大棗不同炮制品的薄層色譜研究*

劉世軍，帕合熱葉·卡哈爾，張 娛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083

大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)［1］。具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神、緩和藥性等功效［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大棗具有抑制腫瘤、抗氧化、保肝、抗過(guò)敏、增強(qiáng)肌力、鎮(zhèn)靜、抗壓、抗衰老等作用［3-5］。大棗中所含的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）活性成分有抑菌保肝、抗心律失常、降低血糖和血清膽固醇［5］等作用。

現(xiàn)代研究表明，大棗含有多種有效成分。例如，大棗果實(shí)含有生物堿：光千金藤堿、吡咯烷生物堿、巴婆堿；三萜酸類(lèi)：白樺酯酸、齊墩果酸、馬斯里酸（山楂酸）；皂苷類(lèi)：大棗皂苷、酸棗皂苷；黃酮類(lèi)：蕓香苷（蘆?。?；脂肪酸：油酸［6］等。2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》以齊墩果酸、白樺酯酸為對(duì)照控制大棗質(zhì)量。大棗因產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境和采摘條件的不同，其化學(xué)成分會(huì)發(fā)生一定變化。本試驗(yàn)采用薄層色譜法（TLC）對(duì)大棗中的三萜類(lèi)成分白樺酯酸、齊墩果酸和其他成分進(jìn)行色譜分析，探索大棗的炮制原理。

1 材料

1.1 儀器C21-HT2109 型多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；WF-H201B 紫外透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；KQ3-00DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公祠）；100×100 雙槽層析缸、硅膠G 薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）。

1.2 材料大棗（新疆大棗，產(chǎn)地新疆托克遜），白樺酯酸（陜西樂(lè)博生化科技有限公司，批號(hào)：16072201），齊墩果酸（陜西樂(lè)博生化科技有限公司，批號(hào)：16051205），石油醚（60～90℃，天津市天力化學(xué)試劑有限公司），甲苯（洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），三氯甲烷（成都市科隆化學(xué)品有限公司），丙酮（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗炮制品的制備按《中藥大辭典》［6］中大棗的炮制方法，自制不同時(shí)間下大棗的清蒸炮制品。取大棗洗凈，置蒸籠內(nèi)，加熱蒸制，取出干燥。見(jiàn)表1。

表1 大棗樣品炮制方法與性狀觀察

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取白樺酯酸0.0100g，齊墩果酸0.0100 g，各加乙醇10 mL，超聲處理30 min制成1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供試品1 的制備 取大棗生品1.0134 g，清蒸（15 min）1.0186 g，清蒸（30 min）1.0055 g，清蒸（45 min）1.0113 g，清蒸（60 min）1.0734 g，各加石油醚10 mL，浸泡10 min，超聲處理15 min，濾過(guò)，藥渣加無(wú)水乙醚10 mL，浸泡1 h，超聲處理15 min，濾液濃縮至1 mL。

2.3.2 供試品2 的制備 取大棗生品1.0659 g，清蒸（15 min）1.0754 g，清蒸（30 min）1.0401 g，清蒸（45 min）1.0128 g，清蒸（60 min）1.0661 g，各加水20 mL，超聲處理15 min，加鹽酸0.7 mL，加熱水解1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至10 mL，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。

2.3.3 供試品3 的制備 取大棗生品2.0162 g，清蒸（15 min）2.0148 g，清蒸（30 min）2.0158 g，清蒸（45 min）2.0163 g，清蒸（60 min）2.0129 g，各加甲醇20 mL，浸泡10 min，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL。

2.4 預(yù)試驗(yàn)

2.4.1 供試品1 分別吸取供試品1溶液10 μL，對(duì)照品溶液各4 μL，點(diǎn)于薄層板上，展開(kāi)劑為甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸，分別按a（14∶3∶0.5）、b（16∶4∶0.5）、c（16∶5∶0.5）3 種比例展開(kāi)，觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 供試品1的薄層色譜圖

2.4.2 供試品2 分別吸取供試品2溶液10 μL，分別點(diǎn)于薄層板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷：丙酮，分別按a（8∶0.5）；b（4∶1）；c（10∶0.5）3 種比例展開(kāi)，觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 供試品2的薄層色譜圖

2.4.3 供試品3 分別吸取供試品3溶液10 μL，對(duì)照品溶液4 μL 分別點(diǎn)于薄層板上、展開(kāi)劑為石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸，分別按a（4∶0.5∶3滴）、b（4∶1∶0.5）、c（5∶1∶3 滴）3 種比例展開(kāi)，觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 供試品3的薄層色譜圖

2.5 供試品的薄層層析

2.5.1 供試品1 吸取供試品1 約10 μL 點(diǎn)樣，在薄層板上依次點(diǎn)1 生品、2 清蒸大棗（15 min）、3清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min）、6 齊墩果酸、7 白樺酯酸對(duì)照品溶液，以甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸（16∶5∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)完全后，用10% 硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日照和紫外光365 nm 下觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 供試品1的薄層鑒別圖譜

由圖4可以看出，供試品1在日照下圖譜中共有8個(gè)清晰且分離度較好的斑點(diǎn)；在紫外光365 nm下共有8 個(gè)清晰的斑點(diǎn)；圖4 中可以確定e、f 兩個(gè)化合物分別為齊墩果酸、白樺酯酸。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b兩點(diǎn)較深，e、g、h 4個(gè)點(diǎn)較淡；3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g、h 7 個(gè)點(diǎn)較深，a 點(diǎn)較淡；4（清蒸45 min）的b、c、d、g、h 5 個(gè)點(diǎn)較深；5（清蒸60 min）的b、c、d、f、g、h 6個(gè)點(diǎn)較深。不同時(shí)間清蒸大棗比較，3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g 6個(gè)點(diǎn)最深。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的g、h 兩個(gè)點(diǎn)較深，b 點(diǎn)較淡；3（清蒸30 min）的g點(diǎn)較深，d、e兩個(gè)點(diǎn)較淡；4（清蒸45 min）的c、e、g、h 4個(gè)點(diǎn)較深；5（清蒸60 min）的c、d、e、f、g、h 6個(gè)點(diǎn)較深。不同時(shí)間清蒸大棗相比：5（清蒸60 min）的d、e、h3個(gè)點(diǎn)較深。

2.5.2 供試品2 吸取供試品2約10 μL點(diǎn)樣，在薄層板上依次點(diǎn)1 生品、2 清蒸大棗（15 min）、3 清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min），以三氯甲烷∶丙酮（10∶0.5）為展開(kāi)劑、展開(kāi)完全后用10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日照和紫外光365 nm 下觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖5。

圖5 供試品2的薄層鑒別圖譜

由圖5可以看出，供試品2在日照下圖譜中共有6個(gè)清晰且分離度較好的斑點(diǎn)；在紫外光365 nm下圖譜中共有5個(gè)清晰且分離度較好的斑點(diǎn)。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b 2個(gè)點(diǎn)較深；3（清蒸30 min）的a、b、c、d、f 5個(gè)點(diǎn)較深；4（清蒸45 min）的b、e、f 3 個(gè)點(diǎn)較深；5（清蒸60 min）的b、f 2個(gè)點(diǎn)較深；a、c、e 3個(gè)點(diǎn)較淡。不同時(shí)間清蒸大棗相比：3（清蒸30 min）的a、b、c、d 4個(gè)點(diǎn)最深；4（清蒸45 min）的e、f 2個(gè)點(diǎn)最深。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的c、d 2個(gè)點(diǎn)比較深；3（清蒸30 min）的c、e 2個(gè)點(diǎn)較深；4（清蒸45 min）的c、e 2 個(gè)點(diǎn)較淡；5（清蒸60 min）的e 點(diǎn)較深。不同時(shí)間清蒸大棗比較，3（清蒸30 min）的c、e 2個(gè)點(diǎn)最深；4（清蒸45 min）的c、e 2個(gè)點(diǎn)最淡。

2.5.3 供試品3 吸取供試品3 約10 μL 進(jìn)行點(diǎn)樣，并在薄層板上點(diǎn)1生品、2清蒸大棗（15 min）、3 清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min）及齊墩果酸對(duì)照品溶液，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（4∶1∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)完全后用10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日照和紫外光365 nm下觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖6。

圖6 供試品3的薄層鑒別圖譜

由圖6可以看出：供試品3在日照下圖譜中共有5 個(gè)清晰且分離度較好的斑點(diǎn)；在紫外光365 nm下共有5個(gè)清晰且分離度較好的斑點(diǎn)，圖6中可以確定c為齊墩果酸。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、c 2個(gè)點(diǎn)較深；新出現(xiàn)了d、e 兩個(gè)點(diǎn)；3（清蒸30 min）的a、c 2個(gè)點(diǎn)較深；4（清蒸45 min）的a 點(diǎn)較淡；5（清蒸60 min）的c點(diǎn)較深；a、b 2個(gè)點(diǎn)較淡。不同時(shí)間清蒸大棗相比：2（清蒸15 min）的a、c 2個(gè)點(diǎn)最深，出現(xiàn)了d、e兩個(gè)新點(diǎn)。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b、c 3個(gè)點(diǎn)較深，新出現(xiàn)了d、e 2個(gè)新點(diǎn)；3（清蒸30 min）的a、b、c 3個(gè)點(diǎn)較深；4（清蒸45 min）的c點(diǎn)較淡；5（清蒸60 min）的a、b、c 3個(gè)點(diǎn)較深。不同時(shí)間清蒸大棗比較2（清蒸15 min）的a、b、c 3個(gè)點(diǎn)最深；出現(xiàn)了d、e 2個(gè)新點(diǎn)。

3 結(jié)論

薄層色譜是一種分離速度快，應(yīng)用廣泛的色譜分析方法，其特點(diǎn)是可以同時(shí)分離多個(gè)樣品，分析成本低［8-9］，是目前《中華人民共和國(guó)藥典》中記載最多的鑒別與有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一，用于藥物中雜質(zhì)的檢查和藥物分析［10］。本試驗(yàn)為設(shè)備、試驗(yàn)成本和技術(shù)要求高的學(xué)術(shù)研究提供了較大研究空間，節(jié)約了人力、物力和財(cái)力。

該試驗(yàn)用薄層色譜法鑒別大棗不同炮制時(shí)間有效成分的變化，并對(duì)不同炮制時(shí)間的大棗建立了薄層鑒別特征圖譜。該圖譜可以區(qū)分生大棗和清蒸大棗，也可以區(qū)分不同炮制時(shí)間下的清蒸大棗，而且根據(jù)圖譜中斑點(diǎn)的顏色變化粗略判斷大棗的炮制程度。供試品1和供試品2的薄層色譜鑒定結(jié)果與《中藥大辭典》大棗清蒸30 min結(jié)果一致。

本試驗(yàn)采用不同提取方法，用薄層色譜對(duì)大棗的不同清蒸品有效成分的變化進(jìn)行研究。預(yù)試驗(yàn)簡(jiǎn)便，能快速確定展開(kāi)條件，但在試驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，影響色譜效果，導(dǎo)致斑點(diǎn)分離度不好，拖尾。試驗(yàn)過(guò)程需要不斷調(diào)節(jié)展開(kāi)條件，保證預(yù)飽和，這樣可以解決邊緣效應(yīng)以及斑點(diǎn)的分離度，預(yù)防拖尾。由于大棗對(duì)照品的缺失和得到困難，我們無(wú)法判斷薄層色譜中每個(gè)點(diǎn)代表什么成分，但是我們可以判斷大棗在炮制前后化學(xué)成分發(fā)生了一定變化，這可以為大棗的炮制以及其他中藥材炮制原理的研究提供一定思路。由于每個(gè)人對(duì)顏色的感知不同，在觀察點(diǎn)的深淺時(shí)會(huì)略有差異，今后我們會(huì)不斷改進(jìn)條件，或者采用一些先進(jìn)設(shè)備，減少人為出現(xiàn)的誤差。