海洋多糖復(fù)合水凝膠的制備及性能研究*

邴吉帥，王得發(fā)，許依能，陳 麗

(1.江蘇海洋大學(xué) a.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；3.連云港市環(huán)境科技服務(wù)中心，江蘇 連云港 222005)

作為一類高吸水、高保水材料，水凝膠被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、化妝品、醫(yī)藥材料、食品等領(lǐng)域。傳統(tǒng)水凝膠具有強(qiáng)度低、韌性差、吸水速度慢、對環(huán)境(溫度或pH等)的變化不敏感等缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)水凝膠相比，天然水凝膠對環(huán)境變化敏感，具有較高的生物相容性、保水性、降解性和生物穩(wěn)定性[1-2]，同時，天然水凝膠可通過負(fù)載藥物或活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)止血、抗菌、藥物釋放，因而在創(chuàng)傷燒傷愈合等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[3-7]。

作為一類重要的天然水凝膠材料，以殼聚糖為基質(zhì)制備的復(fù)合水凝膠受到廣泛關(guān)注。Patel等[8]用明膠與殼聚糖復(fù)合制備了具有促進(jìn)傷口愈合功能的水凝膠；Peers等[9]將載藥脂質(zhì)體負(fù)載至殼聚糖制備了有利于藥物釋放的水凝膠；Hafida等[10]將殼聚糖與聚丙烯酰胺、銀納米粒子結(jié)合制備了對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用的復(fù)合納米水凝膠，殺菌率高達(dá)99.99%；Ulu等[11]將殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和MCM-41聚合得到復(fù)合水凝膠膜，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌酵母具有優(yōu)異抗菌性能，可用于藥物遞送及傷口愈合材料和吸附材料的生產(chǎn)。但是目前為止，對以殼聚糖和海藻酸鈉為基質(zhì)，以生物活性玻璃為結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)劑，負(fù)載南極磷蝦抗菌肽制備海洋多糖復(fù)合抗菌水凝膠的研究較少。

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然親水性高分子多糖，是食品、醫(yī)藥領(lǐng)域制備功能水凝膠的首選理想材料[8-9,12]，有著很好的應(yīng)用前景。目前，殼聚糖和海藻酸鈉常用于天然水凝膠的制備[13-17]，但該類復(fù)合水凝膠生物活性相對較弱。本文利用活性疊加原理，將活性小分子引入到復(fù)合水凝膠制品中，試圖改善其生物活性。有研究表明，某些天然小分子活性肽具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理[18]。南極磷蝦抗菌肽作為天然活性肽的一種，具有優(yōu)良的抑菌作用。在此基礎(chǔ)上，本文以海洋多糖殼聚糖、海藻酸鈉為主要基質(zhì)，制備具有較好力學(xué)機(jī)械性能、生物相容性和持水力的海洋多糖復(fù)合水凝膠，并進(jìn)一步負(fù)載南極磷蝦抗菌肽，制得具有較好抗菌生物活性的復(fù)合抗菌水凝膠，為其在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖(CS)、海藻酸鈉(SA)、冰醋酸、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀，購自國藥集團(tuán)試劑有限公司，分析純；LB肉湯，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉，購自上海橋星貿(mào)易有限公司；生物活性玻璃(BG)，購自渾源駿宏新材料有限公司。南極磷蝦抗菌肽為實(shí)驗(yàn)室自制；金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌由江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；全波長酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司；Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher Scientific公司；JSM-6390LA掃描電子顯微鏡，日本JEOL；凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海洋多糖復(fù)合水凝膠制備及條件篩選

(1)復(fù)合水凝膠制備。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的海藻酸鈉溶液、1.2%的殼聚糖溶液和生物活性玻璃混合均勻，50 ℃水浴下滴加一定量0.3 mol/L氯化鈣溶液，攪拌均勻。

(2)海藻酸鈉與殼聚糖體積比的篩選。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液分別按體積比19∶1，18∶2，17∶3，16∶4，15∶5混合，在50 ℃水浴下，向不同混合液分別加入0.5 g/mL的生物活性玻璃，再滴加0.2 mL 0.3 mol/L的的氯化鈣溶液，攪拌均勻后注入模具。

(3)生物活性玻璃添加量的篩選。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液按照體積比17∶3混合均勻，50 ℃水浴下，分別加入0，0.25，0.50，0.75，1.00 g/mL的生物活性玻璃，再分別滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化鈣溶液，混勻注入模具。

1.3.2 海洋多糖復(fù)合水凝膠成膠時間 復(fù)合水凝膠成膠時間的測定采用倒置觀察法。將水凝膠混合物放置在室溫中，每隔5～10 s傾斜或倒轉(zhuǎn)模具，將水凝膠無法流出模具的時間記為t1，水凝膠完全固化時間記為t2，水凝膠成膠時間為t2-t1[19]。

1.3.3 海洋多糖復(fù)合水凝膠掃描電鏡分析 海洋多糖復(fù)合水凝膠微觀形貌分析采用掃描電鏡觀察。

1.3.4 海洋多糖復(fù)合水凝膠性能研究

(1)含水量測定。將不同條件下制備的水凝膠吸干表面水分，稱取樣品質(zhì)量為mw，將樣品凍干后再稱質(zhì)量，記為md。

含水量(%)=(mw-md)/mw×100%。

(2)溶脹率測定。將不同條件下制備的水凝膠真空干燥后，再在PBS緩沖液中浸泡24 h，至質(zhì)量不增加(稱量3次不變即可)，記為msl[20]。

溶脹率(%)=(msl-md)/md×100%。

(3)力學(xué)性能測定。采用質(zhì)構(gòu)儀法測定力學(xué)性能。將水凝膠用模具做成直徑為10 mm、高為5 mm的圓柱體，將水凝膠擠壓破裂至最大壓力，測量水凝膠的靜態(tài)壓縮模量[19]。

1.3.5 海洋多糖/抗菌肽復(fù)合抗菌水凝膠抑菌活性測定 在50 ℃水浴下，分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液按17∶3體積比混合后，加入0.5 g/mL生物活性玻璃粉體，制備混合膠體6份，再分別加入0，10，20，30，40，50 mg/mL南極磷蝦抗菌肽，混勻。最后滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化鈣溶液，制備得到一系列含南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽復(fù)合抗菌水凝膠，分別記為G0，G1，G2，G3，G4，G5。采用濾紙片法，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，分別測定復(fù)合抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋多糖復(fù)合水凝膠成膠時間

海藻酸鈉與殼聚糖的體積比對復(fù)合水凝膠成膠時間的影響如表1所示。

表1 SA與CS體積比對復(fù)合水凝膠成膠時間的影響

在生物活性玻璃添加量為0.5 g/mL、室溫條件下，海藻酸鈉與殼聚糖體積比不同時，復(fù)合水凝膠均可成膠，且隨著海藻酸鈉體積比例的減小、殼聚糖體積比例的增大，成膠時間呈現(xiàn)先下降后上升狀態(tài)，當(dāng)兩者體積比為17∶3時成膠時間最短，為60 s左右。因此選擇海藻酸鈉與殼聚糖最佳成膠的體積比為17∶3。

生物活性玻璃添加量對復(fù)合水凝膠成膠時間的影響如表2所示。在海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3的條件下，生物活性玻璃添加量對復(fù)合水凝膠成膠時間不產(chǎn)生明顯影響，且在室溫下均可成膠，成膠時間約為60 s。

表2 BG添加量對復(fù)合水凝膠成膠時間的影響

2.2 海洋多糖復(fù)合水凝膠掃描電鏡分析

在海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3的條件下，分別測試了含有0，0.25，0.50 g/mL生物活性玻璃的復(fù)合水凝膠的微觀表面形態(tài)。已知真空冷凍干燥可有效保持水凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。將所有待測樣品真空凍干后進(jìn)行掃描電鏡表面結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果如圖1所示。在放大3 000倍條件下，與不含生物活性玻璃的復(fù)合水凝膠(見圖1a)相比，含有生物活性玻璃的復(fù)合水凝膠(見圖1d和圖1g)表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密，水凝膠分散更加均勻，且隨著生物活性玻璃添加量的增大，復(fù)合水凝膠分散均勻性、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密性進(jìn)一步增強(qiáng)，團(tuán)聚現(xiàn)象減少，說明生物活性玻璃的添加可以有效改善復(fù)合水凝膠表面網(wǎng)狀形態(tài)。

a BG添加量0 g/mL，×3 000

2.3 海洋多糖復(fù)合水凝膠性能

2.3.1 含水量和溶脹率 海藻酸鈉與殼聚糖體積比對復(fù)合水凝膠含水量和溶脹率的影響如圖2、圖3所示。由圖2可知，不同海藻酸鈉與殼聚糖體積比得到的復(fù)合水凝膠含水量均大于90%，整體上含水量狀況良好。當(dāng)海藻酸鈉與殼聚糖體積比為19∶1時，所得復(fù)合水凝膠的含水量最高，達(dá)94.11%；隨著海藻酸鈉體積比例的升高、殼聚糖體積比例的降低，復(fù)合水凝膠含水量逐漸降低；當(dāng)兩者體積比為15∶5時，含水量下降至90.34%，這可能是海藻酸鈉量的減少影響了凝膠的親水性，導(dǎo)致復(fù)合水凝膠含水量降低。

圖2 SA與CS體積比對復(fù)合水凝膠含水量的影響

如圖3所示，海藻酸鈉與殼聚糖不同體積比所形成的復(fù)合水凝膠均具有一定的溶脹能力。當(dāng)兩者體積比為19∶1時，所得復(fù)合水凝膠溶脹率最大，為65.51%；隨著海藻酸鈉體積比例的增大、殼聚糖體積比例的減小，復(fù)合水凝膠溶脹率逐漸下降，當(dāng)體積比減小到15∶5時，溶脹率下降至33.32%。原因可能是隨著殼聚糖含量的增加，分子間氫鍵等作用力增強(qiáng)，交聯(lián)更緊密，溶脹能力減弱，分子鏈間的距離較近，在鈣離子加入量相同的條件下，更易形成較為致密的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)而降低凝膠的溶脹度[21]。

圖3 SA與CS體積比對復(fù)合水凝膠溶脹率的影響

生物活性玻璃不同添加量對復(fù)合水凝膠含水量、溶脹率的影響如圖4、圖5所示。由圖4可知，不同生物活性玻璃添加量所得復(fù)合水凝膠產(chǎn)物的含水量均大于93%，均具有較高含水量，但隨著生物活性玻璃含量的增加，復(fù)合水凝膠的含水量逐漸降低。不含生物活性玻璃的復(fù)合水凝膠的含水量為96.69%；當(dāng)添加量為0.50 g/mL時，含水量下降為94.11%，添加量增加到1.00 g/mL時，含水量下降為92.94%，降低趨勢并不明顯。

圖4 BG添加量對復(fù)合水凝膠含水量的影響

由圖5可知，隨著生物活性玻璃添加量的增加，所得復(fù)合水凝膠的溶脹能力逐漸降低。相關(guān)研究證明，水凝膠的含水量、溶脹率跟交聯(lián)程度有關(guān)，復(fù)合水凝膠的交聯(lián)度越高，其含水量、溶脹率越低；生物活性玻璃的加入，增強(qiáng)了復(fù)合水凝膠的交聯(lián)程度，使復(fù)合水凝膠的含水量、溶脹率下降[20]。

圖5 BG添加量對復(fù)合水凝膠溶脹率的影響

2.3.2 力學(xué)性能 如圖6所示，海藻酸鈉與殼聚糖體積比不同，對復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能影響不同。首先，隨著海藻酸鈉含量的升高、殼聚糖含量的降低，復(fù)合水凝膠壓縮模量先增加后減少，在兩者體積比從19∶1變?yōu)?7∶3的過程中，復(fù)合水凝膠流動性逐漸變?nèi)?，?qiáng)度降低，形狀不夠固定。隨著兩者體積比進(jìn)一步下降，殼聚糖含量增加，分子鏈間作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致復(fù)合水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密[22]，壓縮模量上升。但是，隨著殼聚糖含量進(jìn)一步增加，復(fù)合水凝膠交聯(lián)度過大，脆性進(jìn)一步增強(qiáng)，壓縮模量降低，力學(xué)性能下降。研究表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3時，所得復(fù)合水凝膠的壓縮模量最大，達(dá)到108.05 kPa。

圖6 SA與CS體積比對復(fù)合水凝膠壓縮模量的影響

由圖7可知，海藻酸鈉和殼聚糖體積比17∶3條件下，當(dāng)生物活性玻璃添加量為0時，復(fù)合水凝膠的壓縮模量為18.72 kPa；添加量為0.25 g/mL時，壓縮模量為97.34 kPa，是未添加生物活性玻璃的5倍多；當(dāng)添加量增加到1.00 g/mL時，壓縮模量增加到127.24 kPa，是未添加生物活性玻璃的6倍多。隨著生物活性玻璃添加量的增加，復(fù)合水凝膠的壓縮模量明顯增加。相關(guān)研究表明，生物活性玻璃顆粒耐壓程度較高[20]，可提高水凝膠強(qiáng)度，導(dǎo)致壓縮模量提升。

圖7 BG添加量對復(fù)合水凝膠壓縮模量的影響

2.4 海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝膠抑菌活性

以海洋多糖復(fù)合水凝膠負(fù)載不同量的南極磷蝦抗菌肽，得到一系列海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝膠。研究了抗菌水凝膠其對金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌的抑菌活性，結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。

a—無菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5

a—無菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5

圖10 樣品對金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的抑菌活性

首先，殼聚糖本身對金黃色葡萄球菌具有一定抑菌性，這與殼聚糖分子結(jié)構(gòu)上的自由氨基、羥基的存在有關(guān)。其次，與殼聚糖本身相比，未添加南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖復(fù)合水凝膠對金黃色葡萄球菌的抑制作用稍有降低，但是隨著南極磷蝦抗菌肽含量的增加，產(chǎn)物抑菌活性逐漸增強(qiáng)。當(dāng)南極磷蝦抗菌肽的含量為50 mg/mL時，抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌最大抑菌圈直徑達(dá)25.12 mm；當(dāng)南極磷蝦抗菌肽的含量為40 mg/mL時，抗菌水凝膠對變異鏈球菌最大抑菌圈直徑達(dá)22.02 mm。因此，與復(fù)合水凝膠相比，添加南極磷蝦抗菌肽的抗菌水凝膠的抑菌活性顯著提高，且抑菌活性與南極磷蝦抗菌肽的添加量正相關(guān)。

3 結(jié)論

通過改變海藻酸鈉、殼聚糖、生物活性玻璃的含量可得到性能不同的海洋多糖復(fù)合水凝膠。本研究表明,海藻酸鈉與殼聚糖體積比的變化對復(fù)合水凝膠成膠時間影響較大，生物活性玻璃的添加對成膠時間幾乎無影響。條件篩選發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3、生物活性玻璃添加量為0.50 g/mL時，所得海洋多糖復(fù)合水凝膠的成膠時間最快，約為60 s，含水量為94.11%，溶脹率為44.82%，壓縮模量值為108.05 kPa，成膠性較好。同時，研究發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃有助于復(fù)合水凝膠良好網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，隨著生物活性玻璃含量的增加，所得復(fù)合水凝膠的表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更緊密，分散更均勻，壓縮模量增強(qiáng)。但隨著生物活性玻璃含量的增加，所得復(fù)合水凝膠的含水量、溶脹率呈下降趨勢，這與生物活性玻璃可增強(qiáng)復(fù)合水凝膠的交聯(lián)程度有關(guān)。另外，通過在海藻酸鈉、殼聚糖復(fù)合水凝膠的基礎(chǔ)上負(fù)載具有抑制細(xì)菌活性的南極磷蝦抗菌肽，得到含有南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽復(fù)合抗菌水凝膠，并對其抑制金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，南極磷蝦抗菌肽的添加可有效改善復(fù)合水凝膠對金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌抑制作用，且抑菌活性與南極磷蝦抗菌肽含量正相關(guān)。本研究為新型海洋功能性凝膠類抗菌生物材料的開發(fā)及其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。