2015-2017年新生兒原發(fā)性肉堿吸收障礙串聯(lián)質(zhì)譜法回顧性分析*

程昱璇，張春燕，舒 楊，蔣 濤，崔佳奕，檀旭東，桑培培，史文杰，張民杰，田亞平

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部出生缺陷防控技術(shù)研究中心，北京100853

原發(fā)性肉堿吸收障礙(CUD)又稱原發(fā)性肉堿缺乏癥或肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，是常染色體隱性遺傳的脂肪酸β氧化代謝病，是一種與細(xì)胞線粒體有關(guān)的疾病[1]。CUD是由于SLC22A5基因(位于染色體5q31.1上，約30 kb)突變導(dǎo)致細(xì)胞膜有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(OCTN2)缺陷，造成多個(gè)組織受累包括骨骼肌、心肌、腦和腎臟等組織內(nèi)肉堿水平不足以支持長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體參與氧化[2]。CUD發(fā)生率約為0.8/10萬(wàn)～2.5/10萬(wàn)，不同地區(qū)發(fā)生率存在差異，其為脂肪酸氧化代謝的常見疾病[3]。

本研究采用血液串聯(lián)質(zhì)譜(MSMS)篩查的方法，對(duì)10.9萬(wàn)份各地標(biāo)本進(jìn)行初篩，現(xiàn)對(duì)這部分標(biāo)本的肉堿檢測(cè)結(jié)果作回顧性分析報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015-2017年于本院出生缺陷防控技術(shù)研究中心進(jìn)行新生兒MSMS篩查的10.9萬(wàn)份濾紙干血片標(biāo)本，在新生兒父母簽署知情同意書的前提下，用 MSMS進(jìn)行多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的檢測(cè)分析，標(biāo)本來(lái)源于四川、新疆、西藏、貴州、湖北、北京出生的新生兒。

1.2儀器與試劑 使用美國(guó)Waters Xevo TQD質(zhì)譜儀、美國(guó)Waters 2777自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、1525u高效液相儀、孵浴震蕩儀、美國(guó) PerkinElmer 流動(dòng)相和萃取溶劑試劑盒(含甲醇、水和草酸)、美國(guó) PerkinElmer非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜試劑盒、琥珀酰丙酮內(nèi)標(biāo)液進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè)。

1.3方法

1.3.1MSMS試驗(yàn)分析 用包含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸、?；鈮A和琥珀酰丙酮的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑萃取濾紙干血片中的氨基酸、游離肉堿(C0)和酰基肉堿，然后用MSMS系統(tǒng)分析。具體操作步驟如下：用1 mL萃取液溶解內(nèi)標(biāo)干粉制成儲(chǔ)備工作液，于2～8 ℃保存待用。用直徑3 mm打孔鉗打取濾紙片至96孔板中，按照萃取液與內(nèi)標(biāo)液110∶1的比例配制萃取工作液，每孔加入含氨基酸和?；鈮A同位素內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，45 ℃，700 r/min密封孵育震蕩45 min，提取80 μL萃取液轉(zhuǎn)移至V型底的96孔板內(nèi)，鋁膜覆蓋，放置在自動(dòng)進(jìn)樣器上靜置2 h后即可檢測(cè)[4]。采用美國(guó)Waters公司Masslynx軟件處理數(shù)據(jù)，由已知水平的內(nèi)標(biāo)自動(dòng)計(jì)算出所測(cè)樣品的氨基酸、?；鈮A和琥珀酸丙酮的水平。同一標(biāo)本異常指標(biāo)2次結(jié)果均超過參考值，判為篩查陽(yáng)性者立即召回。對(duì)C0偏低的患兒母親同時(shí)進(jìn)行血液?；鈮A水平分析。

1.3.2SLC22A5基因測(cè)序分析 篩查出新生兒陽(yáng)性標(biāo)本(C0水平低于9.5 μmol/L)，采用干血片法提取基因組DNA，進(jìn)行全外顯子測(cè)序(WES)，測(cè)序結(jié)果與人類基因組SLC22A5基因序列進(jìn)行比較[5]。

2 結(jié) 果

在10.9萬(wàn)份篩查標(biāo)本中初次篩查提示CUD(或繼發(fā)性肉堿吸收障礙)124例，其中男54例、女70例，平均年齡(164.40±16.18)d，平均體質(zhì)量(3 346.00±54.49)g，平均C0為(6.27±0.16)μmol/L，本實(shí)驗(yàn)室C0的參考范圍為9.5～48.0 μmol/L。共召回39例患兒標(biāo)本再次進(jìn)行二次篩查，最終對(duì)確定6例疑似患兒進(jìn)行基因確診，其中3例提示基因突變，對(duì)應(yīng)C0及?；鈮A譜水平見表1。3例患兒SLC22A5基因診斷到2種突變，2例c.1400C>G(p.S467C)雜合突變和1例c.51C>G(p.F17L)純合突變，見表2。病例1患兒因丙二酰基肉堿水平升高召回，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)另有SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，C0水平為12.37 μmol/L。病例2患兒C0水平為4.14 μmol/L，召回基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低。病例3患兒C0水平為3.57 μmol/L，召回基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC22A5基因c.51C>G(p.F17L)純合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低明顯。

表1 3例CUD患兒C0及?；鈮A譜水平(μmol/L)

表2 3例CUD患兒基因檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

研究表明在法羅群島CUD的患病率最高為1∶300[6]，日本的患病率約為1∶40 000[7]，澳大利亞為1∶37 000～1：100 000[8]，美國(guó)為1∶142 000[9]，在中國(guó)河南省的患病率為1∶31 499[10]，浙江省為1∶23 862[11]，上海市為1∶45000[1]，河北省為1∶17 785[12]，本研究共篩查來(lái)自四川、新疆、西藏、貴州、湖北、北京6地新生兒標(biāo)本10.9萬(wàn)例，通過MSMS篩查出124例疑似陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性疑似率約為1.14‰，確診CUD 3例，患病率約為1∶36 333，與報(bào)道的中國(guó)CUD新生兒篩查患病率相符[12]。MSMS技術(shù)對(duì)早期發(fā)現(xiàn)CUD有提示意義，但最終確診需結(jié)合其他檢測(cè)手段，如尿有機(jī)酸檢測(cè)和基因檢測(cè)等，并結(jié)合臨床明確診斷。

CUD是由SLC22A5基因編碼的OCTN2肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變引起的常染色體隱性(AR)遺傳疾病，有10個(gè)外顯子[13]。SLC22A5突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arup.utah.edu/database/OCTN2/OCTN2_display.php)中描述了150多種遺傳變異，其中86種具有致病性(包括錯(cuò)義、無(wú)義、插入缺失、移碼，剪接位點(diǎn)改變突變和一個(gè)大基因缺失)[13]。大多數(shù)研究認(rèn)為c.760C> T(p.R254X)和c.1400C>G(p.S467C)是中國(guó)人最常報(bào)道的突變[14]。本研究結(jié)果檢測(cè)出2例c.1400C> G(p.S467C)和1例c.51C>G(p.F17L)，c.1400C>G(p.S467C)占比2/3，與報(bào)道相一致[15]。基因突變致其編碼的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無(wú)法錨定細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞質(zhì)中，或結(jié)構(gòu)及功能域不同程度受損，導(dǎo)致該蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺陷。肉堿(β-羥基-γ-三甲基丁酸銨)是一種衍生自氨基酸的必不可少的水溶性分子[15]。在非素食主義者中，肉堿的主要來(lái)源是紅肉，家禽和奶制品[16]，幾乎占人體總貯存量的3/4[17]。肉堿由腸道內(nèi)轉(zhuǎn)入到血液及由血液內(nèi)轉(zhuǎn)入到細(xì)胞的量減少，血液及細(xì)胞內(nèi)肉堿缺乏，尿流失增加，脂肪酸β氧化代謝受阻[18]。CUD可于任何年齡發(fā)病，患者表現(xiàn)為心肌疾病、心功能降低、肌無(wú)力、肌張力減退及肝功能異常等[19]，若是不及時(shí)醫(yī)治，可導(dǎo)致死亡。有些患兒在診斷時(shí)通常是完全無(wú)癥狀的，可通過測(cè)量血漿肉堿水平(游離和總量)和研究肉堿在成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)確認(rèn)[15]。左卡尼汀的治療，使越來(lái)越多CUD患兒的預(yù)后得到了改善[20-21]。CUD是為數(shù)不多的治療效果良好的遺傳病之一，所以早期診斷、及時(shí)治療是改善患兒預(yù)后的關(guān)鍵。

本研究通過足跟采血，滴于專用濾紙片后晾干，寄送到本實(shí)驗(yàn)室使用MSMS方法測(cè)定C0及其他?；鈮A，CUD患兒C0及多種?；鈮A水平降低，C0水平正常參考值為9.5～48.0 μmol/L。病例1患兒因丙二酰基肉堿水平升高召回，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)另有SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，C0串聯(lián)檢測(cè)結(jié)果正常。病例2患兒C0水平為4.14 μmol/L，召回基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低。病例3患兒C0水平為3.57 μmol/L召回基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC22A5基因c.51C>G(p.F17L)純合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低明顯。雜合突變個(gè)體的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)活性為正常個(gè)體的50%，C0值可處于臨界低水平[22]。此外，C0能通過胎盤從母體轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒，若母親體內(nèi)肉堿充足，CUD胎兒可以從母體獲得肉堿供給，在生后的一段時(shí)間內(nèi)仍保持較充足的肉堿儲(chǔ)備，導(dǎo)致篩查時(shí)出現(xiàn)假陰性。若母親為原發(fā)性肉堿缺乏癥或各種原因?qū)е卵褐腥鈮A不足，也會(huì)導(dǎo)致新生兒篩查時(shí)C0水平低于正常[23]，導(dǎo)致假陽(yáng)性，故新生兒篩查陽(yáng)性者，需要同時(shí)測(cè)母親C0水平，以便除外因母體原因?qū)е碌睦^發(fā)性肉堿缺乏。

CUD是一種潛在的致死性疾病，早期診斷和治療是決定預(yù)后的關(guān)鍵。本研究使用MSMS技術(shù)篩查10.9萬(wàn)份標(biāo)本，檢測(cè)出124例CUD疑似陽(yáng)性患兒，對(duì)可疑陽(yáng)性患者的標(biāo)本進(jìn)行SLC22A5基因測(cè)序，進(jìn)一步確診了3例CUD患兒。MSMSM技術(shù)的應(yīng)用使CUD的早期診斷成為可能，結(jié)合測(cè)序技術(shù)也為CUD 的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了重要信息。