高甘油三酯血癥對大鼠急性胰腺炎模型中胰腺導管上皮細胞間緊密連接的影響研究

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見急腹癥，全球發(fā)病率呈逐年上升的趨勢

。膽石癥、酒精、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是AP的三大常見病因。國內最新一項Meta分析顯示，在我國，高甘油三酯血癥性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic pancreatitis，HTGP)的發(fā)生率已超過酒精性AP，成為繼膽源性胰腺炎之后AP的第二大常見病因

。研究表明，合并HTG的AP患者出現(xiàn)重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)和器官衰竭的比率更高

。動物實驗也顯示HTG可加重AP大鼠胰腺組織損傷

。然而，目前HTGP的發(fā)病機制尚不明確，因此，闡明HTGP的發(fā)病機制、提出更有效的預防和治療措施成為改善HTGP預后的關鍵。細胞間緊密連接(tight junctions，TJs)是維持上皮細胞結構與功能完整的重要超微結構，是維持黏膜屏障功能的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，長期大量游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)刺激，能導致上皮細胞收縮，細胞間TJs減弱，脂質易于浸潤，致使上皮黏膜屏障受到破壞

。本研究通過建立大鼠HTGP模型，觀察胰腺病理改變、胰管上皮細胞超微結構，采用免疫組織化學法、免疫印跡法檢測組織中細胞間緊密連接蛋白脂解刺激脂蛋白受體(lipolysis-stimulated lipoprotein receptor，LSR)、Tricellulin蛋白(TRIC)、ZO-1、occludin、claudin-7的表達，研究HTG對大鼠AP胰腺組織TJs蛋白的影響，進而探討HTGP發(fā)病的特征及可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1.1 實驗動物：4周齡體質量60～80 g的SPF級健康雄性SD大鼠，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心(動物許可證號：SCXK桂2014-003)。

1.1.2 實驗分組：48只SD大鼠隨機分為普通飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)組，兩組各24只,分別給予普通飼料及高脂飼料(82.8%普通飼料+15%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂養(yǎng)。4周后行眶后靜脈取血檢測血清甘油三酯(triglyceride,TG)水平。普通飼養(yǎng)組進一步隨機分為C組和AP組，高脂飼養(yǎng)組隨機分為HTG組和HTGP組,每組各12只。AP組和HTGP組經腹腔注射雨蛙肽誘發(fā)AP，劑量為50 μg/kg，分7次注射，每次間隔1 h；C組和HTG組經腹腔注射同等劑量生理鹽水，實驗過程中無小鼠死亡。各組于造模后24 h、48 h處置大鼠，腹正中切口打開腹腔，循胃流出道方向找到十二指腸，暴露十二指腸內側的胰腺組織，觀察胰腺大體病變情況，主胰管位于胰腺組織靠近十二指腸降部位置，為一白色半透明導管自肝門延伸至十二指腸降部，分離主胰管置2%的鋨酸固定液固定，取適量胰腺組織于4%多聚甲醛溶液固定，我院分離剩余胰腺組織置-80 ℃冰箱保存。本實驗經我院倫理委員會批準，批號：202005011。

普通飼養(yǎng)大鼠血清呈清亮淡黃色，高脂飼養(yǎng)大鼠血清呈混濁乳糜樣，普通飼養(yǎng)組和高酯飼養(yǎng)組大鼠的血清TG水平分別為(323.15±71.33)μmol/L和(537.06±142.45)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖1)。

該研究是對吉安（油田話）的單字調調值的第一次具體研究，通過所得的實驗數(shù)據，得出結論：年青者（23歲）調類的基頻整體上低于其他兩位年長發(fā)音人的基頻，年長者（68歲）的陽平尾端有明顯的下降，不同于其他兩位發(fā)音人，說明年齡差異影響到調類變化，歷史上陽平有可能是個升降調，為了證明這一想法，筆者將會在另一論文中進行證明。因此，暫且認為油田方言總共有四個調類，陰平，陽平，上聲和去聲，入聲歸入陰平和去聲。

正長斑巖（K1ξπ）：出露于沃布滾陶勒蓋、森德敖林等地，呈小巖株狀產出，巖體侵入白音高老組、寶力高廟組組和安格爾音烏拉組。花崗閃長斑巖（K1 γδπ）：出露于吉仁臺高吉高爾高地一帶，呈小巖株狀產出，巖體侵入寶力高廟組和白音高老組。

C組大鼠胰腺組織鏡下無明顯病理改變，HTG組胰腺組織偶有輕微小葉間水腫，部分見炎癥細胞浸潤，HTG組病理評分高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)；AP組及HTGP組胰腺病理損傷以水腫、炎癥細胞浸潤為主，偶有出血，未見明顯胰腺壞死，以24 h病理損傷最明顯；各時點的AP組和HTGP組病理評分均顯著高于C組及HTG組(

<0.05)，各時點的HTGP組病理評分與相應時點的AP組間差異無統(tǒng)計學意義(

>0.05)，但HTGP 24 h組與AP 48 h組病理評分差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖2)。

鏡下可見LSR、claudin-7主要表達在細胞質頂端近細胞膜處，以腺泡細胞表達顯著；TRIC主要表達在細胞膜上，以胰腺導管上皮細胞表達顯著；occludin主要在腺泡細胞膜處濃聚，細胞質也有較多量表達，胰腺導管上皮細胞少量表達。HTG組LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達低于C組，其中LSR和TRIC表達差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)；鏡下可見AP組與HTGP組細胞膜上的TJs蛋白均明顯減少，AP 24 h組LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達均低于C組(

<0.05)，HTGP 24 h組上述蛋白表達低于HTG組(

<0.05)；HTGP 24 h組的LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達低于AP 24 h組，其中LSR和TRIC在HTGP 24 h組和AP 24 h組表達差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖3)。

“情”乃是人們的個人情感，是人們在某件事情發(fā)生后，判斷、評價這件事情發(fā)生過程中的道德行為時的內心活動。道德情感基于個人的道德認識，顯然兩者關聯(lián)密切、互相促進，道德行為的內在動力就是個人的道德情感。

2 結果

1.2.1 胰腺組織病理學檢查：胰腺組織經4%多聚甲醛固定72 h后常規(guī)行石蠟包埋、切片、HE染色，根據Van Laethem標準(見表1)

從水腫、炎癥細胞浸潤、腺泡壞死3個方面進行雙盲胰腺病理評分。

西方文藝復興的出現(xiàn)。荷蘭學者伊拉斯謨(Erasmus)在給朋友的一封信中提到，歐洲將迎來一個歷史上的“黃金時刻”，法國人稱為“文藝復興”，“這個復興就是指突然而又不可逆轉地使歐洲人與世界上其他人區(qū)分開來的力量?！盵5]283從學術到藝術，新思想競相迸發(fā)，文藝復興表現(xiàn)出一個驚人的方面，即重修文物的行為產生了發(fā)明和開放式求知這樣的非傳統(tǒng)文化。新思想從佛羅倫薩一路傳播至葡萄牙、波蘭以及英國。文藝復興的出現(xiàn)給西方，尤其是歐洲國家?guī)砹宋幕I域的繁榮，而這種繁榮迫使15世紀的歐洲經歷了兩次結局不同的軸心思想的影響。與其說是新冒險的發(fā)現(xiàn)，倒不如說是西方的治理文明是試圖擴張政治的影響力。

三、我國獸醫(yī)管理體制改革的建議機構不健全、基層動物防疫體系薄弱，缺乏專業(yè)人才，法律不完善、等問題，嚴重影響了動物疫病防治能力和動物產品質量安全水平的提高。加之目前國際上特別是我周邊國家重大動物疫病時有發(fā)生，甚至出現(xiàn)局部蔓延，對我國防控重大動物疫病形成較大壓力。因此，改革獸醫(yī)管理體制已經成為當前十分緊迫的任務。

1.2.2 免疫組織化學法檢測胰腺組織LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達量：取C組、AP 24 h組、HTG組和HTGP 24 h組胰腺石蠟切片經脫蠟、水化、枸櫞酸鈉溶液微波抗原修復20 min，用通用型SP-9000免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋公司)行內源性過氧化物酶阻斷10 min、山羊血清封閉20 min，一抗LSR(1∶200，英國Abcam，貨號:ab232780)、TRIC(1∶100，美國Sigma-Aldrich，貨號:SAB1306444)、occludin(1∶1 000，武漢三鷹，貨號:13409-1-AP)、claudin-7(1∶100，上海生工，貨號:D151730)4 ℃孵育過夜，再予山羊抗兔IgG聚合物室溫孵育15 min、HRP標記鏈酶卵白素常溫孵育10 min、DAB顯色5 min、蘇木精復染1 min，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察胰腺組織的染色強度及范圍。每張切片隨機選取5個高倍視野(放大400倍)，應用Image-Pro Plus 6.0軟件獲取平均光密度值(

)行半定量分析。

1.2.3 主胰管上皮細胞透射電鏡觀察：取C組、AP 24 h組、HTG組、HTGP 24 h組大鼠主胰管組織經固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后，在透射電鏡(日立H-7650)下觀察主胰管上皮細胞超微結構及TJs變化。

C組及HTG組主胰管上皮細胞可見TJs、橋粒/半橋粒連接，AP 24 h組及HTGP 24 h組主胰管上皮細胞TJs較C組及HTG組減少，甚至消失，且細胞間隙明顯增寬，其中HTGP 24 h組細胞間隙較AP 24 h組增寬更明顯(見圖4)。

3 討論

TJs是由多種蛋白及分子構成的具有多種功能的大分子復合物，廣泛存在于所有上皮或內皮細胞間連接的最頂端，并且具有屏障功能

。TJs包括雙細胞間緊密連接(bicellular tight junctions，bTJs)和三細胞間緊密連接(tricellular tight junctions，tTJs)。bTJs主要是由occludin和claudins蛋白家族連接構成。tTJs則由TRIC和angulins蛋白家族組成。

動物研究表明，在AP時，胰腺腺泡細胞及導管上皮細胞膜occudin、claudins蛋白、ZO-1表達均減少或消失

。本研究結果與前述研究類似：occludin、claudin-7和ZO-1在胰腺炎組的表達均低于非胰腺炎組。TRIC位于三細胞連接的頂部，是維持上皮屏障的重要結構。它在正常人體胰腺腺泡和導管細胞均有定位表達，而胰島細胞中無表達，TRIC在分化良好的胰管腺癌中過表達，但在低分化腺癌中表達較弱

。LSR，又稱angulin-1，是angulins蛋白家族中發(fā)揮作用的核心蛋白，定位于三細胞連接的中心，主要作用是調控TRIC的表達，募集TRIC于三細胞連接處，維持tTJs的形態(tài)

，敲除LSR后，細胞膜上TRIC的表達也隨之消失

。體外研究表明，敲除LSR后，正常人胰腺導管上皮細胞及子宮內膜細胞的上皮屏障均受到破壞，而人胰腺癌細胞及子宮內膜癌細胞的遷移、侵襲、增殖能力明顯增強

，用EGF或TGF-β治療后可增加LSR的表達，并誘導LSR和TRIC從tTJs定位到bTJs

。正如前所述，目前關于TRIC和LSR的研究大多與腫瘤性疾病相關，而與AP相關研究極少。在本研究中，TRIC和LSR在AP狀態(tài)下表達減少，與胰腺損傷程度成反比，提示可能因TRIC和LSR表達下降所致的黏膜屏障損傷而加重胰腺病理損傷。

此外，本課題組前期研究表明，HTG患者更容易出現(xiàn)SAP，其發(fā)生風險與血清TG水平呈正相關

，動物模型也提示HTGP大鼠胰腺病理損傷比非高脂AP更嚴重

。在本研究中，HTGP的胰腺損傷亦重于非高脂的AP模型。此外，本研究尚顯示tTJs相關蛋白TRIC和LSR在HTGP中表達下降程度亦高于AP模型，而bTJs相關蛋白表達則無上述情況，提示在AP過程中，HTG可能通過削弱胰腺上皮細胞的TJs加重胰腺病理損傷，且該作用可能更多作用于tTJs而非bTJs。

本研究結果顯示，緊密連接蛋白LSR、TRIC、ZO-1、occludin、claudin-7在HTG及HTGP大鼠胰腺組織中表達較非高脂模型下降，其中以tTJs相關蛋白LSR及TRIC下降更明顯，提示AP時，HTG可能通過削弱胰腺上皮細胞TJs，尤其是tTJs加重胰腺損傷，為HTGP的治療提供新思路。

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