乙型肝炎病毒反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)恩替卡韋耐藥位點(diǎn)突變分析*

張宏宇，申紅玉，鄭國(guó)軍

江蘇省常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213001

近年來(lái)，恩替卡韋(ETV)作為一種強(qiáng)效、耐藥基因屏障高的藥物，廣泛應(yīng)用于慢性乙型肝炎(CHB)患者的抗病毒治療中[1]，ETV在病毒學(xué)、組織學(xué)和生物化學(xué)改善方面的效果優(yōu)于拉米夫定(LAM)和阿德福韋酯(ADV)?！堵砸倚透窝追乐沃改?2019年版)》[2]按照“強(qiáng)效低耐藥”的原則推薦將ETV、富馬酸替諾福韋酯(TDF)和丙酚替諾福韋(TAF)作為CHB防治一線(xiàn)藥物，非一線(xiàn)藥物比如LAM、替比夫定(LdT)和ADV不再推薦使用。同時(shí)，指南進(jìn)一步建議如果原來(lái)使用的藥物是LAM和LdT，即使病毒控制得很好也建議調(diào)整治療，原來(lái)應(yīng)用這些藥物沒(méi)有出現(xiàn)耐藥的患者建議換用低耐藥藥物治療[2]。

但患者長(zhǎng)期使用核苷(酸)類(lèi)似物(NAs)進(jìn)行抗病毒治療會(huì)使乙型肝炎病毒(HBV)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，即可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)藥物的敏感性下降甚至產(chǎn)生耐藥[3-4]，致使抗病毒治療失敗。目前，關(guān)于ETV耐藥的報(bào)道相對(duì)較少，在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發(fā)生率為1.2%[5]，但在治療過(guò)程中，特別是ETV治療其他NAs耐藥的患者易出現(xiàn)病毒學(xué)突破等再耐藥現(xiàn)象[6]。有研究回顧性分析了2009—2016年7年間該院收治的12 515例進(jìn)行HBV耐藥性檢測(cè)的患者，結(jié)果顯示2016年該院ETV的耐藥突變發(fā)生率在17.1%[7]，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，藥物可及性已經(jīng)得到了很大的改善，部分患者特別是ETV用于治療LAM或ADV耐藥的患者更易發(fā)生ETV耐藥的現(xiàn)象[8]。分別ETV耐藥比例不斷升高，成為不容忽視的問(wèn)題，對(duì)于這類(lèi)患者有必要分析了解其耐藥突變特征，為臨床規(guī)范抗病毒治療提供參考。

本研究回顧性分析本院HBV P基因測(cè)序ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性患者資料，以期了解本地區(qū)HBV耐藥突變特征，為后期臨床規(guī)范抗病毒治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年7月至2020年12月在本院就診并進(jìn)行HBV P區(qū)耐藥測(cè)序的慢性HBV感染患者7 886例為研究對(duì)象，所有患者均接受NAs單藥或序貫治療，經(jīng)HBV-DNA定量檢測(cè)>500 copy/mL，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎和HIV合并感染者1 878例，剩余6 008例，所有診斷均符《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[2]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1P區(qū)耐藥測(cè)序 采用QIAamp DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取血清中HBV-DNA，美國(guó)伯樂(lè)公司試劑擴(kuò)增DNA，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min后，95 ℃ 10 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，取擴(kuò)增標(biāo)本產(chǎn)物2～4 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，目的條帶大小約為500 bp，參考Marker條帶，如目的條帶亮度大于Marker最弱的條帶，則認(rèn)為擴(kuò)增成功，可進(jìn)行下一步純化測(cè)序工作。如無(wú)肉眼可見(jiàn)目的條帶或目的條帶亮度低于Marker最弱的條帶，則需進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。巢式PCR第一輪擴(kuò)增引物序列如下，F(xiàn)：5′-ACTGTATTCCCATCCCATCAT-3′；R：5′-TTCGTTGACATACTTTCCAATCA-3′)。第二輪擴(kuò)增引物序列如下，F(xiàn)：5′-CTTGACATACTTTCCAATCAA-3′；R：5′-AAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3′。PCR產(chǎn)物純化擴(kuò)增產(chǎn)物后，采用ABI3100測(cè)序儀對(duì)其測(cè)序。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2ETV 耐藥性變異的判斷 本研究ETV耐藥位點(diǎn)變異判斷標(biāo)準(zhǔn)為在LAM耐藥的基礎(chǔ)上(M204I/V和L180M變異)，再加上至少1個(gè)ETV耐藥位點(diǎn)[T184、S202 和(或)M250]的變異[9]。

1.2.3臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) HBV-DNA檢測(cè)采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的DNA提取試劑盒，在RocheLightCycler480儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，HBV-DNA結(jié)果以<500 copy/mL為陰性；乙型肝炎e抗原(HBeAg)檢測(cè)采用鄭州安圖生物公司磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法試劑，在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀AutoLumo A2000上進(jìn)行檢測(cè)；血清肝臟酶學(xué)指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的檢測(cè)采用邁克公司試劑在日立7600生化儀器上進(jìn)行檢測(cè)，所有操作嚴(yán)格按照儀器與試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性患者的一般資料 篩選出ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性的患者228例，占比3.8%(228/6 008)，男185例，女43例，平均年齡(51.25±11.25)歲，ALT水平為(97.2±146.1)U/L，AST水平為(64.3±93.9)U/L，HBeAg陽(yáng)性率為47.37%(108/228)，HBV-DNA載量為(6.63±0.12)copy/mL。ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性率從2010年的0.67%逐年上升，到2016年達(dá)到峰值6.81%，2017-2019年有一定下降的趨勢(shì)，2020年陽(yáng)性率又上升至5.96%，但送檢病例也有一定數(shù)量的減少。見(jiàn)表1。

表1 2010—2020年HBV P區(qū)耐藥測(cè)序情況及ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性分布情況

2.2臨床主要NAs的使用情況 考慮ETV耐藥率可能與藥物使用情況有關(guān)，本研究分析了LAM、LdT、ADV、TDF這4類(lèi)主要NAs的使用情況(因LAM和LdT屬于同一類(lèi)藥物，故歸為一組；因系統(tǒng)升級(jí)，未能查閱到2010年藥物的使用情況，但不影響整體趨勢(shì))。2011—2014年低耐藥屏障的LAM、LdT和ADV為主要使用的抗病毒藥物，2014—2016年維持一定使用量，2016年后使用量明顯下降；高耐藥屏障藥物ETV在2014年后使用量明顯增加，2017開(kāi)始高耐藥屏障藥物ETV和TDF使用量全面超過(guò)低耐藥屏障藥物；2014年以來(lái)，ETV一直是用量最多的藥物。見(jiàn)圖1。

圖1 2011—2020年臨床主要NAs的使用情況

2.3ETV基因型突變模式分析 rtL180M+M204V+S202G和rtL180M+M204V+T184A(G/I/S/L)突變最為常見(jiàn)，分別占42.54%和28.51%；ETV突變模式主要表現(xiàn)為rtL180M+M204V伴隨rtS202G或rtT184A(G/I/S/L)突變，M204I突變相對(duì)較少，其中rtL180M+M204I/V合并S202G突變者110例，rtL180M+M204I/V合并rtT184A(G/I/S/L)突變者81例。見(jiàn)表2。

表2 ETV基因型耐藥模式分析

2.4ETV主要耐藥基因突變模式與臨床特征的關(guān)系 鑒于ETV主要突變模式為rtL180M+M204I/V合并rtS202G或rtT184A(G/I/S/L)，本研究對(duì)這兩種耐藥突變模式患者的一些常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)室特征如HBeAg陽(yáng)性率，HBV-DNA，ALT，AST等進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rtL180M+M204I/V合并rtT184A(G/I/S/L)突變模式患者HBeAg陽(yáng)性率，HBV-DNA，ALT，AST等平均值略高于rtL180M+M204I/V合并rtS202G突變患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 ETV主要耐藥突變模式臨床實(shí)驗(yàn)室特征對(duì)比分析

3 討 論

采用ETV治療可強(qiáng)效抑制病毒復(fù)制，改善肝臟炎癥，安全性較好，長(zhǎng)期治療可改善CHB肝硬化患者的組織學(xué)病變，降低肝硬化并發(fā)癥和肝細(xì)胞癌發(fā)生率，降低肝臟相關(guān)和全因病死率。有研究表明，長(zhǎng)期口服ETV或TDF的CHB患者，8年生存率為94.1%[10]。因此抗病毒治療對(duì)CHB患者改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間至關(guān)重要。

目前，長(zhǎng)期應(yīng)用NAs進(jìn)行抗病毒治療的CHB患者體內(nèi)病毒在這種藥物壓力篩選中更易發(fā)生突變而導(dǎo)致治療失敗[9]。有研究報(bào)道，在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發(fā)生率為1.2%，在LAM耐藥的CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發(fā)生率提升至51.0%[5]。多項(xiàng)研究顯示，接受長(zhǎng)期ETV或其他NAs治療的CHB患者轉(zhuǎn)換至TAF治療后，病毒學(xué)抑制及腎功能得到顯著改善[11-12]。充分了解本地區(qū)HBV耐藥突變模式及相關(guān)臨床癥狀對(duì)于調(diào)整用藥及新耐藥位點(diǎn)預(yù)測(cè)非常重要。

本研究回顧性分析了近11年來(lái)本院進(jìn)行HBV P區(qū)耐藥測(cè)序的6 008例患者，篩選出ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性患者共228例，占比3.8%(228/6 008)，與之前報(bào)道的在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發(fā)生率為1.2%，在LAM耐藥的CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發(fā)生率提升至51.0%[5]存在差異，出現(xiàn)這種情況的原因考慮與本研究入組人群有關(guān)，雖然本研究多數(shù)為經(jīng)治患者，但用藥史不祥，有很多是LAM或LdT經(jīng)治患者，可能會(huì)引發(fā)ETV累積耐藥，也有很多為ADV經(jīng)治患者，稀釋了本底系數(shù)，且故本研究ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性率在1.2%～51.0%。分析從2010—2020年每年的ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性率，從2010年的0.67%逐年上升，到2016年達(dá)到峰值6.81%，與我國(guó)學(xué)者回顧性分析結(jié)果顯示ETV的耐藥突變發(fā)生率在2016年上升至17.1%的趨勢(shì)基本一致[7]，考慮與本研究時(shí)間跨度較長(zhǎng)，多數(shù)患者為L(zhǎng)AM或LdT經(jīng)治累積耐藥篩選有關(guān)；而2017-2019年又有逐漸下降的趨勢(shì)，可能與后期ETV、TDF等高耐藥基因屏障藥物大量使用有關(guān)，分析這些年的藥物使用情況，2017年開(kāi)始，高耐藥屏障藥物ETV，TDF的使用量全面超過(guò)低耐藥屏障藥物。但在2020年，耐藥率卻又進(jìn)一步升高至5.96%，出現(xiàn)這種情況可能是高耐藥屏障藥物的使用導(dǎo)致耐藥人數(shù)減少，送檢病例減少所致，也可能與長(zhǎng)期大量高耐藥屏障藥物使用導(dǎo)致新耐藥的產(chǎn)生有關(guān)，需進(jìn)一步研究探索。

分析ETV耐藥突變模式，結(jié)果顯示rtT184A(G/I/S/L)和rtS202G是ETV耐藥相關(guān)的最常見(jiàn)變異位點(diǎn)，而rtM250V位點(diǎn)變異較為少見(jiàn)，與之前相關(guān)報(bào)道一致[13-14]；ETV耐藥基因屏障的打破有賴(lài)于rtL180M+M204V/I的存在，本研究顯示大部分ETV耐藥發(fā)生在rtM204V的基礎(chǔ)上，rtM204I相對(duì)較少，與相關(guān)研究基本一致[9]，這可能是因?yàn)閞tM204I突變株仍保留了對(duì)ETV較高的敏感性[13]；由于ETV耐藥突變經(jīng)常發(fā)生在LAM或LdT經(jīng)治基礎(chǔ)上，rtM204I是LAM和LdT的主要變異形式，因此，有學(xué)者推測(cè)，在ETV耐藥突變篩選過(guò)程中可能存在rtL180M+M204I 突變向rtL180M+M204V突變轉(zhuǎn)換的過(guò)程[14]。有研究表明發(fā)生rtT184A/G/I/S基因突變患者的肝臟炎癥狀況比發(fā)生rtS202G/I突變的患者更為嚴(yán)重，且更易進(jìn)展為肝硬化[15]，本研究結(jié)果則顯示兩種突變模式的疾病嚴(yán)重程度無(wú)明顯差異，與之前研究不同的原因可能與納入患者臨床分期不明確所致，仍需進(jìn)一步觀察研究。

本研究對(duì)本院近11年CHB患者的ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性進(jìn)行回顧性分析，若有患者的用藥史會(huì)更加完整，但由于時(shí)間跨度較長(zhǎng)，且大部分患者為門(mén)診病例，用藥史、依從性不一，資料追蹤難度較大，無(wú)用藥情況說(shuō)明，預(yù)存耐藥情況不明。但作為中國(guó)東部地區(qū)長(zhǎng)期的ETV耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性患者的回顧性分析，本研究對(duì)于了解HBV變異情況、預(yù)后判斷及換藥治療具有一定的指導(dǎo)意義。