一種環(huán)境敏感型造礁石珊瑚Pocillopora sp.共生蟲黃藻和細(xì)菌的生態(tài)特征

梁甲元 ，鄧傳奇，許勇前，覃良云，陳金妮，葛瑞琪，黃學(xué)勇，余克服*

(1.廣西大學(xué) 海洋學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西南海珊瑚礁研究重點實驗室，廣西 南寧 530004)

1 引言

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)擁有極高的生物多樣性和初級生產(chǎn)力[1-2]，這要歸功于其體內(nèi)龐大的共生微生物類群（蟲黃藻、細(xì)菌、真菌、原生生物、病毒等）[3]，它們在能量供給、物質(zhì)循環(huán)、疾病防御等方面發(fā)揮著重要的作用[4-7]。然而，這些微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性長期處于動態(tài)變化之中，跟珊瑚宿主的種類和外環(huán)境的擾動密切相關(guān)[8-9]。深入了解珊瑚共生微生物的生態(tài)特征有助于揭示珊瑚宿主的環(huán)境適應(yīng)機制，對珊瑚礁未來的演化趨勢提供理論認(rèn)識。

余克服課題組曾對南海不同珊瑚礁區(qū)珊瑚共生蟲黃藻的密度、種群多樣性、群落結(jié)構(gòu)、遺傳進化等進行了較詳細(xì)的研究。結(jié)果得出：隨著緯度的升高（從南沙群島至大亞灣），蟲黃藻密度逐步增加，由此推測相對高緯度珊瑚健康狀況更好，高緯度珊瑚區(qū)很可能會成為南海珊瑚的避難所[10-11]；然而，中、低緯度珊瑚礁區(qū)（北礁、黃巖島、三角礁和信義礁）比高緯度（大亞灣、防城港和潿洲島）的珊瑚具有更高的共生蟲黃藻種群多樣性[12]；具有耐熱特性的蟲黃藻（Durusdinium trenchii），其在珊瑚體內(nèi)的相對豐度在低緯度的珊瑚宿主中相對較高，即與年均海表溫度（Sea Surface Temperature，SST）呈正相關(guān)[13]。同時，該課題組也對南海不同珊瑚礁區(qū)珊瑚共生細(xì)菌的多樣性做過研究。結(jié)果得出：南海不同珊瑚礁區(qū)（大亞灣、潿洲島、鹿回頭、黃巖島、信義礁和三角礁）珊瑚共生固氮細(xì)菌的多樣性非常豐富，并且群落組成與礁區(qū)環(huán)境存在顯著相關(guān)性（p≤0.05）[14]；對南海熱帶區(qū)域種疣狀杯形珊瑚（Pocillopora verrucosa）與亞熱帶區(qū)域種盾型陀螺珊瑚（Turbinaria peltata）的細(xì)菌多樣性、群落組成以及交互作用網(wǎng)絡(luò)特征進行了分析，疣狀杯形珊瑚核心細(xì)菌類群的相對豐度顯著降低，推測這與人類活動相關(guān)。此外，細(xì)菌多樣性的變化可能會改變珊瑚微生物交互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，進而影響微生物群落的穩(wěn)定性、珊瑚共生功能體的功能以及珊瑚的環(huán)境適應(yīng)潛力[15]。此外，Tong 等[16]也曾選取南海3 個具有緯度差異的礁區(qū)，研究了珊瑚與共生藻的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)溫度是影響3 個礁區(qū)珊瑚共生藻多樣性的主要環(huán)境因素。Ziegler 等[17]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同溫度環(huán)境下的珊瑚共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異。目前，對于南海珊瑚礁大跨度層面的研究大多側(cè)重于珊瑚共生微生物多樣性或者單一共生成員的生態(tài)特征（蟲黃藻或者細(xì)菌）方面。這些龐大的微生物類群在細(xì)胞數(shù)量上的生態(tài)調(diào)節(jié)特征卻知之甚少。因此，基于16S rRNA 基因擴增子測序技術(shù)與細(xì)菌生物量評估相聯(lián)系[18]，可以很好地探究不同生境下珊瑚共生微生物的群落結(jié)構(gòu)與生物量的生態(tài)分布特征。

南海4°～21°N 的緯度范圍內(nèi)分布有大面積的珊瑚礁區(qū)[19]。這些珊瑚礁長期以來受到極端海洋事件（厄爾尼諾、強風(fēng)暴、高頻冬季降溫等）、人類活動和地理氣候的影響[19-23]，是研究珊瑚環(huán)境適應(yīng)機制和演化趨勢的天然實驗室。其中，杯形珊瑚（Pocillopora）在南海的分布較為廣泛，是一種環(huán)境敏感型的枝狀珊瑚。在實驗室中已有對珊瑚Pocillopora damicornis共生微生物組的熱響應(yīng)和酸化響應(yīng)特征做過研究[24-25]。鑒于此，本研究選取采自南海3 個不同緯度珊瑚礁區(qū)具有代表性的一種環(huán)境敏感型造礁石珊瑚—杯形珊瑚（Pocilloporasp.）為研究對象（圖1），重點分析蟲黃藻和細(xì)菌兩種關(guān)鍵共生微生物的生態(tài)特征以及環(huán)境因子相關(guān)性，旨在為探討珊瑚適應(yīng)環(huán)境變化的微生態(tài)機制以及未來進化趨勢提供更全面的認(rèn)識。

圖1 采樣位點（a）與珊瑚（Pocillopora sp.）的形態(tài)（b）Fig.1 Sampling sites (a) and the morphology of coral Pocillopora sp.(b)

2 材料與方法

2.1 采樣點與樣品采集

珊瑚樣品在2017 年5 月和2018 年5 月的兩個航次中從南海3 個不同緯度的珊瑚礁區(qū)采集（圖1）：南沙群島（NS：9°～11°N，115°～116°E）、西沙群島（XS：15°～17°N，110°～113°E）和海南島陵水（LS：18°30′N，110°07′E）。這3 個主要珊瑚礁區(qū)處于熱帶海域均受到南部和西南部季風(fēng)氣候的影響。其中，南沙群島位于南海最南端，年均SST 為28.6℃，距離海南島約1 000～1 600 km，受人類活動干擾較小，珊瑚群落多樣性較高[26]。西沙群島位于南海的中北部，是南海四大島嶼之一，氣候與南沙群島相似，年均SST 為27.48℃。海南陵水位于海南省東南沿海附近，該區(qū)域的珊瑚礁是一個典型的岸礁，受人類活動干擾較大，年均SST 為26.7℃。

攜帶鑿子、鐵錘和網(wǎng)兜，使用水肺潛水（SCUBA）的方式潛入水下6 m 上下采集目標(biāo)珊瑚樣本（圖1），相同珊瑚礁區(qū)所采集的珊瑚個體間隔距離在5 m 左右。珊瑚樣品出水后用無菌海水沖洗3 遍，立即裝入無菌密封袋并置于液氮中速凍，隨后置于冰箱（-20℃）帶回實驗室備用。共采集50 株P(guān)ocilloporasp.樣品（直徑約5 cm），其中在NS 采集20 株，XS 采集19 株，LS 采集11 株。珊瑚種類的鑒定主要依據(jù)其表型和碳酸鈣骨骼的類型來進行，可以鑒定到屬水平。

2.2 采樣點相關(guān)環(huán)境數(shù)據(jù)

3 個珊瑚礁區(qū)年均SST 通過美國國家海洋和大氣管理局（NOAA）衛(wèi)星數(shù)據(jù)獲得，其他環(huán)境數(shù)據(jù)，如可溶性活性磷（Soluble Reactive Phosphorus,SRP）、光合有效輻射（Photosynthetic Active Radiation,PAR）、溶解無機氮（Dissolved Inorganic Nitrogen,DIN）、顆粒有機碳（Particulate Organic Carbon,POC）、葉綠素a（Chlorophylla,Chla）濃度以及透明度，從本團隊已發(fā)表的文獻[27-29]中獲得。

2.3 珊瑚總DNA 的提取

剪取約2 cm 長的短枝，用吸水紙除去附著在表面的水分，精確測量短枝的重量和表面積（珊瑚的表面積根據(jù)鋁箔重量和表面積之間的相關(guān)性計算確定[30]）。研缽中加入液氮將所剪取的珊瑚短枝研磨成漿，精確量取90 mg 的研磨樣品（包括碳酸鈣和珊瑚組織）使用天根海洋動物基因組DNA 提取試劑盒（中國北京天根生物技術(shù)有限公司）對每個珊瑚樣品的總DNA 進行提取。提取的DNA 經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和紫外A260/A280 吸收峰檢測以確定質(zhì)量合格。同時，根據(jù)多次計算珊瑚重量和表面積之間的對應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確得出90 mg 珊瑚對應(yīng)的表面積。

2.4 珊瑚共生蟲黃藻系群組成與密度

以珊瑚總DNA 為模板，利用蟲黃藻核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）的特異性引物ITSintfor2（5′-GAATTGCAGAACTCCGTG-3′）和ITS2-reverse（5′-GGGATCCATGCTTAAGTCAGCGGT-3′）進 行PCR 擴增[31]。PCR 擴增體系和反應(yīng)程序按照Chen 等[12]的方法進行。PCR 產(chǎn)物利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Quanti-Fluor?-ST（Promega,USA）進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺（Illumina,San Diego,USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2 x 300-pb 雙端測序文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。Illumina MiSeq 平臺輸出數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制使用Trimmomatic 軟件，按照Bolger 等[32]的方法進行。使用Zhang 等[33]開發(fā)的PEAR 方法獲得ITS2 rDNA 片段。序列質(zhì)量修剪和嵌合體檢查用MOTHUR 軟件進行（version 1.30.2,https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）。序列比對分析是基于Chen 等[12]建立的非重復(fù)ITS2數(shù)據(jù)庫中的信息，通過本地比對搜索進行。利用Microsoft Excel 計算每個樣品中共生蟲黃藻系群對應(yīng)序列的相對豐度。

珊瑚共生蟲黃藻密度（單位：cells/cm2）的分析按照文獻[34]的操作進行。使用無菌海水用洗牙器（WaterpikTM,3～5 kgf/cm2）將珊瑚組織沖洗下來，用量筒測量初始沖洗液的體積。取3 mL 沖洗液進行離心（6 500 r/min）去上清液收集蟲黃藻細(xì)胞。底部的蟲黃藻細(xì)胞用1 mL5%的甲醛溶液重懸，在低溫條件下（4℃）放置2～4 h。用血球細(xì)胞計數(shù)法對蟲黃藻細(xì)胞進行計數(shù)。

2.5 珊瑚共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與16S rRNA 基因拷貝數(shù)絕對定量

以珊瑚總DNA 為模板，利用細(xì)菌的16S rRNA 基因特異性引物27F（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增該基因的全長序列。PCR 產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell），應(yīng)用PacBio Sequel 單分子實時測序系統(tǒng)進行測序（北京百邁客生物科技有限公司）。對原始下機的subreads 進行校正得到CCS（Circular Consensus Sequencing）序列（SMRT Link,version8.0)，使用lima（v1.7.0）軟件通過barcode 序列識別不同樣品的CCS 序列并去除嵌合體（UCHIME[35],version 8.1），得到高質(zhì)量的CCS 序列。在相似性97%的水平上對序列進行聚類（USEARCH[36],version 10.0），以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[37]。序列比對數(shù)據(jù)庫選擇細(xì)菌16S:Silva（Release132,http://www.arbsilva.de）。物種注釋使用RDP Classifier 軟件，置信度閾值設(shè)為0.8（version 2.2,http://sourceforge.net/projects/rdpclassifier/）。Alpha 多樣性指數(shù)分析采用Mothur 軟件（versionv.1.30,http://www.mothur.org/）。

利用Eub338（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3′）和Eub518（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）引物對細(xì)菌16S rRNA 基因的一個172 bp 區(qū)域進行SYBR GreenⅠ定量PCR，以測定90 mg 珊瑚樣品中細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)，進而計算出珊瑚單位表面積所含共生細(xì)菌16S rRNA 基因的拷貝數(shù)（單位：cm-2）。根據(jù)珊瑚Pocilloporasp.的質(zhì)量與表面積的對應(yīng)關(guān)系（Y=4.151X+0.319 7，R2=0.97，Y為表面積，單位：cm2，X為質(zhì)量，單位：g），可以準(zhǔn)確計算出90 mg 樣品對應(yīng)的表面積，進而計算出每平方厘米珊瑚表面積中的細(xì)菌16S rRNA 基因的拷貝數(shù)。在9 600 plus 熒光定量PCR儀上進行（Bioer，中國杭州）進行qPCR。20 μL 的反應(yīng)體系包含10 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（2X）、2 μL DNA 模板、引物各0.4 μL（10 μmol/L）、7.2 μL的ddH2O。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共進行35 個循環(huán)，得出溶解曲線。將已知拷貝數(shù)（1.667 2×1010μL-1）的含有16S rRNA 基因PCR 擴增子片段的pMD18-T 質(zhì)粒連續(xù)稀釋至10-3～10-8，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以緩沖液和水為陰性對照?；谘h(huán)閾值（Ct值）與每個模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，因此，只要得到定量珊瑚樣品的Ct值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算16S rRNA 基因的初始拷貝數(shù)。

2.6 統(tǒng)計分析

蟲黃藻密度和細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)均進行無參Kruskal-Wallis 檢驗，以驗證各組份的顯著性。采用SNK 檢驗進行多重比較以進一步分析顯著性。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。統(tǒng)計的顯著性水平設(shè)為0.05，p＜0.05 為差異顯著。使用Canoco 4.5 軟件進行冗余分析（Redundancy Analysis,RDA）或主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis,PCoA）以檢驗環(huán)境因素和珊瑚共生蟲黃藻、細(xì)菌之間的相關(guān)性。

3 結(jié)果與分析

3.1 珊瑚共生蟲黃藻密度及系群結(jié)構(gòu)

造礁石珊瑚組織中共生蟲黃藻細(xì)胞的密度是一個反映珊瑚礁生態(tài)狀況的重要指標(biāo)。南海大緯度跨度的環(huán)境敏感型珊瑚Pocilloporasp.共生蟲黃藻密度表現(xiàn)出隨緯度的增加而升高（p＜0.05）（圖2）。NS 珊瑚共生蟲黃藻密的平均值為（3.39±0.49）×105cells/cm2，XS 的為（5.53±0.50）×105cells/cm2，而較高緯度LS 的則為（8.90±0.65）×105cells/cm2。3 個珊瑚礁區(qū)Pocilloporasp.共生蟲黃藻密度存在顯著的差異（Kruskal-Wallis檢驗,p=0.001＜0.05）。

圖2 不同珊瑚礁區(qū)Pocillopora sp.共生蟲黃藻密度（A）和基于ITS2 序列分析的亞系群組成的變化（B）Fig.2 Change in Symbiodiniaceae density (A) and ITS2 sequence-based subclade composition (B) of Pocillopora sp.from different coral reef areas

基于ITS2 的分子標(biāo)記共分析了50 個珊瑚樣品，單個樣品的測序量在30 332～73 752 之間，每條序列長度在281～300 bp 之間。隨機抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計得出稀釋曲線，并且曲線全部達到平緩趨勢，判斷所有樣品測序數(shù)據(jù)量是否足夠。經(jīng)過序列相似性聚類與比對分析顯示，NS 珊瑚共生蟲黃藻的亞系群組成與XS 的較為相似，而較高緯度LS 的則與該兩個礁區(qū)的差別較大（圖2）。整體上，珊瑚Pocilloporasp.共生蟲黃藻主導(dǎo)亞系群平均相對豐度NS 的為D1（31.3%）、C1d（19.1%）和C42（12.8%）；XS 的為D1（33.2%）、C1d（16.5%）和C42（14.8%）；而更高緯度LS 的則為C42（23.3%）、C1d（22.8%）、C1p（10.6%）、C1（9.9%）和C1t（9.9%）。較為特別的是，在NS 和XS 的珊瑚共生蟲黃藻以C 系群和D 系群為主導(dǎo)，而一向被認(rèn)為具有耐熱特性的D 系群在相對高緯度的LS 珊瑚中相對豐度很低（只有0.27%）。綜上所述，環(huán)境敏感型珊瑚Pocilloporasp.共生蟲黃藻密度及系群組成在緯度空間上差異明顯。

3.2 珊瑚共生細(xì)菌多樣性及16S rRNA 基因拷貝數(shù)分析

基于16S 全長的分子標(biāo)記共分析了50 個珊瑚樣品，單個樣品的測序量最低為4 234 條有效序列，序列長度均在1 200～1 650 bp 之間。OTU 聚類、序列比對、物種注釋等分析顯示，珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌包含23 門、41 綱、98 目、179 科、382 屬、515 種（未包括未定種）和2 246 個不同的OTU。ACE 和Chao指數(shù)是衡量珊瑚共生細(xì)菌物種豐富度的指數(shù)，而Shannon 和Simpson 指數(shù)是衡量珊瑚共生細(xì)菌物種多樣性的指數(shù)。在低緯度NS 和XS 的珊瑚中，ACE 和Chao 指數(shù)相對較低，而在相對高緯度的LS 該指數(shù)較高（表1）。3 個不同緯度珊瑚礁區(qū)珊瑚共生菌的Shannon和Simpson 指數(shù)無明顯差異（Kruskal-Wallis 檢驗，p＞0.05）。上述結(jié)果表明，隨著緯度的增高，珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌物種豐富度升高。

表1 珊瑚共生細(xì)菌OTUs 統(tǒng)計及Alpha 多樣性Table 1 OTUs statistics and Alpha diversity of coral-associated bacteria

在OTU 水平上基于非加權(quán)Binary_jaccard 算法的PCoA 分析（PERMANOVA 檢驗）表明，不同緯度珊瑚礁區(qū)珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成上具有顯著的差異（R2=0.092，p=0.008＜0.05）（圖3）。

圖3 基于共生細(xì)菌OTUs 的主成分分析（PCA 分析）Fig.3 Principal component analysis based on bacterial OTUs從LS 采集的樣品數(shù)為11 個，NS 為20 個，XS 為19 個The number of samples collected from LS,NS,and XS were 11,20,and 19,respectively

為了量化珊瑚Pocilloporasp.體內(nèi)的細(xì)菌生物量，我們通過熒光定量PCR 檢測了樣品中16S rRNA 基因的絕對拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，16S rRNA 基因拷貝數(shù)至少達到每平方厘米珊瑚表面積有（5.20±0.27）×107個（圖4）。在低緯度NS 和XS 的珊瑚中共生細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)沒有顯著差異（平均值分別為（1.08±0.22）×108cm-2和（1.25±0.21）×108cm-2），但是在高緯度LS 的珊瑚中細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)則顯著比NS 和XS 的高（Kruskal-Wallis 檢驗，p=0.001＜0.05），達到（2.37±0.24）×108cm-2?？傮w而言，從低緯度熱帶海域NS 和XS 到高緯度亞熱帶海域LS，珊瑚共生細(xì)菌生物量呈現(xiàn)遞增的趨勢。這表明珊瑚共生細(xì)菌生物量在空間分布上具有差異性。

圖4 不同緯度珊瑚共生細(xì)菌16S rRNA 基因絕對拷貝數(shù)Fig.4 The absolute number of 16S rRNA gene copies in coral endosymbiotic bacteria at different latitudes

不同珊瑚礁區(qū)珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌在門水平上的組成相似，均以變形菌（Proteobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）和厚壁菌（Firmicutes）為主導(dǎo)類群（圖5a）。而具有光合作用功能的藍細(xì)菌（Cyanobacteria）在低緯度NS 和XS 的珊瑚中相對豐度極低（約1.5%），在相對高緯度LS 的珊瑚中其相對豐度則較高（8.18%），即隨著緯度的增高其相對豐度顯著升高（Kruskal-Wallis 檢驗，p＜0.05）。其次，細(xì)菌門Deinococcota 在低緯度NS 和XS 的珊瑚中相對豐度約為5%，而在相對高緯度LS 的珊瑚中卻沒有檢測到；細(xì)菌門Fusobacteriota 在相對高緯度LS 的珊瑚中其相對豐度（3.51%）顯著比低緯度NS 和XS 的高（Kruskal-Wallis 檢驗，p＜0.05）。

不同珊瑚礁區(qū)珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌在屬水平上的組成差異較大（圖5b）。其中，細(xì)菌屬Amoebophilus和Alteromonas在低緯度NS 和XS 的珊瑚中其相對豐度較高（約10%）；XS 的珊瑚中還有相對豐度為11%的細(xì)菌屬Endozoicomonas，這一點明顯與NS 的不同。此外，在低緯度NS 和XS 的珊瑚中還分別檢測到相對豐度約為5%的細(xì)菌屬Thermus，而這類棲熱菌屬在高緯度LS 的珊瑚中卻沒有發(fā)現(xiàn)。

圖5 細(xì)菌群落組成Fig.5 Bacterial community composition

3.3 珊瑚共生微生物生態(tài)特征與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性

對3 個不同緯度珊瑚礁區(qū)珊瑚Pocilloporasp.共生微生物生態(tài)特征和相關(guān)環(huán)境因素之間進行關(guān)聯(lián)性分析。RDA 分析顯示，許多環(huán)境因子都影響著珊瑚共生微生物的組份（圖6）。珊瑚共生蟲黃藻密度、細(xì)菌數(shù)量以及藍細(xì)菌相對豐度與營養(yǎng)鹽（SRP、DIN和POC）和光合有效輻射（PAR）呈顯著正相關(guān)，與SST 和透明度呈顯著負(fù)相關(guān)。在蟲黃藻亞系群組成方面，低緯度NS 和XS 珊瑚共生主導(dǎo)系群D1 與SST和透明度呈正相關(guān)，與營養(yǎng)鹽呈顯著負(fù)相關(guān)；高緯度LS珊瑚中占主導(dǎo)的蟲黃藻C42 亞系群則與SST 呈顯著負(fù)相關(guān)、與營養(yǎng)鹽呈顯著正相關(guān)。通常，蟲黃藻D 系群被認(rèn)為是耐熱型，而C 系群則是熱敏感型。隨著緯度增高，年均SST 隨之降低，而珊瑚共生的蟲黃藻主導(dǎo)系群也由D 型演化為C 型，這是環(huán)境適應(yīng)的體現(xiàn)。

圖6 環(huán)境參數(shù)、珊瑚共生微生物生態(tài)參數(shù)和采樣礁區(qū)之間的相關(guān)性Fig.6 Correlations among environmental parameters,ecological parameters of microorganisms,and sampling sites

4 討論

環(huán)境因素能改變珊瑚及其共生微生物之間的共生關(guān)系以及菌落組成[13,17,38-39]。南海珊瑚礁經(jīng)過長期的自然進化和人類活動干預(yù)，已形成環(huán)境特征迥異的不同礁區(qū)，是研究珊瑚環(huán)境適應(yīng)機制和演化趨勢的天然實驗室。營底棲固著生活的造礁珊瑚其能量需求的95%以上是由共生蟲黃藻通過光合作用提供[40-41]；而珊瑚共生細(xì)菌則是珊瑚共生體中數(shù)量極高的微生物有機體[8-9,42]，是最為基礎(chǔ)和活躍的組分[4-7]。因此，探究南海具有代表性的珊瑚物種關(guān)鍵共生微生物的生物量及其環(huán)境相關(guān)性可以更深入地了解珊瑚適應(yīng)環(huán)境的微生態(tài)機制以及未來進化的趨勢。

本研究從南海3 個環(huán)境變量差異顯著的珊瑚礁區(qū)—南沙群島（NS）、西沙群島（XS）以及海南陵水（LS），采集一種環(huán)境敏感型造礁珊瑚Pocilloporasp.分析這兩種關(guān)鍵的共生微生物類群（蟲黃藻和細(xì)菌）的群落結(jié)構(gòu)特征和生物量以及環(huán)境相關(guān)性。隨著緯度的升高（從低緯度NS 到相對高緯度LS）珊瑚共生蟲黃藻的密度顯著升高，這與營養(yǎng)鹽（SRP、DIN 和POC）和光照強度（PAR）呈顯著正相關(guān)，與SST 和透明度呈顯著負(fù)相關(guān)。關(guān)于珊瑚共生蟲黃藻密度與緯度的變化關(guān)系基本與Ladrière 等[43]的研究結(jié)果一致。相對低緯度的海區(qū)時常處于高溫環(huán)境脅迫之下，珊瑚共生蟲黃藻在進行光合作用時會產(chǎn)生更多的活性氧物質(zhì)和自由基分子，這會導(dǎo)致蟲黃藻的損傷，并誘導(dǎo)珊瑚宿主排出受損的蟲黃藻[44]，這可能是導(dǎo)致低緯度珊瑚礁區(qū)珊瑚共生蟲黃藻密度較低的重要原因之一。此外，不同珊瑚物種、人類活動以及珊瑚宿主的營養(yǎng)方式等均對珊瑚共生蟲黃藻的密度有著顯著的影響[30,45-46]。這表明珊瑚可以通過與特定數(shù)量蟲黃藻共生以應(yīng)對特殊的環(huán)境變化。另外，在相對低緯度的NS 和XS有高豐度的D 系群蟲黃藻與珊瑚Pocilloporasp.共生，這對珊瑚本身適應(yīng)相對高溫的生存環(huán)境具有重要的意義。D 系群蟲黃藻被認(rèn)為具有耐熱的性質(zhì)[47]，通常在中/低緯度的珊瑚礁區(qū)珊瑚中具有較高的相對豐度[12]。高溫模擬實驗也證實共生有D 系群蟲黃藻的叢生盔型珊瑚（Galaxea fascularis）相比共生有C 系群蟲黃藻的鹿角珊瑚（Acropora millepore）表現(xiàn)出更高的高溫耐受性[48]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Pocilloporasp.共生蟲黃藻系群結(jié)構(gòu)比較保守，在大空間尺度下的變化較小。

此外，本研究首次探究了珊瑚共生細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)量的生態(tài)特征，有助于準(zhǔn)確量化珊瑚體內(nèi)的細(xì)菌生物量。結(jié)果表明，珊瑚Pocilloporasp.體內(nèi)有著數(shù)量非常龐大的共生細(xì)菌類群，平均每平方厘米珊瑚表面積共生細(xì)菌中16S rRNA 基因的拷貝數(shù)達到108級別。這一變化與共生蟲黃藻密度的變化相一致，與SST 呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，與營養(yǎng)鹽顯著正相關(guān)性。這可能與高濃度營養(yǎng)鹽會促進共生藻和細(xì)菌的生長有關(guān)[49]，也進一步說明了珊瑚共生蟲黃藻和細(xì)菌有著相似的環(huán)境適應(yīng)機制。此外，由于細(xì)菌具有種類繁多、變異速度快、適應(yīng)能力強等特性，往往被當(dāng)作環(huán)境變化的標(biāo)志生物。在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中，通過檢測環(huán)境改變前后的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化來了解珊瑚共生體對特定環(huán)境的適應(yīng)機制[50]。珊瑚Pocilloporasp.共生細(xì)菌的第一主導(dǎo)類群是變形菌門，但隨著緯度升高，該細(xì)菌門相對豐度顯著降低。比較特別的是，具有光合作用功能的藍細(xì)菌門相對豐度隨緯度的升高而升高，從低緯度NS 和XS 珊瑚中的約1.5%升到相對高緯度LS 珊瑚的8.18%。藍細(xì)菌富含光合色素（葉綠素、藍藻素），是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分和初級生產(chǎn)力的重要貢獻者，也是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵成員[51-53]。藍細(xì)菌可以分別通過固氮作用和光合作用為珊瑚宿主提供必須的氮和碳[54]。在本研究中，珊瑚Pocilloporasp.共生藍細(xì)菌相對豐度隨緯度的升高而升高，與珊瑚礁區(qū)水體的透明度存在顯著的負(fù)相關(guān)性，這可能是珊瑚共生體光合補償與穩(wěn)定的策略。

5 結(jié)論

基于共生蟲黃藻和細(xì)菌的群落組成、細(xì)胞密度以及環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性，珊瑚Pocilloporasp.對低緯度環(huán)境的適應(yīng)主要是通過提高耐熱型蟲黃藻系群（D1）的占比；而對相對高緯度環(huán)境的適應(yīng)則是通過顯著提高共生微生物生物量和某些特異類群的豐度（如藍細(xì)菌）的方式來實現(xiàn)。研究可以較全面地對珊瑚適應(yīng)環(huán)境的微生態(tài)機制以及未來進化趨勢提供新的認(rèn)識。