照組(0.5% CMC-Na)、陽(yáng)性藥組(氟西汀:20 mg/kg)、檳榔低、中、高3 個(gè)劑量組(低劑量:160 mg/kg；中劑量:320 mg/kg；高劑量:640 mg/kg)。 按上述方法連續(xù)給藥14 d 后進(jìn)行以下3 項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè),行為學(xué)檢測(cè)前1 h 灌胃給藥。具體實(shí)驗(yàn)流程如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程和行為測(cè)試示意圖Note. OFT, Open field test. TST, Tail suspension experiment. FST, Forced swimming test.Figure 1 Schematic representation of the experimental procedure and behavioral tests

1.3.1 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test, OFT)

利用小鼠曠場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)進(jìn)行自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 自主活動(dòng)測(cè)試箱由4 個(gè)開放的方形測(cè)試桶組成(30 cm × 28 cm × 35 cm),利用攝像頭系統(tǒng)對(duì)測(cè)試動(dòng)物實(shí)時(shí)檢測(cè),通過(guò)軟件分析處理動(dòng)物運(yùn)動(dòng)信息。 實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期和測(cè)試期。 將小鼠沿壁放入測(cè)試箱適應(yīng)2 min 后,檢測(cè)動(dòng)物5 min 內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況,評(píng)價(jià)指標(biāo)包括:運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均速度。

1.3.2 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension experiment, TST)

將小鼠距離尾尖部約1 cm 處纏上膠布(約寬6 mm,長(zhǎng)6～8 cm),同時(shí)掛在小鼠懸尾儀測(cè)試箱中的“S”型小鐵鉤上倒懸體位,其頭部距箱底約5 ～10 cm,測(cè)試共6 min,前2 min 為適應(yīng)期,傳感器連接系統(tǒng)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min 內(nèi)的累積不動(dòng)時(shí)間。

1.3.3 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,FST)

將小鼠分別放入水深15 cm 的小鼠恒溫游泳儀(高20 cm,直徑14 cm)中,水溫維持在(24±1)℃。測(cè)試共6 min,前2 min 為適應(yīng)期,系統(tǒng)自動(dòng)記錄小鼠后4 min 內(nèi)游泳累積不動(dòng)時(shí)間。

1.3.4 小鼠利血平拮抗實(shí)驗(yàn)

ICR 小鼠60 只,實(shí)驗(yàn)設(shè)置共5 組,每組12 只,分別為模型組(reserpine+control)、陽(yáng)性對(duì)照組(reserpine+fluoxetine(20 mg/kg))、檳榔低(reserpine+ACL(160 mg/kg))、中(reserpine+ACL(320 mg/kg))、高(reserpine+ACL(640 mg/kg))3 個(gè)劑量組。按上述方法連續(xù)給藥14 d,于末次給藥1 h 后,各組腹腔注射2 mg/kg 利血平(reserpine,1 mg/mL)進(jìn)行造模。 評(píng)價(jià)指標(biāo):注射利血平1 h 后,眼瞼閉合度觀測(cè)；注射利血平4 h 后,體溫觀測(cè)。 體溫觀測(cè)使用電子體溫計(jì)(插入肛門約1 cm)測(cè)量小鼠肛溫。 眼瞼閉合度觀測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn):全部睜開記為4 分,眼閉1/4記為3 分,2/4 記為2 分,3/4 記為 1 分,全閉記為 0分[12]。 具體實(shí)驗(yàn)流程如圖2 所示。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程和行為測(cè)試示意圖Figure 2 Schematic representation of the experimental procedure and behavioral tests

1.3.5 生化指標(biāo)測(cè)定

利血平拮抗實(shí)驗(yàn)觀測(cè)指標(biāo)檢測(cè)后進(jìn)行取材,小鼠取血,血漿于4℃靜置,隔日離心(3500 r/min,10 min,4℃),吸取血清,于-80℃冰箱貯藏。 采血后,將小鼠處死,在冰上迅速剝離出全腦組織,去除小腦組織后,按序分裝于0.5 mL 離心管放入液氮中暫存,取材結(jié)束統(tǒng)一貯藏于-80℃冰箱。

(1)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定

檢測(cè)前分裝稱重腦組織(重量約20 ～30 mg),每個(gè)樣本中加入100 μL 超純水,冰浴中超聲勻漿。精密吸取50 μL 組織勻漿液置于離心管中,加入100 μL 乙腈溶液(含內(nèi)標(biāo) DHBA 5 μg/mL,4℃),渦旋混勻,4℃低溫離心 30 min(20000 r/min)。 離心后,小心吸取上清液依次轉(zhuǎn)入樣品瓶中進(jìn)行HPLCMS 分析。 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并依次計(jì)算各樣本神經(jīng)遞質(zhì)含量。

含量測(cè)定采用TSK Gel amide 80 (2.0 mm ×150 mm, 3 μm) 色譜柱(柱溫35℃),流動(dòng)相乙腈-15 mmol/L 甲酸銨水溶液(pH=5.5)(40 ∶60),流速0.4 mL/min。 質(zhì)譜檢測(cè)器(Q-Trap 5500 型質(zhì)譜分析儀)以電噴霧電離方式進(jìn)行離子化,以多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式進(jìn)行掃描。 離子源及其他相關(guān)參數(shù)優(yōu)化為:TEM:500℃；CAD:Medium；Gas1:50 psi；Gas2:70 psi；CUR:20 psi。 掃描方式為離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式,參數(shù):噴霧電壓 5500 V；EP:10；CXP:10。 用于定量分析的離子為m/z177.0→160.0 (5-HT) ；m/z154.2→136.6 (DA)[13]。

(2)氧化應(yīng)激水平測(cè)定

取小鼠全腦組織稱重后置于1.5 mL EP 管中,加入生理鹽水(重量(g):生理鹽水(mL)= 1 ∶9)制成 10%的組織勻漿。 離心(4℃,3000 r/min,10 min)取組織上清液。 按照各試劑盒說(shuō)明書對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行SOD、MDA 和CAT 含量的測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),使用最小顯著差數(shù)法(LSD)多重比較方法或非參數(shù)兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)(曼-惠特尼檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差()表示,P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檳榔對(duì)小鼠體重的影響

如圖3 所示各組的體重均有穩(wěn)步上升。 與空白對(duì)照組相比,檳榔給藥組整體增長(zhǎng)趨勢(shì)較緩,但各組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05),表明檳榔給藥后未出現(xiàn)對(duì)動(dòng)物的體重有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響。 實(shí)驗(yàn)中觀察到高劑量組小鼠排便增多,飲食飲水量未見(jiàn)減少的現(xiàn)象,考慮檳榔具有“消積行氣”之功效,對(duì)胃腸道消化具有促進(jìn)作用。 且結(jié)合參考文獻(xiàn)報(bào)道[14],檳榔中的檳榔堿對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌具有收縮作用,其促收縮作用會(huì)隨檳榔堿劑量增加而增強(qiáng),從而增加胃腸蠕動(dòng)和排便次數(shù),故此可能是造成其體重與空白組相比較呈下降趨勢(shì)的原因。

圖3 檳榔對(duì)小鼠體重的影響(n=12, )Figure 3 Effects of Areca catechu L. on body weight of mice

2.2 檳榔對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)中自發(fā)活動(dòng)的影響

由表1 可知,與空白對(duì)照組相比,檳榔各劑量組在OFT 的運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平均速度,各組間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),各組間自主活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)速度相當(dāng)。 表明檳榔對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)無(wú)明顯影響。

表1 檳榔對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響(曠場(chǎng)法)(n=12, )Table 1 Effects of Areca catechu L. on spontaneous activity in mice(open field test)

空白對(duì)照組Control氟西汀組Fluoxetine檳榔(160 mg/kg)ACL(160 mg/kg)檳榔(320 mg/kg)ACL(320 mg/kg)檳榔(640 mg/kg)ACL(640 mg/kg)總路程(cm)Total distance 1662.14±154.95 1552.99±149.05 1445.52±88.72 1379.52±220.81 1393.05±127.43運(yùn)動(dòng)總時(shí)間(s)Time of movement 123.83±8.12 118.38±7.95 111.99±5.76 101.75±14.14 106.35±8.07平均速度(cm/s)Average velocity 7.36±0.46 7.05±0.45 6.68±0.29 6.59±0.29 7.64±0.44

2.3 檳榔對(duì)懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)的影響

如圖4 所示,與空白對(duì)照組相比,檳榔320 mg/kg 劑量組 TST 不動(dòng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),檳榔640 mg/kg 劑量組不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P＜0.01)。 另陽(yáng)性藥氟西汀組及檳榔160 mg/kg劑量組不動(dòng)時(shí)間降低趨勢(shì)明顯,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07、P=0.1)。

圖4 檳榔連續(xù)給藥14 d 對(duì)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響(n=11～12, )Note. Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 4 Effects of Areca catechu L. on immobility time of mice in TST after 14 d continuous administration

2.4 檳榔對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳(FST)實(shí)驗(yàn)的影響

如圖5 所示,與空白組相比,檳榔160、640 mg/kg 劑量組 FST 不動(dòng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 檳榔320 mg/kg 劑量組具有降低不動(dòng)時(shí)間的趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 檳榔連續(xù)給藥14 d 對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響(n=10, )Note. Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 5 Effects of Areca catechu L. on immobility time of mice in FST after 14 d continuous administration

2.5 檳榔對(duì)利血平拮抗實(shí)驗(yàn)的影響

與模型組相比(圖6A),陽(yáng)性藥氟西汀組、檳榔160、640 mg/kg 劑量組可顯著逆轉(zhuǎn)利血平引起的肛溫降低(P＜0.01)。 與模型組相比(圖 6B),檳榔160、320、640 mg/kg 3 個(gè)劑量組均可逆轉(zhuǎn)利血平引起的眼瞼下垂(P＜0.05),其中檳榔160、640 mg/kg劑量組逆轉(zhuǎn)作用顯著(P＜0.01)。

圖6 檳榔對(duì)利血平拮抗所致眼瞼下垂、體溫降低的影響(n=12,)Note. Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 6 Effects of Areca catechu L. on the reserpine-induced eye ptosis and hypothermia

2.6 檳榔對(duì)利血平拮抗小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與利血平拮抗模型相比,檳榔640 mg/kg 劑量組和陽(yáng)性藥氟西汀組可顯著增加小鼠腦組織中5-HT 含量(P＜0.01)(圖 7A)；檳榔 160、640 mg/kg 劑量組可以顯著增加小鼠腦組織中 DA 含量(P＜0.01),檳榔320 mg/kg 劑量組、陽(yáng)性藥氟西汀組可增加小鼠腦組織中DA 含量的趨勢(shì),但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7C)；檳榔160、320 mg/kg 劑量組和陽(yáng)性藥氟西汀組可以顯著增加小鼠腦組織中GABA 水平(P＜0.05),檳榔640 mg/kg 劑量組具有增加小鼠腦組織中GABA 含量的趨勢(shì),但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7D)。 如圖7B 所示,與利血平拮抗模型比較,檳榔320、640 mg/kg 劑量組可以顯著降低小鼠腦組織中 5-HIAA 含量(P＜0.01)。

圖7 檳榔對(duì)利血平拮抗小鼠腦組織中5-HT、5-HIAA、DA、GABA 水平的影響(n=8～12,)。Note. Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 7 Effects of Areca catechu L. on 5-HT, 5-HIAA, DA, GABA levels in brain tissue of reserpine-induced mice

2.7 檳榔對(duì)利血平拮抗小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

如圖8 所示,與模型組相比,檳榔160、320、640 mg/kg 劑量組小鼠腦組織SOD 活性(P＜0.01),CAT活性均顯著升高(P＜0.01),檳榔320、640 mg/kg 劑量組MDA 含量顯著減少(P＜0.01)。

圖8 檳榔對(duì)利血平拮抗小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響(n=8,)Note. Compared with the model group, **P＜0.01.Figure 8 Effects of Areca catechu L. on the reserpine-induced oxidative stress in brain tissue of mice

3 討論

在中醫(yī)學(xué)中抑郁癥屬“郁證”,其是由情緒不適、氣滯、氣血不暢引起的綜合征,與多臟器損傷、功能紊亂相關(guān)[15]。 目前已有眾多中藥及中藥復(fù)方均顯示出一定抗抑郁活性,并具良好安全性,無(wú)明顯副作用,由此為中藥抗抑郁的療效及發(fā)展建立了良好基礎(chǔ)。 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,中藥檳榔具有抗抑郁的潛能[16],復(fù)方蒙藥檳榔十三味丸用于治療“赫依”[17],并結(jié)合本研究中針對(duì)抑郁情緒的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,均顯示出了檳榔初步抗抑郁藥效。 因此挖掘和驗(yàn)證檳榔在防治抑郁癥的潛能是本研究的一大重要意義,繼而探究其發(fā)病機(jī)制,為社會(huì)減輕疾病負(fù)擔(dān)提供有力支持,為開發(fā)抗抑郁藥物提供價(jià)值參考。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)常貫穿應(yīng)用于動(dòng)物行為學(xué)研究中,檢測(cè)與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)行為(locomotor activity)和探索行為(exploratory behavior)。在神經(jīng)學(xué)與精神藥理學(xué)領(lǐng)域研究中可用于檢測(cè)藥物是否存在副作用(如對(duì)行動(dòng)的影響等)。 中樞興奮藥物可增加自發(fā)活動(dòng),減少探究行為,一定劑量下神經(jīng)精神藥物可減少探究行為,對(duì)自發(fā)活動(dòng)無(wú)影響。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)OFT 對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè),證明檳榔未對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)活性產(chǎn)生影響,在各劑量下均未見(jiàn)中樞神經(jīng)的過(guò)度興奮或抑制,進(jìn)一步得到檳榔可能不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑[18]。 伴隨給藥可見(jiàn)檳榔給藥組的小鼠體重整體增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)較緩,且隨劑量增加趨勢(shì)愈加明顯,但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)中觀察可見(jiàn)高劑量組小鼠排便增多,飲食飲水量未見(jiàn)減少,考慮檳榔具有“殺蟲消積,降氣,行水,截瘧”之功效[9],其消積行氣作用可能增強(qiáng)了其胃腸運(yùn)動(dòng),對(duì)胃腸道消化具有促進(jìn)作用。 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[14],檳榔中的檳榔堿對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌具有收縮作用,且其促收縮作用會(huì)隨檳榔堿劑量增加而增強(qiáng),從而增加胃腸蠕動(dòng)和排便次數(shù),可能是造成其體重與空白組相比較呈下降趨勢(shì)的原因。

兩大絕望模型懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)作為經(jīng)典的應(yīng)激模型,均具有簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)[19-20]。 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST),也稱Porsolt 實(shí)驗(yàn)[21],是研究嚙齒類動(dòng)物抑郁樣行為最常用的方法之一[22-23]。 之后懸尾實(shí)驗(yàn)以“絕望行為”啟發(fā)并根據(jù)“搜尋-等待策略(searching-waiting strategy)”而建立,后也作為研究抑郁的常用分析方法[24-25],此兩種方法是利用小鼠企圖但又無(wú)法逃脫,從而放棄掙扎,進(jìn)入特有的抑郁不動(dòng)狀態(tài)的原理,對(duì)其不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及評(píng)價(jià)。 多用于抗抑郁藥物的初步篩選,快速評(píng)價(jià)其藥效,并為起效的劑量范圍提供參考。 Dar等[26]報(bào)道發(fā)現(xiàn)檳榔在小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著抗抑郁活性。 本研究中,檳榔給藥后對(duì)行為絕望模型小鼠具有良好的抗抑郁作用,在TST中檳榔中、高劑量組和在FST 中檳榔的低、高劑量組均可明顯減少不動(dòng)時(shí)間,抗抑郁效果顯著。

利血平拮抗模型為傳統(tǒng)的藥物誘導(dǎo)抑郁模型[27],不僅在抑郁癥發(fā)病機(jī)理和抗抑郁藥物研究中廣泛使用[28-29]。 利血平為囊泡再攝取抑制劑,其通過(guò)耗竭腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如5-HT、DA等),抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生體溫降低,眼瞼下垂、心率減慢等抑郁樣癥狀。 根據(jù)抑郁癥的“單胺假說(shuō)”理論,其認(rèn)為抑郁癥與腦內(nèi)胺類神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、DA、NE)、氨基酸類(γ 氨基丁酸)神經(jīng)遞質(zhì)的及其受體水平異常有關(guān)[30-31]。 而抗抑郁藥通過(guò)增加腦內(nèi)NA 和5-HT 水平產(chǎn)生抗抑郁作用,尤其以單胺氧化酶抑制劑為例,其可不同程度拮抗利血平引起的這些行為。 檳榔表現(xiàn)出抗抑郁活性,可能是通過(guò)大腦中5-羥色胺和去甲腎上腺素的升高所介導(dǎo)的[32]。 本實(shí)驗(yàn)中檳榔從觀測(cè)指標(biāo)(肛溫、眼瞼閉合度)和神經(jīng)遞質(zhì)濃度水平的結(jié)果中均表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用,證實(shí)了既往文獻(xiàn)中對(duì)檳榔具抗抑郁作用的猜測(cè)。 并有研究報(bào)道,檳榔發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制可能與A 型單胺氧化酶(MAO)抑制劑嗎氯貝胺(moclobemide)相似[33],通過(guò)抑制單胺氧化酶同工酶A(MAO-A)的活性[34],提高神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺含量,發(fā)揮抗抑郁作用。

氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)已被明確證實(shí)其參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程[35]。 抑郁癥發(fā)作與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加及內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的濃度降低有關(guān)[36]。 抑郁癥患者會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)水平下降,伴隨包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)等的活性降低。 SOD 活性降低會(huì)引起自由基及活性氧(ROS)在體內(nèi)蓄積,當(dāng)抗氧化與氧化能力間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞,機(jī)體內(nèi)活性氧自由基異?；钴S,產(chǎn)生大量自由基而過(guò)度氧化,會(huì)導(dǎo)致腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,從而引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物堆積,如丙二醛(MDA)含量的增加。 本研究中連續(xù)給予14 d 檳榔的小鼠可明顯升高 SOD、CAT 活性及下調(diào)MDA 表達(dá)量,表明了檳榔在利血平致抑郁模型下具有良好的抗氧化應(yīng)激的作用。

對(duì)于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,檳榔均有一定的抗抑郁療效,其中檳榔中、高劑量對(duì)TST,低、高劑量對(duì)FST 和利血平拮抗實(shí)驗(yàn)中肛溫均表現(xiàn)出顯著的抗抑郁作用,低、中、高3 個(gè)劑量對(duì)利血平拮抗實(shí)驗(yàn)的體溫變化均有調(diào)節(jié)作用。 其抗抑郁作用及機(jī)制指標(biāo)結(jié)果雖不是每個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)劑量效應(yīng)遞增或遞減關(guān)系,但總體結(jié)果趨勢(shì)有效,后期可以通過(guò)擴(kuò)大動(dòng)物樣本量進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用兩種經(jīng)典可靠的應(yīng)激類模型和一種藥物誘導(dǎo)致抑郁模型,通過(guò)行為學(xué)指標(biāo)分析其抗抑郁活性,后利用利血平拮抗實(shí)驗(yàn)對(duì)其腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激的變化進(jìn)行一系列的行為學(xué)驗(yàn)證和機(jī)制探索,并基于已有文獻(xiàn)報(bào)道,證明了檳榔具有抗抑郁的活性及療效,其抗抑郁的作用機(jī)制可能與增強(qiáng)腦內(nèi)單胺神經(jīng)能系統(tǒng)水平相關(guān),并對(duì)氧化應(yīng)激水平具有調(diào)控作用,具有可逆轉(zhuǎn)氧化,校正腦內(nèi)自由基系統(tǒng)失衡的能力。