環(huán)境水體中自由基的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

盧成龍，常紅*，孫福紅

1.北京林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院

2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

自由基（free radical），或稱(chēng)游離基，是一類(lèi)化學(xué)活性高、濃度低、壽命短，具有未配對(duì)價(jià)電子(即外層軌道具有奇數(shù)電子)的原子、原子團(tuán)或分子。環(huán)境中自由基廣泛存在，且化學(xué)性質(zhì)活潑、極易得失電子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，參與各種生物和化學(xué)反應(yīng)[1-6]。大量研究表明，自由基反應(yīng)在天然環(huán)境介質(zhì)中普遍存在[7-10]，也被廣泛應(yīng)用于高級(jí)氧化去除難降解污染物[11-17]。目前，對(duì)于自由基的研究，大多以自由基對(duì)污染物的降解效果為重點(diǎn)，對(duì)于自由基降解污染物的降解機(jī)制缺乏深入研究。其中一個(gè)主要的原因是環(huán)境介質(zhì)中有效檢測(cè)自由基的難度極大。環(huán)境中自由基的壽命極短（如·OH 壽命大約僅為10-9s[18]），在天然水體中的濃度極低（如天然水體表層·OH 穩(wěn)態(tài)濃度一般為10-17～10-15mol/L[19]），因此，環(huán)境中自由基的檢測(cè)分析一直是環(huán)境領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。筆者綜述了目前典型自由基檢測(cè)方法的技術(shù)原理及其應(yīng)用現(xiàn)狀，并從適用于環(huán)境水體自由基檢測(cè)的研究角度出發(fā)，分析各檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，并展望了天然水體中自由基檢測(cè)技術(shù)研究新方向，旨在為進(jìn)一步揭示環(huán)境污染物降解轉(zhuǎn)化機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 技術(shù)現(xiàn)狀

自由基在各種環(huán)境介質(zhì)中普遍存在，種類(lèi)繁多，其中活性氧自由基因?yàn)閺?qiáng)大的氧化能力受到最多關(guān)注，它主要包括等。很多研究也嘗試?yán)貌煌姆椒ㄈz測(cè)這些自由基，如電子自旋共振法(electron spin resonance，ESR)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence，CL）和氣相色譜法(gas chromatography，GC)等。近年來(lái)，由于能夠根據(jù)精確的質(zhì)量數(shù)和特定的結(jié)構(gòu)信息，特異、靈敏檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)，質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）也被應(yīng)用到自由基檢測(cè)中來(lái)。

由于自由基的反應(yīng)活性高，幾乎無(wú)法直接檢測(cè)。所以，目前的檢測(cè)方法都是間接方法，主要分為2 類(lèi)。一類(lèi)是化學(xué)反應(yīng)法，其主要基于自由基降解轉(zhuǎn)化特定化合物，結(jié)合HPLC、CE、分光光度法、CL 等技術(shù)檢測(cè)降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類(lèi)和含量水平，從而識(shí)別并間接定量自由基的濃度。如研究·OH 將水楊酸氧化成2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸，通過(guò)水楊酸的添加量和HPLC 法測(cè)定2 種氧化產(chǎn)物的量，間接計(jì)算·OH 濃度[20-21]。該類(lèi)方法主要適用于高級(jí)氧化等產(chǎn)生高濃度自由基體系，一般需預(yù)先已知或判斷自由基種類(lèi)，并選擇該自由基能夠降解轉(zhuǎn)化的特定化合物。另一類(lèi)是捕獲法，利用自旋捕獲劑間接延長(zhǎng)自由基壽命，形成的自旋加合物進(jìn)一步利用ESR 等技術(shù)檢測(cè)。ESR 是目前檢測(cè)和分析自由基應(yīng)用最廣泛的方法，且根據(jù)檢測(cè)原理能夠同時(shí)檢測(cè)幾種自由基，但由于其波譜信息容易受樣品基質(zhì)干擾、特異性不強(qiáng)，很難特異、靈敏地檢測(cè)實(shí)際環(huán)境水樣中的自由基。相較之下，質(zhì)譜技術(shù)根據(jù)精確的質(zhì)量數(shù)和特定的結(jié)構(gòu)信息能夠特異選擇自旋加合物，可以很大程度上減少環(huán)境基質(zhì)的影響；而且既可以檢測(cè)目標(biāo)自由基加合物，還可能篩查出非目標(biāo)自由基加合物。但是無(wú)論是ESR 還是質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，都是基于合適的自由基捕獲劑實(shí)現(xiàn)的，因此，尋找或研發(fā)合適的捕獲劑是該類(lèi)方法應(yīng)用的關(guān)鍵。

2 自由基檢測(cè)技術(shù)

2.1 分光光度法

分光光度法是一種應(yīng)用廣泛的光化學(xué)分析方法，其主要利用·OH 等自由基的強(qiáng)氧化性，改變底物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和顏色，從而可以改變待測(cè)液的光譜吸收，利用底物吸光度的改變間接測(cè)定自由基的濃度。目前，該方法大多應(yīng)用于·OH 的檢測(cè)研究中，常用的底物主要包括堅(jiān)牢藍(lán)BB 鹽[22]、亞甲藍(lán)(MB)[23]、水楊酸[24]、甲基紫[25]、鄰二氮菲-Fe2+[26-27]、二甲基亞砜（DMSO）[28]等。Zhao 等[22]以堅(jiān)牢藍(lán)BB 鹽為底物利用分光光度法測(cè)定Fenton 體系·OH 的濃度。顏軍等[24]基于水楊酸與·OH 反應(yīng)生成的2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸在波長(zhǎng)510 nm 處有最大光譜吸收的原理，建立了一種檢測(cè)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 的分光光度法。王金剛等[23]根據(jù)亞甲藍(lán)可被·OH 氧化褪色的原理，研究了Fenton 試劑與亞甲藍(lán)的作用并證實(shí)體系中起作用的是·OH，從而建立了亞甲藍(lán)分光光度法測(cè)定·OH 濃度的方法。分光光度法所需儀器廉價(jià)、分析速度快、操作方便，因而應(yīng)用比較廣泛。但是該方法靈敏度較低，很難滿足天然水體中檢測(cè)自由基的要求，如·OH 的分光光度法檢出限通常在μmol/L 水平，而天然水體表層·OH 穩(wěn)態(tài)濃度一般為10-17～10-15mol/L；測(cè)定過(guò)程中的干擾因素也較多，如環(huán)境水體本底顏色可能會(huì)造成光譜吸收，從而對(duì)測(cè)定的準(zhǔn)確性和靈敏度造成影響，在實(shí)際環(huán)境水體自由基痕量分析過(guò)程中難以應(yīng)用。

2.2 化學(xué)發(fā)光法

CL 是利用發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度對(duì)待測(cè)試樣進(jìn)行定量和定性的分析方法。通過(guò)利用·OH 等活性氧自由基氧化發(fā)光試劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，依據(jù)待測(cè)自由基的濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理測(cè)定自由基。與分光光度法相比，CL 的靈敏度明顯提高，其檢測(cè)限一般能達(dá)到1×10-9mol/L。目前，常用的發(fā)光試劑主要有魯米諾(氨基苯二酰一肼)[29]、酵母[30]和鄰苯二甲酰肼[31]等。徐向榮等[32]以酵母為發(fā)光底物，利用·OH 攻擊酵母從酵母壁中獲取電子產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，建立了測(cè)定Fenton 反應(yīng)中產(chǎn)生的·OH 的化學(xué)發(fā)光法，并確定了最佳反應(yīng)物濃度使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，該方法已用于模擬染料廢水處理中·OH 的測(cè)定。孫濤等[33]檢測(cè)了由亞鐵離子催化的Fenton 體系產(chǎn)生的在堿性條件下以魯米諾為發(fā)光試劑，利用氧化魯米諾產(chǎn)生的電子激發(fā)態(tài)二價(jià)陰離子氨基肽酸鹽在返回基態(tài)時(shí)發(fā)出的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，測(cè)定體系中的濃度。Christopher 等[31]利用鄰苯二甲酰肼羥基化產(chǎn)物5-羥基-2,3-二氫-1,4-鄰苯二氮二酮在堿性條件下氧化時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的特性，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法對(duì)日光照射下天然水體中產(chǎn)生的·OH 進(jìn)行簡(jiǎn)單的定量，其檢測(cè)限為7.4 nmol/L。盡管CL 比分光光度法檢測(cè)自由基靈敏度有明顯提高，但是由于可選擇的發(fā)光試劑少，且專(zhuān)一性不足，使得該方法檢測(cè)·OH 等自由基的特異性不強(qiáng)。如魯米諾在堿性條件下既可與·OH 反應(yīng)引起化學(xué)發(fā)光，也可以與過(guò)氧化氫[34]和超氧化物[35]反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，這就導(dǎo)致了測(cè)定選擇性差的問(wèn)題。而在實(shí)際環(huán)境樣品分析過(guò)程中環(huán)境基質(zhì)成分也可能與發(fā)光試劑反應(yīng)增加化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，影響測(cè)定結(jié)果，如地表天然水中可能存在高錳酸鉀、過(guò)氧化氫等具有強(qiáng)氧化性的化合物，可在Cu2+、Fe2+等過(guò)渡金屬離子或者金屬絡(luò)合物的催化下氧化魯米諾并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[36]。另外，從檢測(cè)原理上來(lái)講，以發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度對(duì)自由基進(jìn)行間接定量，對(duì)濃度差別不大的樣品很難進(jìn)行準(zhǔn)確定量，精密度較差。因此，對(duì)于天然水體中自由基的檢測(cè)，CL只能作為自由基定量或者定性分析的輔助手段。

2.3 高效液相色譜法

HPLC 是利用液體流動(dòng)相將不同分析組分帶入色譜柱，經(jīng)分離進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)的方法。在應(yīng)用HPLC 過(guò)程中，首先要確定合適的探針化合物，該化合物能與·OH 等自由基發(fā)生特異性反應(yīng)，生成穩(wěn)定產(chǎn)物；該產(chǎn)物進(jìn)一步被分離后，根據(jù)探針化合物及其產(chǎn)物特性，利用紫外、熒光、電化學(xué)等檢測(cè)器進(jìn)行定量分析；最后根據(jù)自由基與探針化合物/產(chǎn)物的反應(yīng)關(guān)系間接計(jì)算自由基濃度或反應(yīng)貢獻(xiàn)。目前，常用探針化合物有水楊酸[37]、4-氯苯甲酸[38]、DMSO[39-40]、糠醇[41]、苯酚[42]等。在研究地表水中1O2穩(wěn)態(tài)濃度過(guò)程中，Braun 等[43-44]利用對(duì)1O2具有高度反應(yīng)性、特異性的糠醇與1O2反應(yīng)，生成莫洛松，但由于莫洛松在水中不穩(wěn)定，易迅速水解為其他產(chǎn)物，所以只能根據(jù)糠醇損失量間接計(jì)算1O2的穩(wěn)態(tài)濃度。Tai 等[39]利用DMSO 捕獲天然水在陽(yáng)光照射下產(chǎn)生的·OH，產(chǎn)物甲醛經(jīng)乙酰丙酮和銨鹽衍生為3,5-二乙酰-1,4-二氫-2,6-二甲基吡啶，并用高效液相色譜熒光檢測(cè)器分析，研究了甲醛衍生化反應(yīng)和·OH 自由基捕集反應(yīng)的影響因素，以及該方法在日光照射下測(cè)定典型地表水中·OH 的適用性，該方法對(duì)·OH 的檢測(cè)限為0.067 μmol/L。Vaughan 等[45]利用·OH 與DMSO反應(yīng)產(chǎn)生·CH3，然后與氨基氮氧化物生成穩(wěn)定的鄰甲基羥胺，經(jīng)氟胺衍生后，最后通過(guò)反相HPLC 分離鄰甲基羥胺，并間接定量·OH 濃度。HPLC 一般具有很高的靈敏度，尤其是對(duì)活性氧自由基的檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)1×10-9～1×10-11g。但在利用探針化合物被氧化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然水中光化學(xué)產(chǎn)生的·OH 等自由基濃度的測(cè)定時(shí)，存在一些缺點(diǎn)：1）天然水中的光活性物質(zhì)與探針化合物本身或羥基化產(chǎn)物（如苯酚[46]、醌[47]和水楊酸[48]）之間的光競(jìng)爭(zhēng)吸收，這些物質(zhì)在紫外線A（320～400 nm)或紫外線B（280～320 nm）波段具有強(qiáng)吸收性；2）羥基化產(chǎn)物[49]的進(jìn)一步光降解或羥基化產(chǎn)物與·OH 等自由基之間在長(zhǎng)期輻照試驗(yàn)中發(fā)生反應(yīng)[50-51]，這將低估·OH 濃度；3）探針化合物和過(guò)渡金屬離子之間形成的絡(luò)合物會(huì)影響光芬頓或類(lèi)光芬頓反應(yīng)中·OH 等自由基的產(chǎn)生[52]。所以，HPLC 在檢測(cè)天然水體中自由基的過(guò)程中干擾因素多、受環(huán)境基質(zhì)影響大、合適的探針化合物少、檢測(cè)效率低，并不能獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果，相比之下，靈敏度高、特異性強(qiáng)的質(zhì)譜技術(shù)可能具有更好的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

2.4 毛細(xì)管電泳法

CE 是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。與HPLC 法相比，CE 以微量（進(jìn)樣所需的樣品體積為nL 級(jí)）、高效和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)在化學(xué)、生物、環(huán)境等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。對(duì)于自由基的測(cè)定，CE 常與電化學(xué)檢測(cè)結(jié)合進(jìn)一步提高靈敏度。Coolen 等[53]通過(guò)CE 紫外檢測(cè)法，在200 nm 紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)水楊酸與·OH 反應(yīng)產(chǎn)物，間接測(cè)定·OH 濃度，檢測(cè)限可達(dá)2×10-7mol/L。而Wang 等[54]采用CE 安培檢測(cè)法間接測(cè)定游離·OH 濃度，通過(guò)向系統(tǒng)中加入與·OH 反應(yīng)的水楊酸產(chǎn)生具有電活性的2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸，從而經(jīng)安培計(jì)檢測(cè)。在最佳條件下，水楊酸、2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸能在15 min 內(nèi)完全分離，且檢出限低至2×10-8mol/L。程宏英等[55]以對(duì)羥基苯甲酸為自由基捕捉劑，經(jīng)CE 安培檢測(cè)法檢測(cè)，對(duì)單一目標(biāo)產(chǎn)物3,4-二羥基苯甲酸峰進(jìn)行計(jì)算，測(cè)定了硫酸銅-維生素C 反應(yīng)體系（pH 為7.4）中生成的·OH 濃度。CE 法分析速度快，分離效率高，且在直接分離檢測(cè)自由基時(shí)由于毛細(xì)管內(nèi)部是一個(gè)封閉的體系，可以隔絕外界的O2等自由基淬滅劑，利于自由基穩(wěn)定存在和檢測(cè)。但由于天然水環(huán)境樣品中的自由基濃度水平極低，且基體十分復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，所以可能存在其他具有電化學(xué)活性的化合物干擾電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的測(cè)定[56]。另外，探針化合物與自由基反應(yīng)產(chǎn)物并非全部具有電化學(xué)活性，那么常用的CE-電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)在自由基檢測(cè)范圍上將大大縮小，不利于某些未知自由基的鑒別。

2.5 電子自旋共振法

與前述方法利用自由基氧化還原探針化合物不同，ESR 是基于自由基不配對(duì)電子自旋產(chǎn)生磁矩的一種磁共振技術(shù)。因此可以選擇合適的化合物與自由基的不配對(duì)電子相互作用，改變自由基電子自旋性質(zhì)，即抗磁性的自由基捕獲劑（在ESR 中沒(méi)有電子順磁共振信號(hào)），通過(guò)生成順磁性自旋加合物（在ESR中會(huì)產(chǎn)生電子順磁共振信號(hào)）增強(qiáng)自由基的環(huán)境穩(wěn)定性或持久性。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)ESR 圖譜的線寬、線型、超精細(xì)耦合、g 因子等波譜參數(shù)的解析，根據(jù)特征峰識(shí)別自由基的類(lèi)型，基于曲線積分面積確定自由基的濃度。目前，氮氧化物是常用的抗磁性自旋捕獲劑，主要分為亞硝基類(lèi)和硝酮類(lèi)（表1）。其中二甲基吡啶氮氧化物（DMPO）是目前最常用的自旋捕獲劑之一，捕獲速度相對(duì)較快，針對(duì)不同自由基其自旋加合物的ESR 參數(shù)變化較大，易于區(qū)分不同自由基，對(duì)以O(shè) 為中心的自由基捕獲效果好（尤其是·OH）。趙淑銳等[57]以DMPO 為捕獲劑，利用ESR檢測(cè)Fe2+與H2O2構(gòu)建的Fenton 反應(yīng)體系中·OH，從ESR 譜圖中（圖1）可直接觀察到·OH 的特征波譜。Feng 等[58]在過(guò)一硫酸鹽與羥胺氧化體系中以DMPO 為捕獲劑在ESR 上觀察到的特征波譜。Cashman 等[59]在研究過(guò)硫酸鹽氧化處理1,4-二噁烷等污染物過(guò)程中的自由基時(shí)，通過(guò)研究DMPO自旋加合物在ESR 上的特征波譜確定·OH 的存在。盡管在實(shí)驗(yàn)室模擬高級(jí)氧化體系中ESR 能夠顯示明顯的自旋加合物特征波譜，但是對(duì)復(fù)雜體系中自由基的檢測(cè)（如在實(shí)際水樣中共存多種自由基并有大量環(huán)境基質(zhì)干擾），往往看不到清晰的特征波譜。孫霞[60]在研究腐殖酸-銅絡(luò)合物降解阿特拉津過(guò)程中，利用DMPO 捕獲和ESR 波譜信息檢測(cè)自由基，但是由于腐殖酸基質(zhì)的干擾，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的自由基特征波譜（圖2），從而未能鑒定體系中的自由基。Zhou 等[61]在研究黃鐵礦活化過(guò)一硫酸鹽降解鄰苯二甲酸二乙酯過(guò)程中，擬利用ESR 證明·OH 的變化過(guò)程，但是由于不同自由基加合物波譜混合疊加和樣品基質(zhì)背景波譜的掩蓋和干擾，無(wú)法清晰觀測(cè)到波譜信號(hào)，從而不能根據(jù)ESR 結(jié)果分析它們之間的變化關(guān)系。另外，DMPO 捕獲自由基形成的自旋加合物還可能進(jìn)一步反應(yīng)，如DMPO捕獲生成的自旋加合物（DMPO-·OOH）會(huì)進(jìn)一步衰變生成DMPO-·OH，它同時(shí)也是DMPO 捕獲·OH生成的自旋加合物。也就是說(shuō)當(dāng)反應(yīng)體系中同時(shí)存在和·OH 時(shí)，二者會(huì)與DMPO 通過(guò)不同的反應(yīng)途徑生成DMPO-·OH，不能清晰揭示反應(yīng)過(guò)程和機(jī)理[62]。因此，對(duì)于的ESR 分析，DMPO 并不是合適的捕獲劑。相比之下，α-苯基-N-叔丁基氮氧化物（PBN）與形成的自旋加合物穩(wěn)定性顯著提高，但是該自旋加合物在ESR 上的特征波譜不明顯。除了DMPO 和PBN 之外，α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮（4-POBN）、四甲基哌啶酮氧化物（TMPO）、5-(乙氧羰基)-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（EMPO）、2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）、2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）等自旋捕獲劑也被用做自由基捕獲劑進(jìn)行ESR 分析。如Janzen 等[63]在研究DMPO、PBN 和4-POBN 3 種不同捕獲劑對(duì)·OH 捕獲效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，4-POBN 僅適用于檢測(cè)pH 為6～7 溶液中的·OH；Hideg 等[64]分別利用DMPO、TEMP 捕獲光照類(lèi)囊體過(guò)程中產(chǎn)生的1O2等自由基，并經(jīng)ESR 檢測(cè)對(duì)應(yīng)的自旋加合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TEMP 僅對(duì)1O2具有良好捕獲效率，且其加合物（TEMPO）穩(wěn)定，而對(duì)其他自由基捕獲效率低。所以，并非所有捕獲劑都具有普適性，對(duì)于不同的自由基捕獲劑其適用范圍也略有差異，在使用前應(yīng)充分考慮這些問(wèn)題。

圖1 芬頓反應(yīng)體系中·OH 的ESR 譜圖[57]Fig.1 ESR spectrum of ·OH in Fenton reaction system[57]

圖2 Cu（Ⅱ）溶液和腐殖酸-Cu（Ⅱ）絡(luò)合物溶液在光照0 和120 s 時(shí)的ESR 譜圖[60]Fig.2 ESR spectrum of Cu (Ⅱ) solution and humic acid-Cu (Ⅱ) complex solution under illumination for 0 and 120 s[60]

表1 用于ESR 分析的自由基捕獲劑Table 1 Free radical trapping agents for ESR analysis

2.6 質(zhì)譜法

MS 根據(jù)精確的質(zhì)量數(shù)和特定的結(jié)構(gòu)信息特異識(shí)別自由基自旋加合物，因而能特異識(shí)別目標(biāo)自由基。Podmore 等[76]利用MALDI-TOF-MS 檢測(cè)Fenton反應(yīng)中POBN 與·OH、·CH3形成的自旋加合物，通過(guò)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)碎片等信息明確識(shí)別·OH、·CH3。同時(shí)，ESR 雖然可以根據(jù)與自由基結(jié)構(gòu)相關(guān)的一系列常數(shù)（如g 因子和超精細(xì)耦合常數(shù)等）對(duì)自由基進(jìn)行簡(jiǎn)單的種類(lèi)劃分，但超精細(xì)耦合常數(shù)提供的結(jié)構(gòu)信息有限，難以區(qū)分多種自由基，而且在多種自由基共存時(shí)，它們的波譜相互疊加、干擾，導(dǎo)致ESR 譜圖較為復(fù)雜難以解析[77]。與ESR 檢測(cè)技術(shù)相比，MS利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)獲得的精確分子質(zhì)量區(qū)分捕獲劑與不同自由基形成的自由基加合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種自由基的同時(shí)檢測(cè)和分析[78]。Guo 等[79-80]在研究有機(jī)過(guò)氧化物與血紅蛋白或Fe2+反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的·OH、過(guò)氧基、烷氧基和烷基等自由基時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用ESR難以檢測(cè)區(qū)分多種自由基，而利用ESI-MS 和MS/MS 檢測(cè)體系中自由基，通過(guò)其質(zhì)譜圖便可清晰、明確地鑒別DMPO 與·OH（圖3）、過(guò)氧基、烷氧基和烷基等自由基形成的自旋加合物。此外，MS 不僅可以檢測(cè)目標(biāo)自由基，還可根據(jù)自旋加合物在質(zhì)譜中裂解時(shí)特定的中性丟失等詳盡的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)一步檢測(cè)能與捕獲劑結(jié)合的非目標(biāo)自由基[81]。Domingues 等[82]在雙氧水處理氨基酸、甘油磷酸膽堿、棕櫚酸等物質(zhì)過(guò)程中，利用DMPO 捕獲生成的新自由基后直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而確認(rèn)了多種自由基的結(jié)構(gòu)。但是在鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，僅利用質(zhì)譜質(zhì)核比差異區(qū)分不同自旋加合物，仍然存在很大的干擾，對(duì)于這種現(xiàn)象，可通過(guò)色譜分離等技術(shù)進(jìn)行改善。Jurva 等[83]在質(zhì)譜檢測(cè)之前利用HPLC 對(duì)復(fù)雜混合物進(jìn)行有效分離，降低背景干擾，通過(guò)對(duì)MS/MS 檢測(cè)后得到的清晰譜圖進(jìn)行解析，在觀察到DMPO-OH 加合物的同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了羥甲基、羥乙基等二次自由基與DMPO的加合物。Wang 等[84]使用PBN 捕獲煙氣中的自由基并利用超高效合相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPC2/Q-TOF-MS）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)、分析，根據(jù)PBN自由基捕捉機(jī)理鑒別出卷煙主流煙氣中存在的·C4H5O、·C5H5O、·C5H7O 等14 種自由基的分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，MS 在檢測(cè)環(huán)境中自由基方面具有天然的優(yōu)勢(shì)。但是值得注意的是，捕獲劑是決定其檢測(cè)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的捕獲劑有DMPO、POBN、TMPO、TEMP、PBN、CDI 等，其中DMPO、POBN、TMPO 對(duì)以氧為中心的自由基具有良好的捕獲效果，TEMP 對(duì)1O2具有良好捕獲效果，PBN 易與C 或O 為中心的自由基形成相對(duì)穩(wěn)定的自旋加合物，而CDI 對(duì)以C 為中心自由基、亞硫酸鹽自由基有良好捕獲效果。另外，理想的捕獲劑與自由基應(yīng)該形成單一的加合物，具有足夠的環(huán)境持久性、穩(wěn)定的母離子/特征離子且質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)高。Domingues 等[85]在利用FAB-MS 對(duì)DMPO與·OH 自旋加合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)和鑒定過(guò)程中除了發(fā) 現(xiàn) [{DMPO+O}+H]+，還發(fā)現(xiàn) [2DMPO+3H]+、[{2DMPO-O}+H]+、[{2DMPO+2O-2H}+H]+等多聚體及多聚體加合物，對(duì)·OH 的相對(duì)定量產(chǎn)生干擾。DMPO 在與·OH 形成自旋加合物的同時(shí)還會(huì)與形成DMPO-·OOH，該加合物會(huì)進(jìn)一步衰變生成DMPO-·OH，干擾·OH 的定量。而PBN 與·OH 加合物雖然在ESR 上波譜信息不明顯，但在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中可清晰觀察到高靈敏的單一加合物PBN-·OH。另外與DMPO 相比，PBN 對(duì)以C 為中心的自由基具有良好的捕獲效果。Imaram 等[86]利用PBN 捕獲過(guò)氧亞硝酸鹽和尿素反應(yīng)過(guò)程中生成以C 為中心的自由基，依據(jù)LC-MS 質(zhì)譜圖鑒別出·CH2NO 和·C4H5N4O4。此外，捕獲劑與自由基形成的加合物在質(zhì)譜中形成的特征碎片離子（來(lái)源于捕獲劑）有助于可疑篩查和非靶向鑒定其他自由基。

圖3 Fe2+與異丙苯過(guò)氧化氫反應(yīng)中DMPO-·OH 的ESI-MS 譜圖和MS/MS 譜圖[79]Fig.3 ESI-MS and MS/MS spectra of DMPO-·OH in the reaction of Fe2+ with cumene hydroperoxide[79]

2.7 其他方法

除了分光光度法、CL、HPLC、CE、ESR、MS 等常用自由基檢測(cè)方法（表2）外，還有一些分析技術(shù)也被用于自由基的檢測(cè)，如淬滅法、氣相色譜法等。其中淬滅法，即通過(guò)投加一定量的淬滅劑去除體系內(nèi)目標(biāo)自由基，根據(jù)對(duì)體系的影響評(píng)估某一種自由基的存在及貢獻(xiàn)。通常影響程度越大，表明目標(biāo)自由基存在且越重要。目前，常見(jiàn)的淬滅劑有乙醇[87]、甲醇[88]、異丙醇[89]、苯醌[90]和叔丁醇[87]等（表3），其中叔丁醇淬滅·OH 的能力較強(qiáng)，而異丙醇、乙醇、甲醇可同時(shí)淬滅和·OH[91]。所以，當(dāng)系統(tǒng)中同時(shí)存在幾種自由基時(shí)，要注意淬滅劑的選擇性，考慮所選淬滅劑與多種自由基的相互作用，避免產(chǎn)生誤判[90-92]。同時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中也要注意淬滅劑的濃度以保證淬滅所有目標(biāo)自由基，且對(duì)降解系統(tǒng)沒(méi)有顯著的干擾。淬滅法作為自由基檢測(cè)的初步判斷方法，該方法操作簡(jiǎn)單，常用于高級(jí)氧化降解有機(jī)污染物過(guò)程中主要自由基的初步鑒定，但準(zhǔn)確性差，無(wú)法對(duì)其他未知自由基進(jìn)行有效檢測(cè)。若想獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果，還需利用ESR、HPLC、MS 等其他方法進(jìn)一步檢測(cè)、分析。

表2 常用自由基檢測(cè)方法對(duì)比Table 2 Comparison of common free radicals detection methods

表3 淬滅劑及其目標(biāo)自由基Table 3 Quenchers and their target free radicals

氣相色譜法（GC）是通過(guò)載氣（流動(dòng)相）將自由基與捕獲劑的加合物帶入色譜柱進(jìn)行分離經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定加合物峰面積來(lái)間接測(cè)定對(duì)應(yīng)自由基濃度的一種方法。目前在自由基的檢測(cè)中，GC 主要用于測(cè)定·OH 濃度。Manzoor 等[93]利用自旋捕獲劑PBN 捕獲通過(guò)Fenton 反應(yīng)生成的·OH，并對(duì)反應(yīng)瓶頂部空間中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物通過(guò)熱解吸進(jìn)行收集，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析。該方法可在幾分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)完成對(duì)揮發(fā)性的自由基加合物的檢測(cè)、識(shí)別，但對(duì)于揮發(fā)性較差的自旋加合物并不適用。Mistry 等[94]將·OH 與DMSO 反應(yīng)轉(zhuǎn)化為甲基，經(jīng)自旋捕獲劑POBN 捕獲生成一種新的二甲基產(chǎn)物（POBNMe2），通過(guò)氣相色譜鑒定該產(chǎn)物，從而間接測(cè)定·OH，該方法操作繁瑣，靈敏度和重復(fù)性較差。

3 結(jié)論與展望

（1）由于自由基的高活性、低濃度以及短壽命的特性，幾乎無(wú)法對(duì)其進(jìn)行直接檢測(cè)。目前采用的間接檢測(cè)方法主要分為化學(xué)反應(yīng)法和捕獲法。其中，化學(xué)反應(yīng)法包括分光光度法、CL、HPLC、CE、GC等；捕獲法包括ESR、MS 等。

（2）在天然水體的自由基研究中，ESR、HPLC、CE、CL、分光光度法等方法并不能消除環(huán)境基質(zhì)的干擾同時(shí)檢測(cè)多種自由基，而自旋捕獲結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)以高靈敏性、高特異性的技術(shù)優(yōu)勢(shì)為天然水體中的自由基提供了新的檢測(cè)和識(shí)別手段。選擇或研發(fā)具有捕獲效率高、加合物單一且穩(wěn)定性好、質(zhì)譜中母離子/特征離子穩(wěn)定且響應(yīng)高、易于保存等特點(diǎn)的高性能捕獲劑是該方法應(yīng)用的關(guān)鍵。