超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取凈化測定牛奶中阿苯達(dá)唑及其主要代謝物殘留量

賀習(xí)文，雷浩，趙雪寧，馬川，高勤葉，李易軒

（陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測股份有限公司，渭南 714000）

阿苯達(dá)唑（ABZ）是一種咪唑衍生物類廣譜驅(qū)蟲藥物，可用于驅(qū)除蛔蟲、蟯蟲、絳蟲、鞭蟲、鉤蟲、糞圓線蟲等，憑借“高效低毒”的藥理性成為最主要的驅(qū)腸道線蟲藥物，在全世界范圍內(nèi)被廣泛使用[1,2]。ABZ在人和動物體內(nèi)通過肝粒酶轉(zhuǎn)化成阿苯達(dá)唑砜（ABZSN）和阿苯達(dá)唑亞砜（ABZSX）。ABZSN為主要殺蟲成分，可對腸道線蟲選擇性及不可逆性地抑制寄生蟲腸壁細(xì)胞胞漿微管系統(tǒng)的聚合，阻斷其對多種營養(yǎng)和葡萄糖的攝取吸收，導(dǎo)致蟲體內(nèi)源性糖原耗竭，并抑制延胡索酸還原酶系統(tǒng)，阻止三磷酸腺苷的產(chǎn)生，致使蟲體無法生存和繁殖[3～5]。

我國已逐步實現(xiàn)奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖，相應(yīng)的牛場中寄生蟲病的問題也日漸突出。為了應(yīng)對寄生蟲病，ABZ等苯并咪唑類驅(qū)蟲藥物起到了重要作用，但同時藥物極可能在奶牛體內(nèi)代謝后殘留在鮮奶中，導(dǎo)致乳品質(zhì)降低的同時，還會對人類的健康產(chǎn)生一定的危害[6,7]。

雖然ABZ毒性較低，但母畜長時間使用會對胎兒有致畸作用和胚胎毒性。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國際食品法典委員會都對牛奶中ABZ限量進(jìn)行了規(guī)定，要求不得超過100μg/kg。目前，已有報道的有關(guān)ABZ及其代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜法[8～13]、酶聯(lián)免疫法[14,15]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16～20]等，但此類報道多是針對動物組織、阿苯達(dá)唑藥片、動物血漿以及水產(chǎn)品等基質(zhì)，難以適用于高蛋白的牛奶基質(zhì)。本研究建立了適用于牛奶基質(zhì)中ABZ及其代謝物的檢測方法，采用含有1%乙酸的乙腈提取牛奶中ABZ及其代謝物，通過氮吹手段轉(zhuǎn)換溶劑后，經(jīng)C18固相萃取柱凈化，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，取得了良好的試驗效果。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Ultimate 3000型超高效液相色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；TSQ Quantiva三重四級桿質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；H1850R型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；CP224C型萬分之一天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；MX-S型渦旋混合儀[大龍興創(chuàng)儀器（北京）股份有限公司]；KQ-100DB型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MTN-4800A型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

阿苯達(dá)唑（ABZ，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，純度97.2%）；阿苯達(dá)唑砜（ABZSN，阿爾塔科技有限公司，純度99.0%）；阿苯達(dá)唑亞砜（ABZSX，阿爾塔科技有限公司，純度98.0%）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；冰乙酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；碳酸氫鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；碳酸鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1%乙酸的乙腈溶液：吸取冰乙酸10mL于1 000mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻。

0.1mol/L碳酸氫鈉溶液：稱取8.4g碳酸氫鈉，用水溶解定容至1 000mL。

0.1mol/L碳酸鈉溶液：稱取10.6g碳酸鈉，用水溶解定容至1 000mL。

碳酸鹽緩沖溶液：將0.1mol/L碳酸氫鈉溶液700mL和0.1mol/L碳酸鈉溶液100mL混合，搖勻。

C18固相萃取柱，200mg/3mL（月旭科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Hypersil GOLDC18色譜柱（100×2.1mm，1.9μm）；柱溫：40℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.2mL/min；梯度洗脫程序：0～2min，10%B；2～5min，10%B～80%B；5～7min，80%B；7～7.1min，80%B～10%B；7.1～10min，10%B；進(jìn)樣量：2μL。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；噴霧電壓：3 500V；鞘氣壓力：35Arb；輔助氣壓力：10Arb；傳輸管溫度：350℃；霧化器溫度：150℃；各待測物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.2 樣品處理

提?。簻?zhǔn)確稱取2.00g牛奶試樣，置于50mL具塞離心管中，加入10mL含1%乙酸的乙腈溶液，渦旋混合1min，超聲提取10min，在4℃以8 000r/min離心5min，準(zhǔn)確移取上清液3mL于10mL離心管中，在40℃氮氣吹至近干，加入3mL碳酸鹽緩沖溶液混勻。

凈化：取C18固相萃取柱，先后用3mL甲醇、3mL水、3mL碳酸鹽緩沖溶液活化，將上述樣液全部轉(zhuǎn)入C18固相萃取柱中，控制流速不超過1mL/min，待樣液全部通過萃取小柱后，用5mL水淋洗，抽干30s，用5mL乙腈洗脫，收集洗脫液，在40℃下氮氣吹干，用1mL甲醇復(fù)溶，過0.22μm濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：準(zhǔn)確稱取ABZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01078g、ABZSN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01035g、ABZSX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01065g，分別置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度分別為ABZ 104.8μg/mL、ABZSN 102.5μg/mL、ABZSX 104.4μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-18℃保存。標(biāo)準(zhǔn)混合中間液的配制：準(zhǔn)確移取A B Z、ABZSN、ABZSX標(biāo)準(zhǔn)貯備液各100μL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配制成濃度分別為ABZ 1.048μg/mL、ABZSN 1.025μg/mL、ABZSX 1.044μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液，于-18℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

三種目標(biāo)化合物（圖1）在弱酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，且在酸性條件下易溶解，因此本研究在考慮流動相的配比時，水相優(yōu)先考慮酸性水溶液，LC-MS常用的水相流動相為0.1%甲酸水溶液，可以很好地洗脫大多數(shù)化合物，同時可以更好地保護(hù)色譜柱，另外pH在2.6～2.7（20℃）之間，能夠提供良好的酸性環(huán)境。

圖1 3種目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式（左→右依次為ABZ、ABZSN、ABZSX）

有機(jī)相的選擇上，考慮了常用的甲醇和乙腈兩種有機(jī)試劑，采用甲醇作為有機(jī)相時，ABZ峰型被拉寬，且有很明顯的拖尾現(xiàn)象，ABZSN和ABZSX峰型良好。采用乙腈作為有機(jī)相時，ABZ峰型明顯改善，且在保證三種目標(biāo)化合物分離效果的前提下，出峰時間比甲醇作為有機(jī)相時提前1～2min，綜合考慮，選用乙腈作為有機(jī)相配比。

在洗脫方式上分別測試了等度及梯度洗脫，等度洗脫時ABZ洗脫較慢，有機(jī)相比例提高至60%時，ABZ洗脫較快，但ABZSN和ABZSX無法達(dá)到很好的分離效果。采用梯度洗脫后，三種化合物均能實現(xiàn)很好的分離，且洗脫時間明顯縮短。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以15μL/min的速率注入質(zhì)譜儀，在正、負(fù)離子模式下同時觀察質(zhì)譜圖的變化情況，在正離子掃描模式下，[M+H]+強(qiáng)度最大，因此采用正離子掃描模式，同時調(diào)節(jié)噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力等質(zhì)譜條件，使三種化合物的強(qiáng)度處于最大和最穩(wěn)定狀態(tài)，圖2所示為3種目標(biāo)化合物的總離子流圖。

圖2 3種化合物的總離子流圖（50ng/mL）（上→下依次為ABZ、ABZSX、ABZSN）

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍

使用標(biāo)準(zhǔn)混合中間液配制成一系列的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，以優(yōu)化后的條件對系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液進(jìn)行分析，以濃度作為橫坐標(biāo)、目標(biāo)化合物峰面積作為縱坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，3種目標(biāo)化合物在0.2～50ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.9987，表2為3種目標(biāo)化合物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

表2 目標(biāo)化合物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.2.2 檢出限和定量限

以信噪比法來確定檢出限和定量限。檢出限（LOD）以3倍的信噪比計算，定量限（LOQ）以10倍的信噪比計算，通過不斷減少向基質(zhì)空白中加標(biāo)量的方式來確定LOD和LOQ。結(jié)果表明，當(dāng)3種目標(biāo)化合物的加標(biāo)量為0.5μg/kg時，響應(yīng)值為3倍的信噪比，加標(biāo)量為2μg/kg時，響應(yīng)值為10倍的信噪比。目標(biāo)化合物的檢出限、定量限見表3。

2.2.3 回收率和精密度

使用空白基質(zhì)分別進(jìn)行三組不同濃度的添加回收試驗，其中最低濃度用以驗證檢出限的回收率，中濃度用以驗證定量限的回收率，同時添加一組高濃度用以驗證方法的適用性和穩(wěn)定性。此外，每個濃度各添加6份，連續(xù)測定3d，用測得的試驗結(jié)果來計算日內(nèi)變異系數(shù)（within-day precision）和日間變異系數(shù)（Day to day precision）。試驗所得回收率和精密度見表3。

表3 目標(biāo)化合物的檢出限、定量限、回收率和精密度

從表3可以看出，3種目標(biāo)化合物的回收率為90.8%～101.2%，日內(nèi)變異系數(shù)為0.35%～1.01%，日間變異系數(shù)為0.98%～2.14%，證明本研究回收率和精密度良好。

2.3 實際樣品測定

本研究共測定了23份從養(yǎng)殖場采集的牛奶樣品，經(jīng)測定23份樣品中均未檢出ABZ及其2種代謝物，本組數(shù)據(jù)反映出所采集的牛奶樣品品質(zhì)較好，奶牛未被使用阿苯達(dá)唑驅(qū)蟲藥或藥物并未經(jīng)代謝殘留在牛奶中。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)及固相萃取技術(shù)，建立了一種測定牛奶中ABZ及其2種代謝物的定量方法。經(jīng)過試驗證明，本方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且方法靈敏度高，具有較低的檢出限和定量限，能夠滿足牛奶中ABZ及其2種代謝物的定量分析，同時能夠為牛奶及其制品的質(zhì)量監(jiān)控提供數(shù)據(jù)支撐。