EB病毒DNA載量與患兒機(jī)體免疫及肝腎功能的相關(guān)性研究*

王紅霞，張?jiān)氯A，劉 敏，陳小建，唐小燕

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院/?？谑腥嗣襻t(yī)院：1.兒科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570208

EB病毒(EBV)屬于皰疹病毒科γ亞科家族成員之一，是引起兒童呼吸道感染的重要病毒之一，相關(guān)研究表明，有將近90%的人群EBV都處于潛伏感染狀態(tài)，而EBV感染是呼吸道感染疾病的重要病原體，其在兒童支氣管炎、肺炎及上呼吸道感染疾病中較為常見[1]。EBV會(huì)感染B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致其永生化，其在心理應(yīng)激條件下重新激活，減輕細(xì)胞免疫，EBV感染已被證實(shí)發(fā)生于多種疾病的子集當(dāng)中，如癌癥及自身免疫性疾病等，亦會(huì)引起肝腎功能損傷[2]。年齡相對(duì)較小的EBV感染患兒的臨床癥狀大多不典型，但急性感染時(shí)病毒載量較高，可引起患兒急性肝功能衰竭，當(dāng)患兒癥狀為消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及血液系統(tǒng)癥狀時(shí)，會(huì)增加臨床診斷的難度，極易導(dǎo)致漏診情況的發(fā)生，致使患兒的治療時(shí)機(jī)被耽誤，影響患兒預(yù)后[3-4]。鑒于此，本文通過研究EBV感染患兒EBV-DNA載量與機(jī)體免疫狀態(tài)及肝腎功能的相關(guān)性，以期為EBV-DNA陽性患兒的臨床治療提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年5月本院收治的90例EBV-DNA陽性患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合EBV感染相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定EBV-DNA載量≥5×102copy/mL；(3)年齡5個(gè)月至9歲，病歷資料完整；(4)入院前尚未接受相關(guān)抗感染治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他感染性疾病或免疫性疾病者；(2)因各種原因無法完成相關(guān)研究調(diào)查者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署知情同意書。按照EBV-DNA載量的差異進(jìn)行分組[6]，分成低載量組(<5×104copy/mL)44例、中載量組(5×104～5×105copy/mL)24例和高載量組(>5×105copy/mL)22例，另選取同期于本院接受體檢的健康兒童50例作為對(duì)照組。低載量組中男患兒25例，女患兒19例；年齡5個(gè)月至9歲，平均(4.52±1.23)歲；疾病分布：上呼吸道感染28例，下呼吸道感染16例。中載量組中男患兒14例，女患兒10例；年齡6個(gè)月至9歲，平均(4.63±1.25)歲；疾病分布：上呼吸道感染15例，下呼吸道感染9例。高載量組中男患兒13例，女患兒9例；年齡6個(gè)月至9歲，平均年齡(4.54±1.28)歲；疾病分布：上呼吸道感染14例，下呼吸道感染8例。對(duì)照組中男29例，女21例；年齡7個(gè)月至10歲，平均年齡(4.60±1.27)歲。各組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低載量組、中載量組、高載量組疾病分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，分成1、2、2 mL置于無菌試管中，1 mL血標(biāo)本加入含1 mL淋巴細(xì)胞，以2 000 r/min離心20 min，采集中間白色云霧狀細(xì)胞層保存用于檢測(cè)EBV-DNA載量；一份2 mL血標(biāo)本用于檢測(cè)免疫指標(biāo)，將另一份2 mL血標(biāo)本置于抗凝試管中，30 min后以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存，用于檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)。

1.2.2EBV-DNA載量檢測(cè) (1)將白色云霧狀細(xì)胞層放入離心管內(nèi)離心處理5 min，離心速度設(shè)置為12 000 r/min；(2)收集沉淀物加入50 μL的DNA提取液中進(jìn)行充分混勻，100 ℃處理10 min，在離心后取上清液儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?3)接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。按以下順序：待測(cè)標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、定量參考品，吸取2 μL液體置入上樣孔中。反應(yīng)程序：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，總共循環(huán)10次；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，循環(huán)30次；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，再對(duì)熒光值進(jìn)行調(diào)節(jié)并讀取結(jié)果，以記錄儀自動(dòng)分析待測(cè)標(biāo)本的病毒拷貝數(shù)，并保證陰性質(zhì)控品不出現(xiàn)數(shù)值。

1.2.3免疫指標(biāo)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群，主要指標(biāo)包括CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、并計(jì)算CD4+/CD8+；采用免疫比濁法測(cè)定免疫球蛋白(Ig)G、IgA、IgM水平，相關(guān)試劑盒購自浙江愛康生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4肝腎功能指標(biāo)檢測(cè) 采用德國西門子ADVIA 2400型全自動(dòng)生化分析儀(購自北京泰林東方商貿(mào)有限公司)及配套試劑盒檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)。肝功能指標(biāo)包括：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)。腎功能指標(biāo)包括：血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組免疫指標(biāo)水平比較 從對(duì)照組、低載量組、中載量組到高載量組，CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、IgM水平逐漸升高(P<0.05)，而CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐漸降低(P<0.05)；低載量組、中載量組、高載量組的IgG水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組免疫指標(biāo)水平比較

2.2各組肝腎功能指標(biāo)比較 從對(duì)照組、低載量組、中載量組到高載量組，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝腎功能指標(biāo)比較

2.3EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標(biāo)的相關(guān)性 EBV感染患兒EBV-DNA載量與CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、IgA均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

續(xù)表3 EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4EBV-DNA載量對(duì)患兒肝腎功能異常和免疫狀態(tài)的診斷價(jià)值 EBV-DNA載量對(duì)患兒免疫狀態(tài)異常預(yù)測(cè)的曲線下面積(AUC)為0.849(95%CI0.687～0.891)，靈敏度為85.46%，特異度為82.53%；對(duì)患兒肝功能異常預(yù)測(cè)的AUC為0.754(95%CI0.611～0.878)，靈敏度為82.20%，特異度為80.37%；對(duì)患兒腎功能異常預(yù)測(cè)的AUC為0.701(95%CI0.572～0.763)，靈敏度為79.24%，特異度為80.02%。見圖1。

圖1 EBV-DNA載量對(duì)患兒肝腎功能異常和免疫狀態(tài)的預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

3 討 論

EBV又稱之為人類皰疹病毒4型，亦是首個(gè)進(jìn)入人類視野中和腫瘤密切相關(guān)的病毒，全球范圍內(nèi)約有95%左右的人群血清EBV陽性[7-8]。EBV-DNA載量檢測(cè)是目前臨床上用以診斷EBV感染較為理想的方式。相關(guān)研究表明，EBV會(huì)引發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥，從而使得患者外周血異型淋巴細(xì)胞數(shù)增加，而兒童因呼吸系統(tǒng)及免疫功能尚未完全成熟，一旦感染EBV則會(huì)引發(fā)外周血淋巴細(xì)胞的異常改變[9-11]。EBV感染后病毒會(huì)產(chǎn)生不同的抗原，而此類抗原對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的抗體則會(huì)發(fā)揮不同程度的免疫保護(hù)功能[12-14]。另有相關(guān)研究證實(shí)，臨床上約有80%左右的原發(fā)性急性EBV感染患兒會(huì)出現(xiàn)肝功能損傷[15-16]，且隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，在原發(fā)性急性EBV感染患兒中發(fā)現(xiàn)腎功能也存在損傷，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從對(duì)照組、低載量組、中載量組到高載量組，CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、IgM水平逐漸升高，而CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐漸降低(P<0.05)；低載量組、中載量組、高載量組的IgG水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，提示EBV感染患兒機(jī)體免疫功能受損。相關(guān)性研究結(jié)果顯示，EBV感染患兒EBV-DNA載量與機(jī)體免疫狀態(tài)存在一定的相關(guān)性(P<0.05)。表明隨著EBV感染患兒的EBV-DNA載量增加，其機(jī)體免疫功能隨之下降。馬穎等[17]研究也指出EBV感染會(huì)引起兒童T淋巴細(xì)胞免疫機(jī)能的異常。分析原因，筆者認(rèn)為處在EBV裂解期與潛伏期抗原的特異性毒T淋巴細(xì)胞大量增殖并凋亡，僅少量的抗原特異性記憶T細(xì)胞隱藏在體內(nèi)，在血液中不斷循環(huán)，當(dāng)EBV再次增殖時(shí)，記憶T細(xì)胞會(huì)快速進(jìn)入活化狀態(tài)，繼而產(chǎn)生更為快速、明顯的免疫應(yīng)答，同時(shí)EBV感染會(huì)刺激B淋巴細(xì)胞分泌Ig，促使體液免疫反應(yīng)的發(fā)生。EBV-DNA載量的增加在一定程度上反映了病毒復(fù)制更為活躍，患兒對(duì)EBV的抵抗能力更為低下[18]。ALT、AST主要存在于肝臟、心臟組織細(xì)胞中，當(dāng)相應(yīng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，胞質(zhì)內(nèi)的ALT、AST釋放入血，導(dǎo)致血ALT、AST水平升高；肝臟對(duì)TBil的代謝起著重要作用，TBil水平可較好地反映肝功能；BUN、Scr、UA是臨床上評(píng)估腎功能的常用指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果顯示，從對(duì)照組、低載量組、中載量組到高載量組，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)，提示EBV感染患兒存在肝腎功能下降的情況，隨著EBV-DNA載量的升高，患兒肝腎功能下降越明顯。其中主要原因可能在于EBV-DNA載量的增加預(yù)示著病毒復(fù)制能力提高，繼而增加了肝腎功能異常的發(fā)生概率[20]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EBV感染患兒EBV-DNA載量與CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、IgA均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)EBV-DNA載量與患兒的免疫功能、肝腎功能相關(guān)，EBV-DNA載量升高通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞大量增殖，以及引起間質(zhì)性腎炎、IgA缺乏癥、腎病綜合征等疾病導(dǎo)致患兒肝腎功能下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)DNA載量對(duì)EBV感染患兒免疫狀態(tài)異常預(yù)測(cè)的AUC、靈敏度及特異度最高，而對(duì)腎功能損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值相對(duì)最低，原因可能是因?yàn)榛純簷C(jī)體在發(fā)生EBV感染后，其免疫系統(tǒng)的有關(guān)功能被逐漸激活，而EBV-DNA載量升高往往直接預(yù)示著機(jī)體內(nèi)原本平衡的免疫狀態(tài)被打破，因此更易預(yù)測(cè)患兒的免疫狀態(tài)異常。而肝臟具有較好的解毒作用，其可分泌出C-反應(yīng)蛋白等時(shí)相反應(yīng)蛋白間接地參與機(jī)體內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)，因此DNA載量對(duì)肝功能損傷也存在一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。而預(yù)測(cè)腎功能損傷的效果相對(duì)較弱的原因主要可能在于患兒的腎臟在遭受EBV感染后尿素氮及24 h蛋白尿等指標(biāo)水平變化更為明顯。這也從側(cè)面反映了隨著EBV-DNA載量的增加及免疫功能的下降，EBV感染患兒肝腎功能損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨之升高。提示了在實(shí)際臨床工作中應(yīng)予以患兒積極有效的抗病毒治療及增強(qiáng)其免疫功能，繼而達(dá)到預(yù)防肝腎功能損傷的目的。

綜上所述，EBV感染患兒EBV-DNA載量和機(jī)體免疫狀態(tài)及肝腎功能損傷密切相關(guān)，隨著EBV-DNA載量的逐漸增加，機(jī)體免疫功能及肝腎功能下降，EBV-DNA載量可作為預(yù)測(cè)EBV感染患兒免疫功能及肝腎功能的有效指標(biāo)，具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。