海帶中抑藻活性化合物的分離及抑藻活性分析

孫穎穎 ，朱文軒 ，周靜，莊麗雯，毛奕淋，趙秀芳，王長(zhǎng)海

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222000；4.連云港市質(zhì)量技術(shù)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222005；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

1 引言

赤潮已成為三大世界性近海污染問(wèn)題之一，對(duì)近海水域生態(tài)環(huán)境和海洋養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的威脅[1-2]。報(bào)道表明，在300 多種可形成赤潮的海洋浮游微藻中，超過(guò)70 種能產(chǎn)生毒素[3]，藻毒素導(dǎo)致了魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)和其他海洋生物的大量死亡[1]，也會(huì)引發(fā)人類(lèi)疾病，甚至導(dǎo)致死亡。國(guó)內(nèi)外研究者提出了許多預(yù)防和控制赤潮的方法（Prevent and Control HABs Methods，PCM），包括物理法（黏土[4]）、化學(xué)法（表面活性劑[5]）、生物法（病毒[6]、細(xì)菌[7]和殺藻[8]或抑藻化合物[3,9]）等。

近30 年來(lái)，分離自大型海藻的一些抑藻活性化合物，被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型赤潮微藻抑藻劑的理想材料之一[10-11]。例如，小珊瑚藻（Corallina pilulifera）中的溴仿[12]、江蘺（Gracilaria lemaneiformis）中的8-hydroxy-4E 和6E-octadien-3-on[13]、網(wǎng)地藻（Dictyota dichotoma）中的Dictyolactone[14]、葉狀鐵釘菜（Ishige sinicola）中的α-單甘酯[15]以及條斑紫菜（Porphyra yezoensis）中的gossonorol[16]等。在前期工作中，我們整理了1960-2019 年被Web of Science、Springer、Google Scholar 和CNKI 等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的大型海藻抑藻研究，發(fā)現(xiàn)120 多種可抑制赤潮微藻生長(zhǎng)的大型海藻中，大型褐藻為40 種[10]，它們依次歸屬于網(wǎng)地藻目（Dictyotales）、水云目（Ectocarpales）、墨角藻目（Fucales）、鐵釘菜目（Ishigeales）、海帶目（Laminariales）和線翼藻目（Tilopteridales）（圖1）。其中，海帶目的大型褐藻占20%，例如，腔昆布（Ecklonia cava）[17]、鵝掌菜（Ecklonia kurome）[18]、Eckloniopsis radicosa[15]、籠目海帶或日本厚葉海帶（Kjellmaniella crassifolia）[19]、海帶（Laminaria japonica）[19-22]、掌狀昆布（Laminaria digitata）[20]、皺海帶（Laminaria religiosa）[23]、裙帶菜（Undaria pinnatifida）[21]。

圖1 可抑制赤潮微藻的大型褐藻的目類(lèi)歸屬分布Fig.1 Distribution of brown marine macroalgae with antialgal activity against red tide microalgae according the orders

不同研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海帶（L.japonica）對(duì)某些海洋微藻具有一定的抑藻活性[19-22]，李鳳超[19]對(duì)海帶中防污物質(zhì)進(jìn)行了初步分離和鑒定。然而，目前為止，并未見(jiàn)抑藻活性化合物從海帶中分離獲得?；诖?，本文采用活性追蹤分離方法，以米氏凱倫藻為抑藻檢測(cè)對(duì)象，從海帶中分離抑藻活性化合物。進(jìn)一步，分析它們對(duì)塔瑪亞歷山大藻（Alexandriumtamarense）、強(qiáng)壯前溝藻（Amphidinium carterae）、赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）、米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）、球形棕囊藻（Phaeocystis globsa）和中肋骨條藻（Skeletonema costatum）生長(zhǎng)的抑制作用，獲得每種化合物對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的半抑制效應(yīng)濃度（EC50～96h），為環(huán)境友好型赤潮微藻抑藻劑的研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

塔瑪亞歷山大藻、強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻無(wú)菌株由上海光語(yǔ)生物科技有限公司提供，在f/2 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（22±2）℃，光照強(qiáng)度為40 μmol/（m2·s），光暗比為12 h∶12 h。

天然海水靜置1 個(gè)月以上，經(jīng)脫脂棉和300 目篩絹過(guò)濾，高溫滅菌、冷卻，使用前將pH 和鹽度分別調(diào)節(jié)至8.5 和30 備用。

海帶半干品購(gòu)置于江蘇碧藍(lán)海洋生物科技有限公司，自來(lái)水清洗后，室內(nèi)自然晾曬2 d。50℃下烘干后，粉碎至0.3 mm 粒徑備用。

2.2 抑藻活性化合物的分離純化

2.2.1 提取

將海帶干粉末2 000 g 和6 L 甲醇加入到動(dòng)態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)（TX-NX-10）中，在30℃下浸提6 h。上述浸提過(guò)程重復(fù)3 次，合并浸提液。浸提液經(jīng)過(guò)濾和減壓蒸干，得到黑色黏稠狀浸膏68.22 g。向此浸膏中加入90%甲醇水溶液300 mL，充分振蕩，4℃下靜置過(guò)夜，4℃下離心10 min、過(guò)濾，去除沉淀，獲得上清液280 mL。60℃下減壓蒸干后，溶解于蒸餾水中，配制濃度為80 g/L 溶液（提取物溶液）進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)和液液萃取分離。抑藻活性檢測(cè)時(shí)，提取物濃度依次設(shè)定為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL和16.0 mg/mL。

2.2.2 液液萃取分離

將乙酸乙酯加入到上述提取物溶液中，萃取3 次，乙酸乙酯加入體積依次為60 mL、20 mL 和20 mL。乙酸乙酯層合并收集后，然后在40℃下減壓蒸干，獲得2.58 g 組分A。下層40℃下減壓蒸發(fā)除去乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3 次，正丁醇加入體積依次為60 mL、20 mL 和20 mL。上層和下層均在60℃下減壓蒸干，分別獲得2.23 g 組分B 和11.34 g 組分C。上述3 種液液萃取分離組分，分別溶解于無(wú)水甲醇中，制備濃度為20 g/L 的溶液進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)（液液萃取分離組分濃度設(shè)定為2 mg/mL）和硅膠柱層析分離。

2.2.3 硅膠柱層析分離

組分B 加載于硅膠柱（200～300 目，3.0 cm×40 cm）上，以氯仿和甲醇（體積比為1∶5，以下均為體積比）為洗脫液，流速為1.0 mL/min，每管接收餾分10 mL。組分C 采用硅膠層析柱（200～300 目，5.0 cm×80 cm）進(jìn)行分離，氯仿和甲醇（1∶5）為洗脫液，流速為1.0 mL/min，每管接收餾分20 mL。洗脫2 倍柱體積后，所得餾分40℃下減壓濃縮，進(jìn)行硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，展開(kāi)劑為氯仿和甲醇（1∶10）。合并相同餾分后，40℃下減壓蒸干除去溶劑，獲得再分組分B1和B2、再分組分C1、C2和C3。上述5 個(gè)組分分別稱(chēng)取10 mg，依次溶解于1 mL 甲醇溶液中，配制濃度為10 g/L 的溶液。進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)時(shí)，再分組分濃度設(shè)定為1.0 mg/mL。結(jié)果表明，3 個(gè)再分組分（B1、B2和C2）對(duì)米氏凱倫藻具有較為明顯的抑藻活性。

2.2.4 Sephadax LH-20 凝膠柱層析分離

將上述3 個(gè)再分組分分別加載于Sephadax LH-20 凝膠層析柱上（2.0 cm×25 cm），均以甲醇為洗脫液。洗脫2 倍柱體積后，所得餾分40℃下減壓濃縮，經(jīng)硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，合并、減壓蒸干后，依次獲得凝膠分離組分B11、B12、B13、B21（0.56 g）、C21和C22。將它們分別稱(chēng)取5 mg，溶解于0.5 mL 甲醇中，進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)，濃度設(shè)定為0.25 mg/mL。結(jié)果表明，凝膠分離組分B13、B21和C21顯著地抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)（其中，B21已經(jīng)完成分離純化）。

2.2.5 薄層層析純化制備

采用劃線法將凝膠分離組分B13和C21加載于硅膠薄層層析預(yù)制板（100 mm×200 mm）上，分別以石油醚和乙酸乙酯（1∶2）及氯仿和甲醇（4∶1）為展開(kāi)劑。經(jīng)展開(kāi)，凝膠分離組分B13和C21分別在硅膠預(yù)制板上呈現(xiàn)2 個(gè)清晰且相距較明顯的條帶。將相應(yīng)條帶分別刮下收集，用丙酮浸泡，過(guò)濾和減壓蒸干后，制備得到樣品B131（0.24 g）、B132（0.19 g）、C211（0.008 g）和C212（0.011 g）。適量稱(chēng)取5 個(gè)樣品，分別溶解于甲醇溶液后，點(diǎn)樣于硅膠GF254上，依次以氯仿和甲醇（1∶1）、環(huán)己烷和乙酸乙酯（1∶2）及正丁醇和醋酸和水（1∶1∶0.5）為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)此5 個(gè)樣品均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)；同時(shí)，采用通用型顯色劑（10%硫酸溶液和碘）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們同樣呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明純度達(dá)到了薄層純。抑藻活性檢測(cè)時(shí)，樣品濃度設(shè)定為0.25 mg/mL。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用高分辨電噴霧質(zhì)譜（HR-ESI-MS）和核磁共振譜（1H-NMR 和13C-NMR）鑒定樣品結(jié)構(gòu)。LTQObitrap XL 光譜儀測(cè)定HR-ESI-MS，Bruker AV Ⅲ 600質(zhì)譜儀測(cè)定NMR（四甲基硅烷（TMS）為標(biāo)準(zhǔn)品）。

2.4 抑藻活性

2.4.1 分離純化過(guò)程中抑藻活性檢測(cè)

在分離純化過(guò)程中，以米氏凱倫藻為抑藻活性測(cè)試微藻，接種細(xì)胞數(shù)量為（10～12）×104cells/mL。將待測(cè)組分溶解于甲醇后，移取1 μL 到微藻培養(yǎng)體系（米氏凱倫藻1 mL+f/2 培養(yǎng)基9 mL），終濃度按照以上相應(yīng)分離過(guò)程進(jìn)行設(shè)定。對(duì)照組為10 mL 培養(yǎng)體系中加入1 μL 甲醇，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個(gè)平行樣。所有培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為（22±2）℃，光照強(qiáng)度為62 μmol/(m2·s)，光暗比為12 h∶12 h，培養(yǎng)10 d。

2.4.2 抑藻化合物對(duì)赤潮微藻的抑藻活性分析

將化合物（市售，分析純）溶解于甲醇溶液，配制濃度為250mg/mL，再依次稀釋為50mg/mL、10mg/mL和2mg/mL。分別量取1μL上述溶液，加入到4999μL培養(yǎng)體系中（赤潮微藻500μL+f/2培養(yǎng)基4499μL），化合物終濃度依次為50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL和0.4μg/mL。塔瑪亞歷山大藻、強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻的起始細(xì)胞數(shù)量分別為（8～10）×104cells/mL、（20～24）×104cells/mL、（8～11）×104cells/mL、（10～14）×104cells/mL、（45～49）×104cells/mL 和（26～29）×104cells/mL。對(duì)照組為4 999 μL 培養(yǎng)體系中加入1 μL 甲醇溶液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個(gè)平行樣。同時(shí)，設(shè)定相同濃度的硫酸銅作為陽(yáng)性對(duì)照組。所有培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d，其他培養(yǎng)條件同2.4.1 節(jié)。同時(shí)，顯微鏡下（×400）觀察藻細(xì)胞形態(tài)。

2.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

每日取樣，計(jì)數(shù)赤潮微藻細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算抑藻劑對(duì)赤潮微藻的生長(zhǎng)抑制率（I），計(jì)算公式為

式中，N為處理組藻細(xì)胞數(shù)量；N0為對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)量。

采用文獻(xiàn)[24]的方法計(jì)算硫酸銅和化合物對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h。

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05 為顯著性差異，p＜0.01 為極顯著性差異。

3 結(jié)果和分析

3.1 海帶中抑藻活性化合物活性追蹤的分離純化

3.1.1 海帶提取物對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響

從圖2 可以看出，隨濃度增加，海帶提取物對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的抑制作用明顯增強(qiáng)（p＜0.05）。當(dāng)濃度為8.0 mg/mL 時(shí)，提取物對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率為56.2%（第10 天）。結(jié)果表明，海帶提取物具有明顯抑制米氏凱倫藻的抑藻活性，需要進(jìn)行后續(xù)分離。

圖2 海帶甲醇提取物對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of the methanol extracts of Laminaria japonica on the growth of Karenia mikimotoi

3.1.2 液液萃取分離組分對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響

在圖3 中，組分B 和組分C 明顯抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)（p＜0.05）。第10 天時(shí)對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)76%。因此，將組分B 和組分C 進(jìn)行硅膠柱層析分離。

圖3 液液萃取分離組分對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of several liquid-liquid extraction components from the methanol extracts on the growth of Karenia mikimotoi

3.1.3 硅膠柱層析和Sephadax LH-20 凝膠柱層析分離組分以及薄層層析純化樣品對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響

由表1 可知，組分B 和組分C 經(jīng)硅膠柱層析分離后，得到5 個(gè)再分組分。抑藻活性檢測(cè)表明，再分組分B1、B2和C2對(duì)米氏凱倫藻具有明顯的抑藻活性（p＜0.05）。

將上述3 個(gè)再分組分B1、B2和C2分別進(jìn)行Sephadax LH-20 凝膠柱層析分離，組分B1分離為B11、B12和B13；組分B2分離為B21；組分C2分離為C21和C22（表1）。在6 個(gè)組分中，B13、B21和C21均對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用（p＜0.05），其中B21薄層層析檢測(cè)顯示僅有1 個(gè)斑點(diǎn)。隨后，將B13和C21進(jìn)行硅膠薄層層析制備，

經(jīng)薄層層析純化制備，得到4 個(gè)樣品，B131、B132、C211和C212（表1）。濃度為0.05 mg/mL 時(shí)，它們對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑藻活性（p＜0.05）。

表1 組分B 和組分C 的分離純化過(guò)程中抑藻活性檢測(cè)Table 1 Antialgal activity test of the fractions B and C in the isolation and purification process

綜上，采用一系列分離方法，從海帶中純化到對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)具有抑制作用的活性化合物，分離純化具體過(guò)程見(jiàn)圖4。

圖4 海帶中抑藻活性化合物的分離純化Fig.4 Isolation and purification of the antialgal compounds from Laminaria japonica

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

樣品B131，無(wú)色粉末。1H-NMR (600 MHz,DMSOd6)δH:3.51 (2H,t,J=6.0 Hz,H-7)；13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC：177.2 (C-11)、41.8 (C-2)、23.4 (C-3)、30.4(C-4)、30.2 (C-5)、36.8 (C-6)、63.5 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]基本一致，故鑒定樣品B131為7-羥基庚酸。

樣品B132，無(wú)色粉末。1H-NMR (600 MHz,DMSOd6)δH:0.88 (3H,t,J=6.6 Hz,H-14)、2.35 (2H,m,H-2)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:177.9 (C-1)、33.8 (C-2)、24.9 (C-3)、29.2 (C-4)、29.4 (C-5)、29.9 (C-6)、29.7(C-7)、29.6 (C-8)、31.4 (C-9)、29.5 (C-10/11)、32.1 (C-12)、22.8 (C-13)、14.3 (C-14)。這些數(shù)據(jù)與十四酸的光譜數(shù)據(jù)基本一致[26]，因此，將樣品B132鑒定為十四酸。

樣品B21，白色粉末。1H-NMR (600 MHz,DMSOd6)δH:2.32 (2H,t,J=7.8 Hz,H-2)、1.63 (2H,m,H-3)、0.87 (3H,t,J=7.2 Hz,H-16)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:179.3 (C-1)、34.2 (C-2)、25.1 (C-3)、29.5(C-4)、29.6 (C-5)、29.8～30.1 (C-6～12)、29.8 (C-13)、32.3 (C-14)、23.1 (C-15)、14.5 (C-16)。樣品B21的核磁共振譜的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]基本一致，因此，鑒定其為十六酸。

樣品C211（白色蠟狀固體），1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:2.31 (2H,t,J=7.8 Hz,H-2)、1.63 (2H,m,H-3)、1.28 (28H,m,H-4～H-17)、0.88 (3H,t,J=7.2 Hz,H-18)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:177.1 (C-1)、34.0 (C-2)、31.9 (C-16)、29.1～29.7 (C-4～C-15)、24.7(C-3)、22.7 (C-17)、14.5 (C-18)。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]一致，故將樣品C211鑒定為十八酸。

樣品C212，無(wú)色油狀物。1HNMR (600 MHz,MeOD)δH:0.86 (3H,t,J=6.6 Hz,H-18)、1.23 (8H,m,m,H-4～H-7)，1.24 (20H,m,H-12～H-17)、1.61 (2H,m,H-3)、1.94(4H,m,H-8,11)、2.33 (2H,t,J=7.2 Hz,H-2)、5.28 (2H,dd,J=8.4,5.4 Hz,H-9,H-10)。以上數(shù)據(jù)與油酸的核磁共振譜數(shù)據(jù)基本一致[29]。

3.3 5 種化合物對(duì)6 種赤潮微藻的抑藻活性分析

在圖5 中，5 種化合物對(duì)6 種赤潮微藻生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的選擇性抑制作用，其中7-羥基庚酸表現(xiàn)出最為強(qiáng)烈的抑制作用（p＜0.05），且這種抑制作用隨著濃度的增加而明顯增強(qiáng)（p＜0.05）。第4 天，在濃度為50 μg/mL 時(shí)，7-羥基庚酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻、強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)抑制率分別為53.3%、84.3%、71.2%、72.3%、74.4%和87.5%；十四酸明顯地抑制了強(qiáng)壯前溝藻、米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)（p＜0.05），在濃度50 μg/mL 時(shí)，對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)52%（第4 天）；十六酸僅明顯抑制了強(qiáng)壯前溝藻的生長(zhǎng)（p＜0.05），對(duì)強(qiáng)壯前溝藻的生長(zhǎng)抑制率為52.5%（50 μg/mL，第4 天），對(duì)其他5 種赤潮微藻的生長(zhǎng)抑制率低于40%；十八酸和油酸對(duì)6 種赤潮微藻沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)抑制作用（p＞0.05），在濃度為50 μg/mL 時(shí)，對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制率低于40%。

圖5 不同化合物對(duì)6 種赤潮微藻生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of the different compounds against six species of red tide microalgae

進(jìn)一步，計(jì)算得出了7-羥基庚酸等5 種脂肪酸對(duì)6 種赤潮微藻生長(zhǎng)的半抑制效應(yīng)濃度（EC50～96h）（表2）。硫酸銅和重鉻酸鉀是藻類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)中常用的陽(yáng)性對(duì)照組，硫酸銅對(duì)6 種赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h在表2列出，由前期研究可知，重鉻酸鉀對(duì)強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻生長(zhǎng)的EC50～96h依次為3.9 μg/mL、36 μg/mL、16 μg/mL、38 μg/mL 和2.7 μg/mL[9,30]。除十四酸、十六酸和十八酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)的EC50～96h已被報(bào)道[31]，7-羥基庚酸等5 種脂肪酸和硫酸銅對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h是第一次被明確。在本文中，十四酸和十六酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)的EC50～96h與已有報(bào)道非常接近[31]，但十八酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)的EC50～96h與已有報(bào)道相差很大[31]，具體原因目前還在分析中。

國(guó)際經(jīng)合組織（OECD）指出，當(dāng)EC50～96h分別為小于1 μg/mL、1～10 μg/mL、10～100 μg/mL 和大于100 μg/mL時(shí)，化合物對(duì)藻類(lèi)具有極高毒性、高毒性、中等毒性和極低毒性[32]。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，7-羥基庚酸、十四酸和十六酸對(duì)6 種赤潮微藻具有中等或高等毒性，其中7-羥基庚酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻和強(qiáng)壯前溝藻、十四酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻均為高毒性。與重鉻酸鉀對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h比較，7-羥基庚酸和十四酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻和球形棕囊藻生長(zhǎng)的EC50～96h更小，十六酸對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的EC50～96h更小，這表明7-羥基庚酸和十四酸在抑制強(qiáng)壯前溝藻等4 種赤潮微藻、十六酸在抑制米氏凱倫藻上比重鉻酸鉀更具有抑藻優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，從表2 可以看出，7-羥基庚酸和十四酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻的EC50～96h明顯小于硫酸銅對(duì)該赤潮微藻的EC50～96h。綜合來(lái)看，7-羥基庚酸和十四酸在抑制強(qiáng)壯前溝藻上具有明顯優(yōu)于重鉻酸鉀和硫酸銅的抑藻優(yōu)勢(shì)。

表2 不同化合物對(duì)6 種赤潮微藻生長(zhǎng)的半抑制效應(yīng)濃度（EC50～96h，單位：μg/mL）Table 2 Different compounds isolated from Laminaria japonica for the six species of red tide microalgae (EC50-96h，unit：μg/mL)

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在脂肪酸作用下，藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了某些明顯變化。在7-羥基庚酸作用下，強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻和球形棕囊藻細(xì)胞形態(tài)改變見(jiàn)圖6。在圖6 中，能清晰看到強(qiáng)壯前溝藻和赤潮異彎藻細(xì)胞膜模糊、類(lèi)似溶解，橫鞭毛脫落，形狀改變明顯；米氏凱倫藻細(xì)胞破碎；球形棕囊藻細(xì)胞變長(zhǎng)、伴有色素體缺陷等現(xiàn)象。在十四酸和十六酸能明顯抑制的赤潮微藻中，藻細(xì)胞形態(tài)也發(fā)現(xiàn)了這些類(lèi)似的變化。

圖6 7-羥基庚酸對(duì)4 種赤潮微藻細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.6 Effect of 7-hydroxyheptanic acid on the photographs of the four species of red tide microalgae

4 討論

大型海藻是抑制赤潮微藻活性化合物的良好來(lái)源之一[32-35]，某些抑藻活性化合物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定，例如，α-亞麻酸[23,36]、dictyolactone[14]、α-單甘酯[15]、二十二碳酸甲酯[12]等。這些研究表明，大型海藻中抑藻活性化合物結(jié)構(gòu)多樣，包括脂肪酸、萜類(lèi)和其他化合物[12,14-15,23,37-38]。目前，已經(jīng)從葡萄藻（Botryococcus braunii）[14]、褐藻（Cladosiphon okamuranus）[39]、小珊瑚藻（Corallina pilulifera）[39]、江 蘺（Gracilaria lemaneiformis）[13]、裂片石莼（Ulva fasciata）[23]、孔石莼（Ulva pertusa）[9]和滸苔（Ulva prolifera）[40-41]等大型海藻中分離到脂肪酸類(lèi)抑藻活性物質(zhì)（圖1）。在本文，采用抑藻活性追蹤分離方法（圖2 至圖4，表1），第一次從海帶中分離到7-羥基庚酸、十四酸、十六酸、十八酸和油酸（純度為薄層純），其中7-羥基庚酸、十四酸和十八酸是第一次從大型海藻中分離獲得。十六酸已從葡萄藻[34]、江蘺[13]、腸滸苔（Ulva intestinalis）[41]和滸苔[40]中分離得到；在龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）分離到油酸[42]。

目前，脂肪酸對(duì)淡水微藻生長(zhǎng)的抑制作用[43-47]和對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的抑制作用[12,23,31,34-35,39-41,48-49]已有一些研究報(bào)道。在本文中，除塔瑪亞歷山大藻和赤潮異彎藻外，7-羥基庚酸、十四酸、十六酸、十八酸和油酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻生長(zhǎng)的抑制作用是第一次被研究。在脂肪酸對(duì)淡水微藻—分散藻羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）急性毒性研究中，研究者認(rèn)為，脂肪酸的抑藻作用與脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度有關(guān)[47]。尹玉麗[31]指出，飽和脂肪酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)抑制強(qiáng)弱的順序依次為十四酸、十六酸、十八酸。何宗祥和張庭廷[44]及姜聞新等[45]也認(rèn)為，脂肪酸的抑藻作用與脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度有關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)7-羥基庚酸和十四酸的抑藻活性要明顯強(qiáng)于其他3 種脂肪酸的抑藻活性，十六酸、十八酸和油酸僅具有微弱的抑藻活性。然而，十六酸、十八酸和油酸對(duì)試驗(yàn)赤潮微藻的抑藻活性并未有明顯的強(qiáng)弱差異（圖5）。因此，本文研究結(jié)果僅在一定程度上符合“脂肪酸碳鏈越短，抑制作用越強(qiáng)”的說(shuō)法。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在濃度為50 μg/mL 時(shí)，7-羥基庚酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)抑制率與硫酸銅和重鉻酸鉀對(duì)此5 種赤潮微藻的生長(zhǎng)抑制率接近（第4 天，圖3）。

在脂肪酸對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制作用機(jī)理研究中，某些研究者認(rèn)為，脂肪酸主要通過(guò)細(xì)胞膜上離子通道的途徑產(chǎn)生抑制作用[32,50-51]，具體為脂肪酸引起離子通道結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些重要離子，譬如Ca2+流出，致使藻細(xì)胞內(nèi)與這些離子相關(guān)的生理活動(dòng)受到影響，從而引發(fā)藻細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究指出，由于藻細(xì)胞質(zhì)膜中十六酸、亞油酸等脂肪酸含量較高，外加這些脂肪酸時(shí)，它們更易與質(zhì)膜結(jié)合導(dǎo)致其構(gòu)像發(fā)生變化，致使藻細(xì)胞離子通道結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[52]。因此，某些研究指出，脂肪酸對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制作用與試驗(yàn)微藻細(xì)胞的脂肪酸組成有關(guān)系[44-45,49]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸作用下藻細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜模糊、細(xì)胞破碎或色素體缺陷等現(xiàn)象（僅列出7-羥基庚酸作用下藻細(xì)胞形態(tài)的某些改變，圖6），很明顯藻細(xì)胞受到了脂肪酸不同程度的影響。6 種試驗(yàn)赤潮微藻中，除強(qiáng)壯前溝藻脂肪酸組成未見(jiàn)報(bào)道外，其他5 種赤潮微藻中，十六酸含量最高，多數(shù)含有十四酸和十八酸，僅塔瑪亞歷山大藻和赤潮異彎藻含有油酸[53-57]。5 種脂肪酸對(duì)6 種赤潮微藻的抑藻強(qiáng)弱順序?yàn)?-羥基庚酸、十四酸、十六酸、十八酸、油酸，根據(jù)本文現(xiàn)有結(jié)果尚無(wú)法確定本文試驗(yàn)的赤潮微藻脂肪酸組成與脂肪酸對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制作用之間的關(guān)系，還需要在后續(xù)工作中進(jìn)行研究。

表2 表明，7-羥基庚酸、十四酸和十六酸對(duì)6 種試驗(yàn)赤潮微藻具有中等或高等毒性，其中7-羥基庚酸和十四酸對(duì)試驗(yàn)的赤潮微藻具有更為強(qiáng)烈的毒性。與硫酸銅和重鉻酸鉀對(duì)試驗(yàn)赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h相比，7-羥基庚酸和十四酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻生長(zhǎng)的EC50～96h影響更小。這就表明，在抑制強(qiáng)壯前溝藻上，7-羥基庚酸和十四酸更具有抑藻優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，與以往研究相比[9-10,16]，7-羥基庚酸對(duì)強(qiáng)壯前溝藻生長(zhǎng)的EC50～96h不僅小于孔石莼、條斑紫菜和江蘺中分離到的抑藻活性化合物對(duì)該種赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h，而且也小于硫酸銅和重鉻酸鉀對(duì)強(qiáng)壯前溝藻生長(zhǎng)的EC50～96h。硫酸銅和重鉻酸鉀能迅速殺死赤潮微藻，然而，它們對(duì)非赤潮微藻的殺滅或抑制作用，會(huì)影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。7-羥基庚酸作為海帶生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物，在自然條件下能降解，不會(huì)長(zhǎng)期積累，生態(tài)安全性好，可替代硫酸銅和重鉻酸鉀，有望成為一種新型的環(huán)境友好型赤潮微藻抑藻劑。

我們的一個(gè)前期研究總結(jié)了近20 年大型海藻抑藻活性化合物[10]，發(fā)現(xiàn)分離自江蘺的gossonorol 和7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol[31]對(duì)強(qiáng)壯前溝藻生長(zhǎng)的EC50～96h與本研究中7-羥基庚酸和十四酸對(duì)該赤潮微藻生長(zhǎng)的EC50～96h較為接近，gossonorol 和7,10-epoxyar-bisabol-11-ol 是倍半萜類(lèi)化合物、7-羥基庚酸和十四酸是脂肪酸，從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，羥基很可能是產(chǎn)生抑制作用的基團(tuán)。此4 種抑藻活性化合物的分離純化過(guò)程有一定的相似性，均是采用溶劑浸提、液液萃取、硅膠柱層析或薄層層析分離等方法，但具體分離過(guò)程并不相同。讓人遺憾的是，先前工作和本研究都沒(méi)有進(jìn)行抑藻機(jī)理分析，它們?cè)趯?duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)方面是否存在相似性尚不得知，需要后續(xù)進(jìn)行深入研究。

近50 年來(lái)，利用大型海藻與赤潮微藻間抑制作用來(lái)生物防控赤潮微藻的研究有了長(zhǎng)足進(jìn)步，取得了一系列研究成果。然而，大型海藻抑藻活性化合物分離純化研究仍然非常欠缺，致使利用大型海藻抑藻活性化合物開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型赤潮微藻抑藻劑受到了極大限制，因此，亟需海洋科學(xué)領(lǐng)域的研究者開(kāi)展相關(guān)研究來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

5 結(jié)論

（1）采用活性追蹤的分離方法，第一次從海帶中分離純化得到7-羥基庚酸、十四酸、十六酸、十八酸和油酸，純化為薄層純。

（2）7-羥基庚酸具有較為廣泛的抑藻活性，在濃度為50 μg/mL 時(shí)，第4 天時(shí)對(duì)塔瑪亞歷山大藻、強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)53%。十四酸（50 μg/mL）也對(duì)強(qiáng)壯前溝藻、米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)57%（第4 天）。

（3）明確了7-羥基庚酸、十四酸、十六酸、十八酸和油酸對(duì)塔瑪亞歷山大藻、強(qiáng)壯前溝藻、赤潮異彎藻、米氏凱倫藻、球形棕囊藻和中肋骨條藻生長(zhǎng)的半抑制效應(yīng)濃度EC50～96h。發(fā)現(xiàn)7-羥基庚酸和十四酸在抑制強(qiáng)壯前溝藻上比硫酸銅和重鉻酸鉀更具有抑藻優(yōu)勢(shì)。

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所馬國(guó)需博士對(duì)樣品結(jié)構(gòu)解析的幫助。