4種海藻提取液對決明子種子萌發(fā)及生長的影響*

劉艷紅，李雪兵，張 慧，潘 晨，王楚楚，陳 蕊，吳海龍

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

0 引言

決明子(CatsiatoraLinn)，又名草決明，豆科決明屬，其水提物富含萘并吡喃酮類、蒽醌類、萘酚類化合物。決明子具有清肝明目、降血壓、降血脂、潤腸通便、抗氧化等作用，在食用和藥用方面都有較高的價(jià)值[1-5]。目前，野生決明子資源已不能滿足人們的生產(chǎn)生活需求，而人工種植又存在化肥農(nóng)藥濫用的問題，已有研究發(fā)現(xiàn)決明子中檢測出18種重金屬及有害元素[6]。因此，建立一種環(huán)?？沙掷m(xù)的綠色生態(tài)決明子種植方式顯得尤為必要。

大型海藻是海洋植物區(qū)系的主要組成部分，其提取物中富含微量元素及大量營養(yǎng)元素、多糖、蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、多酚、植物激素和滲透劑，海藻種類及其生長的季節(jié)、地點(diǎn)等環(huán)境因素不同，各成分含量也不同[7-8]。目前，海藻已被認(rèn)定為生物刺激劑來源之一。生物刺激劑是指生物來源的、能夠提高植物生產(chǎn)力的配方產(chǎn)品。按原材料來源不同，生物刺激劑來源可分為細(xì)菌、真菌、藻類、高等植物、動(dòng)物原材料及含腐殖質(zhì)原料。已經(jīng)被證實(shí)可用作生物刺激劑來源的藻類有小球藻、江蘺、海帶和馬尾藻等[9]。生物刺激劑能夠?qū)χ参锷L產(chǎn)生多種有益作用，如促進(jìn)白花丹種子萌發(fā)和生根，研究表明，添加2.5%海藻提取物處理的白花丹(PlumbagozeylanicaL.)每芽根數(shù)、平均根長分別增加1.34倍、1.49倍[10]。海藻提取物也能提高植物整體生長和生產(chǎn)力，在番茄種植中施用海藻提取物的研究表明，番茄花數(shù)、花序數(shù)、花果比顯著增加，果實(shí)數(shù)和大小明顯增加[11-12]。有研究表明，海藻提取物能夠有效提高作物抵抗生物和非生物環(huán)境因子脅迫的能力，如威氏馬尾藻提取物對嚴(yán)重危害棉花作物的害蟲紅棉球絳蟲(Dysdercuscingulatus)具有顯著的殺蟲活性；在鹽分和干旱脅迫下，對不同小麥品種進(jìn)行褐藻提取物處理，能夠促進(jìn)小麥根系長度、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和組織含水量增加[13-14]?？梢钥闯?，將大型海藻提取物應(yīng)用于種植業(yè)能有效提升作物抗逆性,提高產(chǎn)量并改善品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)生態(tài)種植。

大型海藻提取物在中藥種植上的研究和應(yīng)用目前還較少，其使用效果和作用機(jī)制尚不完全清楚。本文以4種經(jīng)濟(jì)海藻干品為材料，研究其提取物對決明子種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，旨在建立一種環(huán)境友好型決明子種植方式，為大型海藻資源化利用及決明子生態(tài)化種植提供數(shù)據(jù)資料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

決明子種子購自河北保定安國市萬草同源苗木花卉有限公司基地，選擇飽滿、大小基本一致的決明子種子作為研究對象。以大型海藻干品為海藻提取液材料來源，包括龍須菜、海帶、紫菜和裙帶菜，分別產(chǎn)自福建莆田、福建霞浦、江蘇連云港和遼寧大連。實(shí)驗(yàn)所用海藻肥為康樸凱普克有機(jī)水溶肥料。

將決明子種子置于直徑9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。于口徑6.5 cm、深6.5 cm的21孔育苗盤中進(jìn)行決明子幼苗培育，栽培基質(zhì)為草炭、蛭石、椰糠屑、有機(jī)質(zhì)、腐殖酸、珍珠巖組成的有機(jī)營養(yǎng)土。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻提取液的制備及物理屬性測定 將采集的海藻樣品用清水沖洗干凈，再用純水清洗3次，置于70 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量不變，將干燥后的海藻于破壁機(jī)中打碎成粉末狀海藻粉。將100 g海藻粉加入1 000 mL 體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇中，使用超聲波清洗機(jī)超聲提取2 h, 4 ℃條件下放置24 h；于高速離心機(jī)4 250 r/min離心15 min，取上清液用Whatman 1號濾紙過濾。下層粉末殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛∫淮?，合并兩次提取濾液。將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至100 mL，得到1 g/mL的海藻提取液，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%海藻提取液。再依次梯度稀釋得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%，0.20%，0.10%，0.05%的海藻提取液，于4 ℃冷藏，備用。使用EutechTMCyberScan PCD 650多參數(shù)測量儀測定各濃度海藻提取液的pH及電導(dǎo)率。

1.2.2 萌發(fā)指數(shù)測定 將挑選的決明子種子用有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，再用純水清洗3～4次。將處理好的決明子種子置于墊兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿提前清洗，并經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌、烘箱烘干。每個(gè)培養(yǎng)皿放置種子100粒，分別加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%,0.20%,0.10%,0.05%的海藻提取液及純水和海藻肥，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間，每天視蒸發(fā)量對各處理組補(bǔ)充相同體積的培養(yǎng)液，確保每粒種子表面濕潤，每3天換一次濾紙。培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)箱中晝夜溫度25 ℃/20 ℃，光周期14 h/10 h，光強(qiáng)100 μmol/(m2·s)。

每天固定時(shí)間記錄種子發(fā)芽情況，以連續(xù)48 h種子發(fā)芽粒數(shù)不再增加視為種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束。測定發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率，相關(guān)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，

其中,Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×單株質(zhì)量(g)；

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽個(gè)數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.3 生長指數(shù)測定 決明子種子于海藻提取液中浸泡24 h后種于育苗盤，每天用對應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的處理液澆灌2次，每株10 mL，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為3個(gè)穴盤，隨機(jī)排列。實(shí)驗(yàn)開始兩周后，每個(gè)處理選取5株長勢一致的決明子幼苗進(jìn)行以下指標(biāo)的測定。鮮質(zhì)量(g)：將決明子幼苗從栽培基質(zhì)拔出，用毛刷輕輕清除根部表面泥土，用電子天平秤質(zhì)量；株高(cm)：直尺測量從露地幼苗直立時(shí)幼苗頂部到根部的距離；主根長(cm)：游標(biāo)卡尺測量根莖到主根根尖的距離。

取質(zhì)量為0.1 g的鮮決明子幼苗葉片置于5 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中，4 ℃避光保存48 h提取光合色素[15]。葉綠素a(Chl a)含量和類胡蘿卜素(Car.)含量通過測定葉片在470，665，652 nm處吸光度(A470，A665，A652)來計(jì)算，公式如下：

葉綠素a含量=13.95×A665-6.88×A652，

類胡蘿卜素含量=

稱取新鮮決明子幼苗葉片0.1 g,加入5 mL磷酸緩沖液(pH=6.8)，研磨至勻漿，5 000g離心15 min。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)法測定決明子幼苗葉片蛋白質(zhì)含量[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行整理和初步分析，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和沃勒-鄧肯檢驗(yàn)，顯著性水平P<0.05。對海藻提取液處理的決明子種子萌發(fā)及生長數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用Origin軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻提取液物理屬性

4種海藻提取液的部分物理屬性見表1。龍須菜提取液、海帶提取液、紫菜提取液和裙帶菜提取液顏色分別為淡黃、灰綠、深紫和翠綠。隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，其pH整體呈上升趨勢；電導(dǎo)率呈倍數(shù)增加趨勢，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液中裙帶菜提取液電導(dǎo)率最高，龍須菜提取液電導(dǎo)率最低。

表1 各質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液的顏色、pH和電導(dǎo)率對比

2.2 海藻提取液對決明子種子萌發(fā)指數(shù)的影響

由表2可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的龍須菜提取液、海帶提取液、紫菜提取液和裙帶菜提取液均提高了決明子種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，決明子種子的發(fā)芽勢整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。各質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液處理組較對照組而言，均對決明子發(fā)芽勢有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。0.20%龍須菜提取液、0.10%海帶提取液、0.20%紫菜提取液和0.20%裙帶菜提取液處理的決明子發(fā)芽勢最高，分別達(dá)30.33%，23.67%，30.30%和31.70%。海藻肥處理的決明子種子發(fā)芽勢顯著高于空白對照組，但顯著低于0.20%龍須菜提取液、0.20%紫菜提取液和0.05%～0.20%裙帶菜提取液處理組(P<0.05)。

表2 4種海藻提取液對決明子種子萌發(fā)的影響

2.3 海藻提取液對決明子種子生長指數(shù)的影響

4種海藻提取液對決明子種子生長指數(shù)的影響見圖1，各提取液對決明子幼苗鮮質(zhì)量的影響不同。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5)，小寫字母表示同一列數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。下圖同。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海帶提取液處理的決明子幼苗鮮質(zhì)量顯著高于對照組及海藻肥處理組(P<0.05)，其中0.40%海帶提取液處理的幼苗鮮質(zhì)量最高。龍須菜提取液處理組中，0.05%和0.10%處理組的幼苗質(zhì)量顯著高于其他組，0.40%處理組最低。裙帶菜提取液處理組中，0.20%處理組顯著高于其他組(P<0.05)。紫菜提取液處理組中，0.10%，0.20%，0.40%處理能顯著提高幼苗鮮質(zhì)量(P<0.05)。

海藻提取液處理后，決明子幼苗株高、根長情況如圖2所示。海帶提取液處理組幼苗株高較空白組和海藻肥處理組顯著提高，但各質(zhì)量分?jǐn)?shù)間無顯著差異。龍須菜、裙帶菜和紫菜提取液處理組的幼苗株高較空白組無顯著差異。0.05%和0.40%海帶提取液處理的幼苗根長顯著高于空白對照組和海藻肥處理組(P<0.05)，其余處理組幼苗根長較對照組和海藻肥處理組無顯著差異。

a 株高

隨著提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，決明子幼苗葉片的類胡蘿卜素含量呈先上升后下降趨勢(見圖3)。0.10%海帶提取液處理組幼苗葉片的類胡蘿卜素含量顯著高于空白對照組和海藻肥處理組，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海帶提取液處理間無顯著差異。0.05%和0.10%裙帶菜提取液處理組的類胡蘿卜素含量最高，海藻肥處理組類胡蘿卜素含量顯著低于其他組。

圖3 4種海藻提取液對決明子幼苗葉片類胡蘿卜素含量的影響

紫菜提取液處理組的決明子幼苗葉片葉綠素a含量隨著提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(見圖4)。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)裙帶菜提取液處理組的葉綠素a含量無顯著差異。0.20%和0.40%龍須菜提取液處理組的葉綠素a含量顯著高于0.05%和0.10%龍須菜海藻提取液處理組(P<0.05)。0.40%海帶提取液處理組葉綠素a含量高于其他海帶提取液處理組，但與空白對照組和海藻肥處理組無顯著差異。

圖4 4種海藻提取液對決明子幼苗葉片葉綠素a含量的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液對決明子幼苗葉片蛋白含量的影響結(jié)果(見圖5)與葉綠素a的影響規(guī)律相似。紫菜提取液處理組的蛋白含量隨提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。0.10%裙帶菜提取液處理組的蛋白含量最高。0.20%和0.40%龍須菜海藻提取液處理組的蛋白含量顯著高于0.05%和0.10%龍須菜海藻提取液處理組(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

大型海藻含有豐富的碳水化合物、含氮化合物、色素、脂類化合物、酚類化合物、維生素和海藻藥類以及無機(jī)成分等，化學(xué)組成復(fù)雜[17]。有研究表明，紅藻提取液中包含了69種化合物，包括植物生長激素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等[18]。海藻及其提取物中存在有益植物生長的無機(jī)養(yǎng)分、胺類和吲哚類化合物等。在植物有效成分提取過程中，利用提取液顯示電信號的特點(diǎn)，通過電導(dǎo)率測定能夠反映提取液中有效成分的含量，電導(dǎo)率越高，有效成分含量越高[19]。作物生長的提高是海藻提取液中多種成分交互作用的結(jié)果，分餾出的單一組分并不能有效促進(jìn)生長[12]?；诖?，本研究對4種海藻提取液的pH和電導(dǎo)率進(jìn)行了測定，結(jié)果表明不同海藻提取液的電導(dǎo)率差異明顯，從高到低依次為裙帶菜提取液、海帶提取液、龍須菜提取液和紫菜提取液，電導(dǎo)率最高的裙帶菜提取液在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下較其他海藻提取液對決明子種子發(fā)芽勢的提升作用最為明顯，表明裙帶菜提取液可能存在較高的提高決明子種子發(fā)芽勢的有效成分。而在電導(dǎo)率較高的海帶提取液的處理下，決明子幼苗的株高和根長提高最為顯著，表明海帶提取液中可能存在較多促?zèng)Q明子幼苗生長的組分。

海藻提取液中有效成分促進(jìn)作物種子萌發(fā)和幼苗生長的過程較為復(fù)雜，并與海藻提取液的濃度密切相關(guān)。種子萌發(fā)過程中，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下，一系列蛋白質(zhì)、酶的代謝受到調(diào)控，如可刺激植物生長和發(fā)育的赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素等，這些植物激素與種子的萌發(fā)過程息息相關(guān)[20]。海藻提取液對決明子種子的引發(fā)目的在于促進(jìn)發(fā)芽前代謝活性，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)活性，并加速膜修復(fù)，表現(xiàn)為發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)和發(fā)芽率的提高[21]。本研究結(jié)果表明，所用海藻提取液均能提高決明子的發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)率的提高。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度海藻提取液能夠提高決明子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，而隨著海藻提取液濃度的提高，其作用效果先增加進(jìn)而降低。本研究結(jié)果與前人關(guān)于海藻提取液對番茄生長促進(jìn)效應(yīng)的研究結(jié)果一致。在對番茄的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%)的海藻提取物處理的種子發(fā)芽率較高，平均發(fā)芽時(shí)間較短，發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢較高，因此幼苗活力較高，胚芽和胚根長度較長[22]。綜上，不同海藻種類和不同濃度對作物種子萌發(fā)的作用效應(yīng)不同。

本研究發(fā)現(xiàn)海藻提取液能夠有效提高決明子幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長，這與前人關(guān)于大豆、谷物和野芝麻菜研究的作用效果一致。對大豆的研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的海藻提取物處理均提高了大豆的株高、葉片數(shù)、分枝數(shù)和鮮質(zhì)量等指標(biāo)[23]；對谷物的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度江蘺提取物可顯著提高其種子發(fā)芽率，促進(jìn)植株生長[24]。本研究結(jié)果表明，不同海藻對決明子幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長的影響不同，其中海帶提取液效果較好，這可能是由于褐藻海帶比紅藻和綠藻含有更多的多酚。有研究表明褐藻門墨角藻(FucusvesiculosusL.)總酚含量最高，綠藻門石莼(UlvalactucaL.)總酚含量約為墨角藻的1/24，而紅藻門角叉菜(Chondruscrispus)總酚含量僅為墨角藻的1/60[7]。對野芝麻菜的研究發(fā)現(xiàn)，在中等濃度的海藻提取物處理下野芝麻菜產(chǎn)量最高(1.99 kg/m2)，且含大量的葉綠素、類胡蘿卜素、酚類化合物、類黃酮和總營養(yǎng)素[25]。

綜上所述，海藻提取液能夠有效促進(jìn)決明子種子的萌發(fā)和決明子幼苗的生長，且能提高類胡蘿卜素等色素含量，但不同種海藻提取液對決明子種子萌發(fā)及幼苗生長的影響不同。紫菜提取液提高決明子種子萌發(fā)效果最好，而海帶提取液能夠顯著提高決明子幼苗的株高和根長。同一種海藻提取液中，不同濃度海藻提取液產(chǎn)生的效果也不相同，低濃度海藻提取液能有效促進(jìn)決明子種子萌發(fā)和幼苗生長，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.20%的海藻提取液促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好，隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，決明子種子萌發(fā)和幼苗生長整體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。