瘤背石磺體腔細(xì)胞分類、免疫相關(guān)酶特性及初步轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

呂庭莉 ，杲紹強(qiáng)，張虎，張易嬋，陳鵬 ，王嘉偉，喬幗，楊伯平，張明明*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；3.邳州市新河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇 徐州 221313；4.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；5.鹽城工學(xué)院 電氣工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

1 引言

瘤背石磺（Onchidium struma）隸屬軟體動(dòng)物門(mén)（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、石磺科（Onchidiidae），俗稱土海參，又名海賴子，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。主要生長(zhǎng)在潮間帶灘涂中，其背部表皮角質(zhì)層厚，溫度適應(yīng)性強(qiáng)，適應(yīng)陸棲生活[2]，因有自由生活幼蟲(chóng)期而被認(rèn)為是海洋生物向陸地生物輻射進(jìn)化的重要代表物種[3]。此外，瘤背石磺屬于海洋灘涂底棲動(dòng)物，其早期發(fā)育對(duì)各種環(huán)境因子的變化尤為敏感，且因其幼蟲(chóng)易于采集和培育，常被用于評(píng)價(jià)海洋污染物的毒性，也可被作為海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)的指示生物[4]。

近年來(lái)，瘤背石磺作為一種具有較高經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海產(chǎn)珍品，日益受到人們的青睞，但由于環(huán)境污染、濫采濫捕或過(guò)度采捕等因素，其自然資源量已急劇減少。人們已經(jīng)對(duì)瘤背石磺的人工養(yǎng)殖進(jìn)行了研究[5]，但是尚未突破其規(guī)模化養(yǎng)殖技術(shù)。因此，研究瘤背石磺基礎(chǔ)免疫學(xué)將對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和物種保護(hù)具有重要意義。

目前人們普遍認(rèn)為，包括軟體動(dòng)物在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏適應(yīng)性免疫，完全依賴于先天性免疫應(yīng)答[6]。牡蠣和貽貝等雙殼類通過(guò)血細(xì)胞吞噬侵入的微生物、促進(jìn)傷口愈合、消化食物和運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)[7-8]；體腔液及其體腔細(xì)胞是海參先天性免疫防御的重要組成部分，發(fā)揮著重要的免疫防御作用，具有氧化殺滅、吞噬清除、凝集和創(chuàng)傷修復(fù)等多種防御功能[9-10]。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼利用單克隆抗體、熒光標(biāo)記及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)海參（Holothurioidea）、海膽（Echinoidea）和海星（Asteroidea）等棘皮動(dòng)物體腔細(xì)胞的形態(tài)、功能和發(fā)生進(jìn)行了深入研究，進(jìn)一步揭示了棘皮動(dòng)物體腔細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要作用[11-13]。但人們對(duì)瘤背石磺體腔細(xì)胞的特點(diǎn)及其在免疫防御中的作用知之甚少。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門(mén)基于整體轉(zhuǎn)錄水平來(lái)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的學(xué)科，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中[14-15]。高通量RNA-Seq 測(cè)序技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的第二代檢測(cè)技術(shù)，具有高通量、高準(zhǔn)確性、成本低等優(yōu)點(diǎn)[16]，基于此技術(shù)，不僅轉(zhuǎn)錄組本身及其調(diào)控復(fù)雜性的認(rèn)知被大大拓展，有關(guān)生物體的功能基因組學(xué)研究也被深入推進(jìn)[17]，如刺參（Apostichopus japonicus）[18]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）等[19]。藉此，本研究利用RNA-Seq 測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自健康瘤背石磺的體腔細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，豐富其遺傳信息；此外，本文研究了瘤背石磺體腔細(xì)胞的免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性，統(tǒng)計(jì)了體腔細(xì)胞中各主要類型體腔細(xì)胞的密度，研究結(jié)果將為今后進(jìn)一步研究瘤背石磺的基礎(chǔ)免疫學(xué)提供寶貴的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于提高人工繁育的效率和質(zhì)量、遺傳圖譜的建立和物種保護(hù)提供有價(jià)值的參考。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料

健康瘤背石磺（平均體質(zhì)量：（8.3±0.5）g）采自江蘇省射陽(yáng)縣新洋港潮間帶，帶泥運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)（70 cm × 50 cm × 40 cm，90 頭/箱）暫養(yǎng)3 d。塑料桶內(nèi)鋪上8～12 cm 厚的海泥，再鋪上半圓形瓦片供瘤背石磺隱藏和附著。每個(gè)飼養(yǎng)箱用網(wǎng)紗覆蓋，用于通風(fēng)、觀察和防止瘤背石磺逃生。飼養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度通過(guò)噴灑人工海水保持在80%左右，與自然生活潮間帶濕度相近[20]，室溫保持在（26±1）℃。暫養(yǎng)期間，投喂螺旋藻（粗蛋白57.64%、粗脂肪2.73%、灰分7.53%、鈣0.2%、磷0.79%和水分8.28%），日投喂量為體質(zhì)量的2%，將螺旋藻涂抹于無(wú)菌玻璃上，并在飼喂2 h 后清理干凈，防止藻類腐敗發(fā)臭以保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 瘤背石磺體腔液的采集

暫養(yǎng)3 d 后，將瘤背石磺隨機(jī)分到3 個(gè)飼養(yǎng)箱中，每箱放置15 頭。從每箱中隨機(jī)選取3 頭瘤背石磺，用無(wú)菌海水沖洗體表海泥后，解剖紙吸干水分，用無(wú)菌手術(shù)剪沿瘤背石磺腹部縱向解剖，并用50 mL 離心管收集體腔液。記錄體腔液體積后，取100 μL 體腔液與等體積的抗凝劑（葡萄糖：20.8 g/L、檸檬酸鈉：8 g/L、EDTA ：3.36 g/L、氯化鈉：22.5 g/L，pH：7.5）混勻，進(jìn)行體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)。剩余體腔液于4℃、3 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和底層細(xì)胞沉淀，每3 頭瘤背石磺的上清液混合作為一個(gè)平行樣本，-80℃保存，用于免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性測(cè)定；底層細(xì)胞加入RNA 保護(hù)劑以防止RNA 降解，立即放于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

2.2.2 瘤背石磺體腔細(xì)胞的分類和數(shù)量分析

將處理獲得的體腔液制作細(xì)胞涂片，在40 倍光學(xué)顯微鏡（Olympus,PH100-3B41L-IPL）下觀察體腔細(xì)胞并依據(jù)形態(tài)、大小和核質(zhì)比進(jìn)行細(xì)胞分類。

將體腔液滴于血球計(jì)數(shù)板（25×16）上，并在光學(xué)顯微鏡下測(cè)定總體腔細(xì)胞密度（Total Coelomocytes Density,TCD）和不同類型體腔細(xì)胞密度（Different Coelomocytes Density,DCD）。計(jì)算公式為

式中，A為25 中方格內(nèi)總體腔細(xì)胞數(shù)之和（單位：cells/mL）；B為稀釋倍數(shù)；C為25 中方格中某類型體腔細(xì)胞數(shù)之和（單位：cells/mL）。細(xì)胞計(jì)數(shù)重復(fù)3 次。

2.2.3 瘤背石磺體腔液中免疫相關(guān)指標(biāo)活性測(cè)定

通過(guò)試劑盒測(cè)定體腔液中酸性磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AKP）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活力及總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity,T-AOC），試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和活力計(jì)算。

2.2.4 瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.4.1 總RNA 提取和cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建

cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行。根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)從體腔細(xì)胞中提取總RNA，RNA 的質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)合格后用于cDNA 文庫(kù)構(gòu)建。根據(jù)RNA 質(zhì)量篩選獲得6 個(gè)樣品的RNA，純化后，使用fragment buffer 將包含Poly(A)的mRNA 片段分成200～250 bp 的短片段。使用N6 引物將片段化的RNA 轉(zhuǎn)錄入第一鏈cDNA，隨后合成第二鏈cDNA。用QIA quick PCR 試劑盒純化雙鏈cDNA，之后通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段。使用PCR primer cocktail 和PCR master mix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增來(lái)富集合適的銜接子連接的片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)ampureXP 珠純化后使用Illumina HiSeq? 3000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

2.2.4.2 Unigenes 功能注釋與分類

獲得原始片段后，使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk//projects/fastqc/）軟件進(jìn)行質(zhì)量分析，去除帶有接頭、低質(zhì)量和N（表示無(wú)法確定堿基信息）比例大于10%的序列，獲得過(guò)濾后數(shù)據(jù)。將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）組裝出全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列。在已知的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，將所有組裝的Unigenes 通過(guò)BLASTX進(jìn)行比對(duì)，去掉E-value 值大于10-5的比對(duì)序列。數(shù)據(jù)庫(kù)包括：NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（Nt:https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、NCBI 冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Nr:http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、PFAM（HMMER3.0package）、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）、COG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg）。

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 瘤背石磺體腔細(xì)胞的分類和數(shù)量

根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、大小、核質(zhì)比、顏色和相關(guān)研究報(bào)道[21]，將瘤背石磺的體腔細(xì)胞分為變形細(xì)胞（圖1a）、球形細(xì)胞（圖1b）和色素細(xì)胞（圖1c）。變形細(xì)胞類似海參中的變形細(xì)胞，細(xì)胞形狀各異，大小不一，細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)中含有大量的絲狀偽足，呈花瓣?duì)頪22]；球形細(xì)胞靜止時(shí)呈球形，內(nèi)部均勻充滿了小球狀顆粒，大小不一；色素細(xì)胞的形狀各異，大小不一，呈黃色或棕色。在瘤背石磺體腔液中，3 類細(xì)胞的密度由多到少依次為球形細(xì)胞（（6.17±0.14）×106cells/mL）、變形細(xì)胞（（1.40±0.30）×105cells/mL）、色素細(xì)胞（（7.00±0.40）×104cells/mL）（圖2）。

圖1 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細(xì)胞的顯微形態(tài)（×40）Fig.1 The micro-morphology of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma (×40)

圖2 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細(xì)胞的密度Fig.2 Density of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma

3.2 瘤背石磺體腔液免疫相關(guān)酶活性分析

無(wú)外源刺激下瘤背石磺體腔液中ACP、AKP、TAOC、SOD 和PO 均有活力，ACP、AKP、T-AOC、SOD 和PO 活性分別為（0.98±0.60）U/mL、（4.68±0.98）U/mL、（0.01±0）U/mL、（21.59±1.33）U/mL 和（180.34±2.85）U/mL，其中，PO 活性最高。

3.3 瘤背石磺體腔細(xì)胞高通量測(cè)序與序列拼接

瘤背石磺體腔細(xì)胞6 個(gè)文庫(kù)的序列統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。原始序列過(guò)濾后，共獲得328 759 318 條原始測(cè)序數(shù)據(jù)和318 727 812 條過(guò)濾后數(shù)據(jù)，過(guò)濾后數(shù)據(jù)比例為96%。在這些過(guò)濾后數(shù)據(jù)中，Q20 值為97.51%，Q30 值為92.91%，GC 含量為40.66%，這表明測(cè)序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

表1 瘤背石磺體腔細(xì)胞6 個(gè)文庫(kù)的序列統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of transcriptomic sequences from six libraries formed from coelomocytes of Onchidium struma

將來(lái)自6 個(gè)文庫(kù)的過(guò)濾后數(shù)據(jù)使用Trinity 軟件進(jìn)一步組裝得到63 097 個(gè)Unigenes，其平均長(zhǎng)度、最長(zhǎng)長(zhǎng)度和最短長(zhǎng)度分別為1 520 bp、29 277 bp 和301 bp。此外，過(guò)濾后數(shù)據(jù)被組裝成124 853 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，它們的平均長(zhǎng)度、最長(zhǎng)長(zhǎng)度和最短長(zhǎng)度分別為1 974 bp、29 277 bp和301 bp（圖3）。瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序原始數(shù)據(jù)在NCBI 中的登錄號(hào)分別為：SRR6118632、SRR6118633、SRR6118634、SRR6118635、SRR6118636和SRR6118637。

圖3 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 和Transcript 長(zhǎng)度分布Fig.3 Length distribution of all Unigenes and Transcript from coelomocytes in Onchidium struma

3.4 Unigenes 功能注釋與分類

63 097 個(gè)Unigenes 在GO、KO、KOG、NR、NT、PFAM 和SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中成功注釋的比例分別為33.33%、11.5%、11.55%、30.64%、9.45%、33.33%和20.85%。

在這些Unigenes 中，99%以上的Unigenes 與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋序列的相似性大于40%（圖4a），18.4%的Unigenes 的E值大于10-15（圖4b）。這些非重復(fù)序列基因比對(duì)分析表明，與瘤背石磺轉(zhuǎn)錄本具有最高相似度的是海蝸牛（Aplysia californica）（47.1%），其次是光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata）（27.8%）、棒絡(luò)新婦蜘蛛（Nephila clavipes）（3.1%）、仿刺參（1.7%）和青螺（Lottia gigantea）（1.4%）（圖4c）。

圖4 瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison of transcriptomic sequences from coelomocytes in Onchidium struma with the known sequences from different species in database

在GO 功能注釋中，21 036 個(gè)Unigenes 被注釋到3 個(gè)功能類別，分別為：分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成，并被進(jìn)一步注釋為55 個(gè)子類。在這3 大功能類別中，得到注釋最多的子類是細(xì)胞過(guò)程、結(jié)合、單生物過(guò)程、代謝過(guò)程、催化活性、細(xì)胞、細(xì)胞組分和膜（圖5）。

圖5 瘤背石磺體腔細(xì)Unigenes 的GO 功能注釋Fig.5 Gene ontology (GO) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

COG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，共有7 294 個(gè)Unigenes 被注釋到26 個(gè)功能類別中（圖6）。其中，優(yōu)勢(shì)類群為：“一般功能預(yù)測(cè)” “信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制” “翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶” “未知功能” “轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)構(gòu)和發(fā)生” “胞內(nèi)運(yùn)輸分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)”和“轉(zhuǎn)錄”。在這些Unigenes 中，有302 個(gè)Unigenes 與“復(fù)制、復(fù)合、修復(fù)”和“防御機(jī)制”有關(guān)。

圖6 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 的COG 統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Cluster of orthologous group (COG) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，共有7 258 個(gè)Unigenes 被劃分為5 個(gè)類別：細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、代謝和生物系統(tǒng)，共涉及32 個(gè)KEGG 注釋分類，得到最多注釋的為“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)” “運(yùn)輸和分解代謝”“內(nèi)分泌系統(tǒng)” “翻譯” “折疊、分選和降解” “碳水化合物代謝” “消化系統(tǒng)” “細(xì)胞交流” “脂類代謝”和“免疫系統(tǒng)”，參與免疫系統(tǒng)的Unigenes 共有309 個(gè)（圖7）。

圖7 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 的KEGG 注釋分類Fig.7 KEGG annotation of the assembled Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

4 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)石磺科的研究起步較晚，目前的研究主要集中在繁殖生物學(xué)和生態(tài)學(xué)這兩個(gè)方面，而關(guān)于免疫學(xué)方面的研究甚少[23-24]。與其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，體腔液是瘤背石磺進(jìn)行病原防御的重要體液，其經(jīng)離心后大致可分為由各類體腔細(xì)胞組成的底部沉淀和由多種免疫相關(guān)酶、補(bǔ)體因子和凝集素等體液免疫因子組成的體腔上清液兩部分[25]。本研究中，我們觀察到了3 種不同類型的體腔細(xì)胞，分別是變形細(xì)胞、球形細(xì)胞和色素細(xì)胞，這與海參體腔液中體腔細(xì)胞組成相類似[21]。在十足目甲殼動(dòng)物和雙殼類軟體動(dòng)物中，已鑒定出3 種主要的血細(xì)胞類型，即透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[26-27]。其中，透明細(xì)胞多呈規(guī)則圓形，且胞內(nèi)不含顆粒，在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的大部分種類中均有發(fā)現(xiàn)，包括香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[28]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）[29]、西施舌（Coelomactra antiquata）、波紋巴非蛤（Paphia undulata）、雙線紫蛤（Sanguinolaria diphos）[30]和橄欖蟶蚌（Solenaia oleivora）[31]等，除此之外，有人在蝦夷馬糞海膽（Strongylocrntrotus intermedius）[32]和紫海膽（Anthocidaris crassispina）[33]中發(fā)現(xiàn)了一類無(wú)色球形細(xì)胞，其細(xì)胞特征與透明細(xì)胞基本類似，因此也可歸為一類細(xì)胞進(jìn)行命名劃分。San Miguel-Ruiz 和García-Arrarás[34]在褐石海參（Holothuria glaberrima）體壁上人工創(chuàng)傷進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)體壁創(chuàng)傷后，球形細(xì)胞和桑椹細(xì)胞的數(shù)量會(huì)逐漸增加，并且不斷遷移至傷口附近，重構(gòu)細(xì)胞基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。色素細(xì)胞來(lái)源于外胚層中被稱為神經(jīng)嵴細(xì)胞的特化細(xì)胞，是兩棲動(dòng)物、魚(yú)類、爬行動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和頭足綱動(dòng)物中含有生物色素的一類細(xì)胞[35]。色素細(xì)胞是調(diào)控動(dòng)物體色的關(guān)鍵，與生物生存和繁殖活動(dòng)密切相關(guān)[36]。在魚(yú)類中共報(bào)道6 種色素細(xì)胞，包括虹彩色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、白色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞，但是色素細(xì)胞的組成因物種而異[37]。徐偉等[38]研究了幾種不同鯉鯽的鱗片色素細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，組成鱗片的色素細(xì)胞有4 種：紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和鳥(niǎo)糞素細(xì)胞，鳥(niǎo)糞素細(xì)胞又可被分為虹彩色素細(xì)胞和白色素細(xì)胞。在瘤背石磺體內(nèi)，我們觀察到了黃棕色的色素細(xì)胞，推測(cè)其可能類似于魚(yú)類中的黃色素細(xì)胞，使瘤背石磺外觀呈土黃色，便于其藏匿于灘涂中，具有一定的保護(hù)作用。目前，不同類型的體腔細(xì)胞在瘤背石磺免疫系統(tǒng)中的具體作用尚不清楚，有待深入研究。

體腔液是低等水生動(dòng)物的重要體液之一，含有凝集素、溶血素、酶、類補(bǔ)體物質(zhì)等大量免疫因子[39]。酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，動(dòng)物體內(nèi)酶水平可間接反應(yīng)機(jī)體免疫能力[40]。在健康瘤背石磺體腔液內(nèi)，各種酶均保持活性，并發(fā)揮各自的作用來(lái)維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。超氧陰離子（）是好氧生物機(jī)體代謝過(guò)程中必不可少的物質(zhì)，在正常狀態(tài)下，自由基的產(chǎn)生和消除維持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)病原如細(xì)菌、病毒侵害時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而釋放大量活性氧，最終使機(jī)體發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死等損傷[41]。T-AOC、SOD 是機(jī)體重要的抗氧化酶，T-AOC 反映機(jī)體的總抗氧化能力；SOD 可以和過(guò)氧化氫酶（Catalase,CAT）協(xié)同作用，減少機(jī)體的氧化損傷[42]。PO 是一種重要的免疫相關(guān)酶，參與無(wú)脊椎動(dòng)物的體液免疫防御過(guò)程，與黑色素產(chǎn)生、細(xì)胞黏附、包裹和吞噬有關(guān)[43]。磷酸酶根據(jù)最適pH 的不同，分為堿性磷酸酶AKP 和酸性磷酸酶ACP，它們是溶酶體酶的重要組成部分，具有水解、清除、消化異物的作用，從而達(dá)到免疫防御；并與生物的DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)，可以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和提高免疫力[44-45]。在健康瘤背石磺體內(nèi)，ACP 和AKP 以酶原的形式存在于體腔液中，ACP 的活性可以代表體腔液清除異物的能力[45]。本實(shí)驗(yàn)揭示，自然狀態(tài)下瘤背石磺體腔液中存在的多種抗氧化及免疫相關(guān)酶的活性，這不僅為進(jìn)一步檢測(cè)瘤背石磺在應(yīng)激狀態(tài)下的免疫應(yīng)答能力提供了對(duì)比，也為瘤背石磺抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

楊鐵柱[46]在2020 年利用RNA-Seq 技術(shù)篩選出與瘤背石磺歸巢行為相關(guān)聯(lián)的生物節(jié)律性和環(huán)境感知性基因，為探討瘤背石磺在潮間帶灘涂區(qū)域適應(yīng)性進(jìn)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對(duì)于瘤背石磺而言，體腔細(xì)胞是其發(fā)揮非特異性免疫的重要載體，為了進(jìn)一步剖析瘤背石磺體腔細(xì)胞的免疫防御分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Illumina 平臺(tái)對(duì)瘤背石磺的體腔細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序與功能注釋，共獲得63 097 個(gè)Unigenes，數(shù)據(jù)含量大，基因信息豐富，可為未來(lái)瘤背石磺的研究奠定基礎(chǔ)。通過(guò)GO 功能注釋，有21 036 個(gè)Unigenes 被注釋到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成3 個(gè)功能類別中，這與刺參體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)高度相似[47]?；贜r 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，海蝸牛與瘤背石磺序列同源性最高，與Oskars等[48]的報(bào)道相似，其次是光滑雙臍螺、棒絡(luò)新婦蜘蛛、刺參和青螺，分別屬于軟體動(dòng)物門(mén)、節(jié)肢動(dòng)物門(mén)和棘皮動(dòng)物門(mén)，瘤背石磺與不同物種間的同源性也證明了其獨(dú)特的進(jìn)化地位。基于通路的分析有助于進(jìn)一步闡明基因的生物學(xué)功能和相互作用機(jī)制，KEGG注釋表明，這些Unigenes 參與了機(jī)體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、免疫防御等各個(gè)過(guò)程，這將為進(jìn)一步篩選免疫相關(guān)基因和信號(hào)通路提供指引。

5 結(jié)論

瘤背石磺體腔液內(nèi)主要含有變形細(xì)胞、球形細(xì)胞和色素細(xì)胞3 種不同類型的體腔細(xì)胞，其中，球形細(xì)胞最多。此外，瘤背石磺的體腔液內(nèi)含有多種抗氧化酶和免疫相關(guān)酶，它們發(fā)揮著各自的作用，共同維護(hù)機(jī)體健康。RNA-Seq 測(cè)序表明，從瘤背石磺體腔細(xì)胞中共組裝出63 097 個(gè)Unigenes，這些Unigenes 被成功注釋到GO、COG 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中。如上結(jié)果為深入了解瘤背石磺進(jìn)化地位及其免疫系統(tǒng)奠定理論基礎(chǔ)，為發(fā)展瘤背石磺人工養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。