硫芥與活性硫醇化合物加合特性的分析研究

關(guān)鍵詞硫芥；加合物；谷胱甘肽；半胱氨酸；N-乙酰半胱氨酸

硫芥是指一類具有高反應(yīng)活性的糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑，其中芥子氣（HD）素有“毒劑之王”之稱，屬于經(jīng)典的糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑，多次在戰(zhàn)爭和恐怖襲擊事件中使用[1-2]。HD 具有高反應(yīng)活性、強(qiáng)糜爛性和多靶點(diǎn)共損傷等特性，可通過皮膚、眼睛和呼吸道等多種途徑侵入人體[3-4]，誘發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、多器官中毒損傷及基因毒性等[5-6]。然而， HD 中毒機(jī)理至今尚未完全明確，但一般認(rèn)為是由于其形成的高度親電中間體環(huán)硫鎓離子可與人體內(nèi)的DNA、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-cysteine， NAC）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）和谷胱甘肽（Glutathione， GSH）等多種活性成分形成加合物所致[7]。

GSH、Cys 和NAC 等是體內(nèi)具有較高反應(yīng)活性的硫醇類解毒分子，也是防御外源性烷化劑損傷的重要屏障。此外， GSH 還是細(xì)胞中重要的抗氧化劑，能清除體內(nèi)的自由基，具有抵御細(xì)胞毒性的作用。研究表明，經(jīng)HD 的常用模擬劑2-氯乙基乙基硫醚（CEES）暴露后，在生物體內(nèi)尤其是腦組織中檢測到CEES-GSH、CEES-Cys 和CEES-NAC 等系列加合物，并且駐留時(shí)間可達(dá)14 d 以上，表明CEES 經(jīng)皮膚暴露后會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)損傷[8-9]。

化學(xué)武器公約（Chemical Weapons Convention， CWC）附表1.A.04[10]中涵蓋了9 種糜爛性毒劑（統(tǒng)稱為硫芥），除了經(jīng)典的HD 外，還有8 種結(jié)構(gòu)類似物（表1），其粗品不需要進(jìn)一步純化即可作為毒劑使用。研究表明，含有1～5 個(gè)亞甲基的硫芥可能具有更強(qiáng)的糜爛性，如1， 2-二（2-氯乙硫基）乙基（Q）和二（2-氯乙基乙基）醚（T）的糜爛性分別約為HD 的5.0 倍和3.5 倍[11]，大鼠口服Q 和T 半數(shù)致死劑量（Median lethaldose， LD50）后，采用定量構(gòu)效關(guān)系（Quantitative structure-activity relationship， QSAR）模型計(jì)算得其糜爛性分別是HD 的21 和19 倍[12]；或是與HD 混合使用以增加殺傷力，如芥子氣與乙基倍半芥子氣混合物（HQ）、芥子氣與乙基氧聯(lián)芥子氣混合物（HT）等混合型戰(zhàn)劑比HD 的糜爛性更強(qiáng)[11]。除此之外， HD 在儲(chǔ)存或暴露于自然環(huán)境中，會(huì)自發(fā)降解為HD 類似物。如一戰(zhàn)和二戰(zhàn)時(shí)期的HD 化學(xué)彈藥被大量傾棄于海底或深埋于地下后，隨著時(shí)間的推移， HD 在外界環(huán)境的作用下逐漸轉(zhuǎn)化為Q 和T 等，對(duì)海洋環(huán)境、地下水、掩埋土壤和周邊居民都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[13]。然而，目前相關(guān)的研究主要針對(duì)HD，其類似物的毒性數(shù)據(jù)亟需填補(bǔ)和進(jìn)一步完善。

本研究基于微量定向拼接合成策略，制備了8 種硫芥實(shí)體參考品，并采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/HRMS）和高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）方法有效地評(píng)價(jià)了系列硫芥與不同活性硫醇體外加合特性，發(fā)現(xiàn)不同硫芥與GSH 和Cys 的反應(yīng)速率高于NAC，并且在不同基質(zhì)中各類加合物的種類及豐度均存在顯著差異。本研究結(jié)果為硫芥化合物的暴露診斷、毒理學(xué)分析以及醫(yī)學(xué)救援等提供了重要依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DionexUltiMate 3000 型液相色譜儀和QExactive 型質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Q-TRAP 5500 型三重四極桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；Mili-Q A10 型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；RVC 2-33 離心濃縮儀（德國Christ 公司）；恒溫振蕩水?。ㄈ鹗縂ingKo 公司）；3k30 高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma-Aldrich 公司）；DL203 精密電子天平（瑞士Mettler 公司）。

HD（純度gt;96%，中國人民解放軍防化指揮工程學(xué)院提供）；GSH、Cys、NAC 和甲酸（分析純，美國Acros Organics 公司）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；多聚甲醛、氯磺酸、2-巰基乙醇、1，2-二溴甲烷、1，2-二溴丁烷、1，2-二溴戊烷、二氯乙醚、二氯丙醚、3，6-二硫雜-1，8-辛二醇、3，7-二硫雜-1，9-壬二醇、磷酸鹽緩沖液干粉（PBS）、HCl、NaOH 及其它試劑（分析純，國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司）。人源血漿（中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心提供，并經(jīng)相關(guān)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)）；人源細(xì)胞系人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT 細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 系列硫芥實(shí)體制備與結(jié)構(gòu)表征

參照文獻(xiàn)[14]的方法，采用定向拼接策略制備表1 中除HD以外的8 種硫芥類似物。采用GC-MS、1H NMR 和13C NMR 對(duì)其結(jié)構(gòu)和純度進(jìn)行表征鑒定，結(jié)果表明，制備的系列硫芥實(shí)體化合物的純度gt;95%，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，相關(guān)的表征數(shù)據(jù)見電子版文后支持信息。

1.2.2 硫芥與不同活性硫醇形成加合物的鑒定

稱取適量的GSH、Cys 或NAC 分別溶于PBS 溶液（0.01 mol/L， pH = 7.4）中，配制成2 mg/L 的溶液。分別取1 mL GSH（Cys 或NAC）溶液置于9 個(gè)1.5 mL 塑料離心試管中，加入20 μL 硫芥（50 mg/mL，溶劑為乙腈），混勻，調(diào)節(jié)溶液pH=8～9，在37 ℃條件下水浴孵育過夜。將孵育溶液稀釋至合適濃度后，進(jìn)行UPLC-MS/HRMS 檢測。

1.2.3 血漿染毒實(shí)驗(yàn)

將濃度為1 mg/mL 的9 種硫芥（50 μL）分別加入到含150 μL 血漿的1.5 mL 離心管中，隨后加入200 μL 乙腈-甲醇（4∶1， V/V）溶液，渦旋30 s，于4 ℃以14000 r/min 離心10 min，取上清液，于50 ℃離心濃縮至干，加入100 μL 5%（V/V）乙腈溶液復(fù)溶，靜置10 min 后渦旋30 s， 以14000 r/min 離心5 min， 移取上清液進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為5 μL。

1.2.4 細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至2.5×105 cell/mL，按每孔2 mL 鋪6 孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃， 5% CO2）中培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，向細(xì)胞中分別加入含100 mmoL/L HD（溶劑為二甲基亞砜）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用PBS 溶液收集完成染毒的細(xì)胞， 14000 r/min 離心5 min， 棄上清液。取10 μL 收集到的細(xì)胞，加入20 μL PBS 溶液使細(xì)胞重懸，在液氮和37 ℃水浴中快速凍融2 次，于4℃以14000 r/min 離心5 min，收集上清液（細(xì)胞提取液）。將20 μL 乙腈-甲醇（3∶1， V/V）溶液與10 μL 細(xì)胞提取液渦旋混勻，以14000 r/min 離心5 min，沉淀蛋白。將上清液用PBS 溶液適當(dāng)稀釋，使最終體積為100 μL，待測，進(jìn)樣體積為10 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 UPLC-MS/HRMS 條件

液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）進(jìn)行樣品分離，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A 為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動(dòng)相B 為甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min， 1% B;1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。進(jìn)樣體積：2 μL。

質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓3.2 kV，離子傳輸溫度320 ℃，霧化溫度320 ℃，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，掃描模式為全掃描-自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描（Full MS/dd-MS2），一級(jí)分辨率為35000 FWHM，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17500 FWHM，掃描范圍為m/z 50～1000 Da，常態(tài)化碰撞能量（NCE）為20 和35 eV。

1.3.2 HPLC-MS/MS 條件

液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）進(jìn)行樣品分離，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相A 為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動(dòng)相B 為甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，1% B；1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。進(jìn)樣體積：5 μL 或10 μL，流速為0.25 mL/min。

質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源溫度：550 ℃；電離模式：ESI 正離子源；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiplereaction monitoring， MRM）；氣簾氣（Curtain gas， CUR）：20 psi（1 psi=6.895 kPa）；離子化電壓（IonSprayvoltage， IS）：+5500 V；霧化氣（Gas 1）：55 psi；輔助加熱干燥氣（Gas 2）：55 psi；碰撞室出口電壓（Collision cell exit potential， CEX）：15 eV，入口電壓（Entrance potential， EP）：10 eV；去簇電壓（Declusteringpotential， DP）：70 V 或100 V；碰撞能量（Collision energy， CE）如電子版文后支持信息表S1 所示。

1.4 安全說明

9 種硫芥毒劑均為糜爛性的危險(xiǎn)劇毒物品，相關(guān)操作均由受過培訓(xùn)的人員穿戴防護(hù)設(shè)備在通風(fēng)良好的通風(fēng)櫥中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有接觸過硫芥的容器均采用10% KOH-乙醇溶液及時(shí)洗消。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫芥-硫醇加合物的質(zhì)譜解析

采用UPLC-MS/HRMS 對(duì)3 種硫醇與9 種硫芥的加合物生成情況進(jìn)行靶向篩查鑒定，結(jié)合反應(yīng)機(jī)理推測，采用全掃描質(zhì)譜篩選和特征母離子提取方式，共鑒定出24 種加合物，名稱及結(jié)構(gòu)式如表2 所示。HD、Q 和CEPR 等6 種硫芥均可在5 min 內(nèi)與GSH、Cys 和NAC 分子中的硫醇發(fā)生親電取代反應(yīng)生成加合物，并且Cys 和GSH 比NAC 生成加合物的速率更快。CECM、CEME 和CEMEE 由于自身反應(yīng)活性相對(duì)較差，孵育30 min 后才檢測到生成的相關(guān)加合物。不同硫芥與3 種硫醇分子加合速率存在差異，其原因是CECM 屬于不對(duì)稱烷化劑，其烷基氯基團(tuán)的親電能力相對(duì)較弱[15]。此外，在弱堿性條件下， Cys 比GSH 和NAC 更易發(fā)生電離，因此可與硫鎓離子更快進(jìn)行加合（pKa 分別為8.10、8.83、9.52）[16-19]。系列硫芥與GSH 形成加合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律解析（Difflt;5 ppm）見圖1，不同加合物均易在碳硫鍵、碳氧鍵或肽鍵處發(fā)生斷裂，圖1 中相同色條展示出了共有的裂解位點(diǎn)。（1）硫芥與GSH 加合物都會(huì)形成高豐度的碎片離子m/z 177.0328，為GSH 丟失1 分子谷氨酸（Glu）所致。（2）加合物中羥乙基硫代烷基硫代乙基（—CH2CH2S（CH2）nSCH2CH2OH， n=1～5）由于相差—CH2—，二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片也呈現(xiàn)一定的規(guī)律性：①GSH 脫去1 分子Glu 或Cly，形成質(zhì)量數(shù)相差14.0157 的低豐度特征碎片離子；②硫芥自身碳硫鍵斷裂形成的特異性碎片，如HO—（CH2）2—S—（CH2）n—或HO—（CH2）2—S—（CH2）n—S—（n=1～5），其中，HD、Q、T 與GSH 加合物的基峰均為m/z 105.0374（HO—（CH2）2—S—（CH2）2—）。（3）隨著硫芥碳鏈增長， 2 個(gè)碳硫鍵易同時(shí)斷裂，如CEPE 的特征碎片離子—S—（CH2）3—S—（m/z 106.9984）。（4）CECM、CEME、CEMEE 與GSH 加合物基峰碎片與其它硫芥存在顯著差異， CEME-GSH 和CEMEE-GSH 加合物中Glu 還會(huì)再丟失硫原子而形成基峰m/z 145.0608，而CEME-GSH 的基峰則為GSH 丟失Clu-NH2 所形成（m/z 162.0219）。

此外，不同硫芥與Cys 和NAC 的加合物也呈現(xiàn)出相似的裂解規(guī)律（如電子版文后支持信息圖S1 和S2 所示），其中， Cys-硫芥加合物均產(chǎn)生碎片Cys（m/z 120.0120）， NAC-硫芥加合物共有的基峰為m/z 162.0225（NAC）。因此，在進(jìn)行盲樣分析時(shí)，可通過高豐度的共有碎片離子推斷出其加合硫醇種類，再進(jìn)一步結(jié)合硫芥部分碎裂的特征碎片離子精準(zhǔn)鑒定具體硫芥化合物的種類。

2.2 染毒血漿中硫芥與硫醇加合物的鑒定

UPLC-HRMS/MS 具有精確度高和分辨率良好等優(yōu)勢，可用于硫芥與硫醇分子孵育溶液中所形成未知加合物的快速篩查與鑒定。針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中低豐度加合物的檢測，需要采用靈敏度更高且定量分析能力更強(qiáng)的HPLC-MS/MS。分別選擇特異性好和質(zhì)譜響應(yīng)高的3對(duì)離子對(duì)（見電子版文后支持信息表S1），采用HPLC-MS/MS，建立MRM 檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血漿染毒樣品孵育1 h 后，一次進(jìn)樣可同時(shí)完成6 種不同硫芥與3 種硫醇分子形成的加合物的篩查。圖2為不同硫芥與硫醇分子加合物的色譜圖，色譜出峰時(shí)間主要集中在2～6 min。提取離子色譜峰的峰面積表明，不同硫芥在血漿中與活性硫醇分子生成加合物的種類和豐度差異顯著，其中，與Cys 形成的加合物的含量明顯高于GSH 和NAC，這與前述的不同硫醇分子的反應(yīng)活性以及血漿中3 種硫醇分子的豐度一致（Cysgt;GSHgt;NAC）[20]。此外，不同硫芥自身反應(yīng)活性存在差異，導(dǎo)致檢出的加合物的種類不同，如活性較高的Q、T與3種硫醇分子（GSH、Cys和NAC）均可生成加合物；HD、CEPR 和CEBU、CEPE僅可檢測到GSH 和Cys 的加合物；活性較低的CEME 和CEMEE僅檢測到CEME-Cys加合物；活性最差的CECM無加合物檢出。

2.3 染毒細(xì)胞中硫芥-硫醇加合物的確證分析

為更準(zhǔn)確地預(yù)測硫芥與生物體內(nèi)硫醇分子之間的相互作用，探究潛在的毒理機(jī)制，考察了染毒細(xì)胞中不同硫芥與硫醇加合物的生成情況。皮膚是硫芥中毒的最主要的靶器官之一，硫芥暴露后會(huì)引起皮膚糜爛和壞死等病理變化。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 100 μmol/L 的染毒劑量不會(huì)誘導(dǎo)大量的HaCaT 細(xì)胞死亡?；诮⒌腗RM 分析方法，對(duì)染毒細(xì)胞提取液進(jìn)行篩查鑒定，結(jié)果如圖3 所示，除CECM、CEME和CEMEE 外，其余5 種硫芥均可與細(xì)胞內(nèi)的GSH 和Cys 形成加合物，并且與GSH 形成加合物的豐度顯著高于Cys，這與血漿加合物的生成情況存在顯著差異，其主要原因可能是由于細(xì)胞中GSH 含量（1～10 mmol/L）遠(yuǎn)高于Cys（3～5 μmol/L）[20]。其中， Q 與GSH 和Cys 生成加合物的含量最高，預(yù)示其可能具有更高的細(xì)胞毒性和反應(yīng)活性。此趨勢與文獻(xiàn)[21-22]中Q 與HSA 的生物標(biāo)志物鑒定工作中所提及的Q 比HD 更易與HSA 形成加合物的結(jié)果相符，其原因可能是Q 更易形成“雙硫鎓”離子過渡態(tài)，對(duì)巰基具有更強(qiáng)親和力。此外，沒有檢出9 種硫芥與NAC 形成的加合物，此結(jié)果與Roser 等[8]在細(xì)胞中未檢測到HD 及其模擬劑CEES 與NAC 加合物的結(jié)果類似，其原因可能是NAC 與硫芥類毒劑的活性較Cys和GSH 差，并且與其在細(xì)胞中含量較低有關(guān)。

3 結(jié)論

優(yōu)化了《化學(xué)武器公約》中的9 種硫芥的實(shí)體參考品微量定向合成方法，并采用UPLC-MS/HRMS 對(duì)不同硫芥與GSH、Cys 和NAC 的試管孵育反應(yīng)液進(jìn)行分析，共鑒定出24 種加合物?；赑ubmed、WebOf Science、Scopus 和Reaxys 等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，按主題、摘要和結(jié)構(gòu)式對(duì)鑒定加合物進(jìn)行查新檢索（檢索時(shí)間跨度為1999～2024 年）。結(jié)果表明，除HD 與GSH、Cys 和NAC 形成的3 種加合物已有文獻(xiàn)報(bào)道外，其它硫芥與GSH、Cys 和NAC 形成的21 種加合物均為全新結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步建立了基于HPLC-MS/MS 的MRM 分析方法，對(duì)染毒血漿樣品中不同硫芥與幾種活性硫醇的加合物進(jìn)行確證分析，發(fā)現(xiàn)不同硫芥反應(yīng)活性存在顯著差異，其中， Q 和T 反應(yīng)活性都顯著強(qiáng)于HD，而CECM、CEME 和CEMEE 反應(yīng)活性較弱；幾種硫芥與NAC 形成加合物的豐度低于GSH 與Cys；而染毒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同硫芥與GSH的加合物含量要遠(yuǎn)高于Cys 和NAC，其原因是除胞內(nèi)GSH 含量高于其余兩種硫醇化合物外， Q、T 和其余幾種長碳鏈的硫芥具有更強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力?？傊ㄟ^研究不同硫芥與幾種重要硫醇分子的加合特性，發(fā)現(xiàn)Q、T、CEBU 和CEPE 的反應(yīng)活性高于HD，預(yù)示其可能具有更強(qiáng)的體內(nèi)暴露毒性，相關(guān)的研究結(jié)果為揭示系列硫芥的毒效應(yīng)及溯源確證等提供了重要依據(jù)。