滑菇對三苯甲烷類染料的脫色*

王偉霞,李舒格,張之麒 ,陳金日,吳少杰，李福后

(江蘇海洋大學(xué) a.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室；b.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室；c.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

三苯甲烷類染料是一類芳香族異源化合物，具有色譜范圍廣、著色力高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。該類染料以三苯甲烷為母體，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，生物可降解性低，并且對動物細胞具有毒性，可產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等作用[3-7]?？兹甘G屬于三苯甲烷類染料，除了作為染料外，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，對環(huán)境和人類健康造成極大危害[8-10]。

目前，主要通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法來進行染料處理，如吸附、沉淀、光解、氧化還原反應(yīng)、電化學(xué)處理等。然而，這些傳統(tǒng)方法成本非常昂貴且可能帶來二次污染[11-12]。作為傳統(tǒng)物理化學(xué)方法的替代，生物降解具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點，正在成為一種有效的、可持續(xù)的處理方法。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物對三苯甲烷類染料具有脫色和降解能力，包括細菌、白腐真菌、放線菌和藻類等[13]。生物降解的研究主要集中于染料的脫色還原過程，如孔雀石綠和結(jié)晶紫被轉(zhuǎn)化為無色衍生物的機制等[14]。

白腐真菌具有較強的染料脫色和降解能力，這得益于它們能夠產(chǎn)生一系列的降解相關(guān)酶類，包括漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和細胞色素P450單加氧酶等[15-17]。漆酶是一類含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物特異性，其不僅能夠利用氧作為電子受體來氧化木質(zhì)素，還能夠氧化多種芳香族化合物[15]。木質(zhì)素過氧化物酶作為一種含血紅素輔基的氧化還原酶，通過自由基鏈式反應(yīng)，實現(xiàn)染料的脫色和降解過程[16]。在土生真菌綺麗小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)中，細胞色素P450單加氧酶系統(tǒng)通過介導(dǎo)還原和N-脫甲基反應(yīng)，實現(xiàn)孔雀石綠的生物轉(zhuǎn)化[17]。

工業(yè)染料廢水成分復(fù)雜，處理成本高。而將白腐真菌用于工業(yè)廢水處理具有明顯的優(yōu)勢，它們的菌絲體可以固定化，實現(xiàn)體系的連續(xù)循環(huán)處理，另外，處理后的菌絲體也方便回收，避免二次污染?；?Pholiotanameko)屬球蓋菇科鱗傘屬，作為一種白腐真菌，它可以引起木材腐朽等[18]。對于滑菇的研究，多數(shù)學(xué)者關(guān)注的是栽培技術(shù)的開發(fā)和多糖的利用等，而在染料脫色和降解方面的研究尚不多見[19-20]。本文以孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅等三苯甲烷類染料為底物，首先檢測了滑菇菌絲體在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長能力，然后研究了滑菇菌絲體在液體條件下對3種染料的脫色能力，同時，監(jiān)測其產(chǎn)生漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶以及錳過氧化物酶的能力。該研究可為滑菇的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 滑菇菌株SP02，保存于江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院農(nóng)業(yè)資源開發(fā)與農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室。

1.1.2 試劑 ① 孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、黎蘆醇等均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。② 染料母液：稱取50 mg染料(孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅)，溶于10 mL去離子水，配置成5 g/L母液。

1.1.3 培養(yǎng)基 ① 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。② 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。③ 含染料PDA培養(yǎng)基：取500 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基，加熱融化，待冷卻至50 ℃左右時，分別加入5 mL不同類型的染料母液，混合均勻后倒至平板，制成含50 mg/L染料的PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 滑菇菌種活化 無菌操作條件下，從保藏的滑菇斜面菌種中挑取一小塊直徑約5 mm的菌塊，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)8 d，備用。

1.2.2 滑菇在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長試驗 利用打孔器，從活化的PDA平板菌落近邊緣處選取菌種塊(直徑5 mm)，分別接種于含有不同染料的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)，并觀察拍照，測量菌落直徑。以不含染料的PDA培養(yǎng)基作為對照。

1.2.3 滑菇對染料的脫色試驗 從活化的PDA平板菌落近邊緣處選取菌種塊(直徑5 mm)，接種于含有100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種5塊。25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，此為種子液。取12.5 mL種子液，接種于含有250 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為5%。25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，此為菌絲體發(fā)酵液。

在滑菇菌絲體對染料的脫色試驗中，首先取培養(yǎng)7 d的20 mL菌絲體發(fā)酵液，然后分別加入80 mL含有1 mg不同染料(孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅)的蒸餾水，使染料的終質(zhì)量濃度均為10 mg/L。脫色試驗的體系為100 mL，將脫色體系置于恒溫搖床，25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，檢測滑菇24 h的脫色能力。

1.2.4 滑菇的連續(xù)脫色試驗 以孔雀石綠為滑菇的連續(xù)脫色對象。取培養(yǎng)7 d的20 mL菌絲體發(fā)酵液，加入80 mL含有1 mg孔雀石綠的蒸餾水，使孔雀石綠終質(zhì)量濃度為10 mg/L。連續(xù)脫色試驗的體系為100 mL，將脫色體系置于恒溫搖床，25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h，添加10 mg/L孔雀石綠，連續(xù)添加3次，檢測滑菇的連續(xù)脫色能力。

1.2.5 脫色率測定 從上述脫色體系中，取1 mL菌絲體染料混合液，12 000 r/min離心5 min，保留上清液。取上清液300 μL于96孔板中，利用酶標儀，掃描其在300～800 nm范圍內(nèi)的吸光度值(OD)。

孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅的最大吸收波長分別為615，584和542 nm[21]。在最大吸收波長處，測定上清液的OD值；At為染料脫色t時刻的OD值，A0為染料脫色零時刻的OD值，脫色率DR=(A0-At)/A0×100%。

1.2.6 滑菇漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力測定 取25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d的菌絲體發(fā)酵液，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。

漆酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含10 mmol/L ABTS 100 μL，50 mmol/L乙酸緩沖液(pH 5.0)880 μL，粗酶液 20 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在420 nm處測定OD值[22]。420 nm處ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)(ε420 nm)為36 000 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol ABTS被氧化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

木質(zhì)素過氧化物酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含20 mmol/L藜蘆醇 100 μL，50 mmol/L酒石酸緩沖液(pH 3.5)870 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在310 nm處測定OD值[22]。310 nm處藜蘆醛的摩爾消光系數(shù)(ε310 nm)為9 300 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol藜蘆醇被氧化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

錳過氧化物酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含8 mmol/L 愈創(chuàng)木酚 50 μL，50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH 4.5)870 μL，10 mmol/L MnSO450 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在465 nm處測定OD值[23]。465 nm處四鄰甲氧基連酚的摩爾消光系數(shù)(ε465nm)為26 600 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol愈創(chuàng)木酚被轉(zhuǎn)化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 各組實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用SPSS 26 軟件進行統(tǒng)計分析，利用Excel 2021進行圖譜繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 滑菇在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長結(jié)果

由圖1可知，滑菇菌絲體在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)不同。在PDA培養(yǎng)基上(對照組)，菌絲體生長旺盛，菌絲較稠密，一般于14 d即可長滿整個平板(90 mm)。在含有孔雀石綠和結(jié)晶紫的培養(yǎng)基上，菌絲體生長較緩慢，表明孔雀石綠和結(jié)晶紫具有較強的殺真菌能力。50 mg/L的孔雀石綠和結(jié)晶紫能夠抑制菌絲的生長，培養(yǎng)14 d時，菌落直徑一般為45～50 mm，且菌絲稠密。與孔雀石綠和結(jié)晶紫相比，品紅對滑菇菌絲體的生長抑制能力較弱，培養(yǎng)14 d時，菌落直徑一般為80～85 mm，且菌絲較稀疏。

圖1 滑菇SP02在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長結(jié)果

2.2 滑菇對染料的脫色試驗結(jié)果

孔雀石綠在615 nm和425 nm處有兩個特征吸收峰，經(jīng)過24 h 的脫色，這兩個吸收峰基本消失(如圖2a所示)。結(jié)晶紫和堿性品紅的最大吸收波長分別為584 nm和542 nm，經(jīng)過24 h 的脫色，300～800 nm范圍內(nèi)的吸收峰也基本消失(如圖2b和圖2c所示)?；骄闟P02對孔雀石綠、結(jié)晶紫和堿性品紅等染料具有較強的脫色能力，24 h 脫色率分別達到92.9%，89.6%和83.9%(如圖2d所示)。

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2.3 滑菇的連續(xù)脫色試驗結(jié)果

以孔雀石綠為滑菇的連續(xù)脫色對象，在100 mL脫色體系中每隔24 h添加10 mg/L孔雀石綠，連續(xù)添加3次，檢測滑菇的脫色能力。由圖3可知，滑菇菌株SP02能夠很好地對孔雀石綠進行連續(xù)脫色，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

圖3 滑菇SP02的連續(xù)脫色試驗結(jié)果

白腐真菌主要通過生物吸附和生物降解兩個過程對染料進行色度脫除。生物吸附主要通過菌絲體與染料相互作用所致，而生物降解主要涉及3種木質(zhì)素降解酶系，包括漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶等[24]。滑菇菌株SP02能夠?qū)兹甘G進行連續(xù)脫色，表明生物降解作用可能在染料脫色過程中起重要作用。

2.4 滑菇漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力分析

白腐真菌主要通過分泌漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶等來氧化芳烴類化合物，使芳烴類化合物開環(huán)并實現(xiàn)完全降解[25]。測定了滑菇菌株SP02培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中3種木質(zhì)素降解酶的活力，結(jié)果見圖4。在培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中，漆酶的活力最高，為224 U/mL；其次為木質(zhì)素過氧化物酶，為58 U/mL；錳過氧化物酶的活力最低，只有6 U/mL。在滑菇脫色體系中，推測漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶起協(xié)同作用，共同促進孔雀石綠的降解。Kang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在血紅密孔菌IUM0032(Pycnoporuscoccineus)降解孔雀石綠的過程中，木質(zhì)素過氧化物酶在降解初期起著關(guān)鍵作用，而漆酶進一步促進了孔雀石綠的降解。

圖4 滑菇SP02漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力分析

3 討論與結(jié)論

利用白腐真菌進行染料的脫色具有明顯的優(yōu)勢，通過菌絲體與染料大分子相互作用，以及菌絲體分泌的木質(zhì)素降解酶系，不僅可以實現(xiàn)生物吸附，且能夠?qū)崿F(xiàn)良好的生物降解[24]。據(jù)報道，黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)、落葉松附毛孔菌(Trichaptumlaricinum)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)等具有較強的染料脫色能力[26-29]。以黃孢原毛平革菌為例，該菌能夠降解多種染料類型，包括三苯甲烷類、偶氮、蒽醌等[30]。韓啟燦等[28]發(fā)現(xiàn)，落葉松附毛孔菌對孔雀石綠有較強的脫色作用，在適宜條件下脫色1 h，脫色率可達92.6%。裂褶菌cfcc7252在好氧和厭氧條件下均能高效降解孔雀石綠，48 h內(nèi)降解率可達98%以上[29]?；骄闟P02 對孔雀石綠也有較強的脫色和降解能力，24 h內(nèi)其脫色率為92.9%。不同的菌株類型對孔雀石綠等染料的降解和脫色能力略有差異，這可能與菌株的培養(yǎng)條件、產(chǎn)降解酶水平密切相關(guān)。

漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶是參與染料降解的主要作用酶類，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高酶的產(chǎn)量并進行大規(guī)模推廣應(yīng)用是研究的重點方向之一。尚曉靜等[25]發(fā)現(xiàn)，裂褶菌菌株G18的漆酶在液體培養(yǎng)的第6天達到峰值，為1 830 U/mL，而木質(zhì)素過氧化物酶在第2天即達到峰值。在毛木耳菌株AC5培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中，漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶的活性分別為321 U/mL和121 U/mL，此時菌株對染料的降解率最高[31]?；骄闟P02能夠分泌漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶等，在發(fā)酵培養(yǎng)7 d時，酶活性分別為224 U/mL和58 U/mL。與上述裂褶菌和毛木耳菌株相比，滑菇菌株SP02的產(chǎn)降解酶水平較低，這可能與菌種類型、培養(yǎng)條件等相關(guān)，需要進一步優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高酶的表達水平。

劉曉雪等[32]以平菇680為研究材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件，結(jié)果表明響應(yīng)面設(shè)計對于優(yōu)化液體培養(yǎng)基組成以提高漆酶活性切實可行。利用基因工程手段，克隆表達白腐真菌漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶基因，以提高酶的表達量并改善酶學(xué)性質(zhì)，將進一步推動木質(zhì)素降解酶類的工業(yè)化應(yīng)用[33-34]。

本研究以孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅為底物，發(fā)現(xiàn)滑菇菌株SP02能夠有效降解這3種三苯甲烷類染料，同時，菌株SP02能夠?qū)兹甘G進行連續(xù)脫色，表明該菌具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。白腐真菌在降解染料過程中易受到溫度、pH、金屬離子等多種環(huán)境因素的影響，需要進一步評估這些影響因素并優(yōu)化其脫色工藝，以期推動生物脫色的理論創(chuàng)新和實際應(yīng)用。