牛病毒性腹瀉-黏膜病研究進展

楊顯超，楊德全，陶田谷晟，鞠厚斌，王建，趙洪進

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

牛病毒性腹瀉-黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的一種以腹瀉、胃腸炎、消化道黏膜腐爛和壞死為特征的持續(xù)性、接觸性的傳染病。該病在世界流行廣泛，已經(jīng)對全球養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重危害，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須上報的疫病。目前，我國的BVD流行范圍廣且日益嚴重、流行毒株基因型眾多，流行特點及流行趨勢不斷出現(xiàn)新特點，危害十分嚴重，對BVD的防控提出了新的挑戰(zhàn)。本文就BVDV的基因分型、流行情況、診斷方法和防控策略等方面作一綜述，以期為BVD的防控工作提供新思路、新對策。

1 牛病毒性腹瀉病毒的基因分型

BVDV基因分型是追蹤BVDV傳播、變異以及持續(xù)感染等極為有效的方法，對了解病毒起源、分布和流行具有重要意義。根據(jù)基因組5’UTR的差異，BVDV可分為BVDV1型和BVDV2型兩種基因型[1]。到目前為止，BVDV1型已被分為22個基因亞型(1a～1v)[2]。我國已有多種亞型的報道，2006年確定了豬源ZM-95株為1m亞型[3]；2013年蘭州獸醫(yī)研究所首次報道了我國西部地區(qū)存在BVDV1q亞型[4]；2015年我國學者調(diào)查表明BVDV1m亞型為國內(nèi)主要流行毒株，其次為1b和1u亞型，其中1u為國內(nèi)首次確認存在的新基因亞型[5]。國內(nèi)學者朱遠茂等[6]對分離到的一株BVDV毒株LJ36/14首次定型為BVDV1v亞型。BVDV2型分為BVDV2a、2b、2c和2d4個亞型[7]。Ridpath等[8]于2010年建議將BVDV2型分為2個亞型，即2a和2b。任敏等[9]、李慶超等[10]在山東、新疆和吉林均分離到BVDV2a亞型毒株，王煒等[11]于2014年在山東分離到BVDV2b亞型毒株?？梢?，國內(nèi)BVDV流行毒株基因亞型復雜多樣。

2 牛病毒性腹瀉病毒的流行狀況

BVDV于1946年首次在北美洲發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)呈全球性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)許多國家血清流行病學調(diào)查結(jié)果顯示[12]：美國牛血清樣品BVDV陽性率為50%，澳大利亞為89%，智利、烏拉圭、秘魯、巴西、阿根廷及哥倫比亞等南美國家平均陽性率高達85%。我國于1980年首次在吉林省發(fā)現(xiàn)該病毒[13]，此后，陳永僩等[14]在北京和四川省送檢的奶牛和牦牛血清樣品中首次檢測到BVDV的中和抗體，從血清學上證實了我國有BVDV感染的存在。隨后許多學者[15～22]對國內(nèi)多個省區(qū)進行了BVDV的流行病學調(diào)查，調(diào)查結(jié)果表明，天津、陜西、甘肅、寧夏、青海、安徽、江蘇、廣西、黑龍江、重慶、新疆、山西、山東、河南、河北、吉林、湖北、內(nèi)蒙古、遼寧、江蘇、西藏和福建等20多個省區(qū)市均有本病的發(fā)生。流行病學調(diào)查表明，各地區(qū)存在不同程度的感染，且有逐年升高的態(tài)勢[18]，而且一些地區(qū)感染相當嚴重[20,23]。國內(nèi)學者Ran等[24]檢索國內(nèi)2003年3月-2018年3月關于奶牛BVDV發(fā)病率和流行率的論文數(shù)據(jù)，運用meta分析法進行系統(tǒng)的回顧和評價，結(jié)果表明我國奶牛BVDV的總陽性率為53.0%（95% CI 40.2～65.7），其中福建省奶牛群BVDV陽性率最高達90.0%，其次為陜西省（88.9%）和山東?。?3.3%）。同時也證實了在過去的十年里國內(nèi)奶牛BVDV的感染呈不斷擴大并廣泛傳播的趨勢。

3 診斷方法

通過流行病學調(diào)查、臨床癥狀和特征性病理變化等可作初步的診斷。如需進一步診斷，須經(jīng)實驗室確診。

3.1 病毒分離

牛腎、脾和睪丸等多種牛源細胞均可用于BVDV的分離。李佑民等[13]在上世紀80年代用初生牛腎原代和次代細胞從流產(chǎn)胎兒脾臟中首次分離到該病毒。1983年，有學者用犢牛腎或睪丸細胞分離到一株BVDV。1986年中國獸藥監(jiān)察所用牛腎傳代細胞也分離到該病毒。如今，牛腎細胞已成為分離BVDV最常用的細胞。但這種方法對試驗條件要求比較高，不適于大規(guī)模的病毒檢測和流行病學調(diào)查，只適用于致細胞病變型的BVDV的分離鑒定。

3.2 血清學檢查

3.2.1 免疫瓊脂擴散試驗

免疫瓊脂擴散試驗因操作簡單易行，在基層獸醫(yī)應用比較廣泛。但其不具備株特異性，準確率不高，易造成漏檢。

3.3.2 病毒中和試驗

病毒中和試驗為國際貿(mào)易指定試驗，也是BVDV檢測的金標準。該方法可定性定量檢測，敏感性較瓊脂擴散試驗高，重復率好，適用于BVDV疫苗免疫效果評估和血清流行病學調(diào)查評估。但是，由于該方法試驗操作復雜且耗時，還容易受到各種因素干擾，目前已經(jīng)不經(jīng)常使用。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)包括檢測抗體的間接ELISA和檢測抗原的抗原捕獲ELISA，具有操作簡便、快速、通量高、易于標準化等優(yōu)點，可廣泛用于BVDV的抗體檢測和流行病學調(diào)查。高欲燃建立了間接ELISA方法用于檢測血清中BVDV E2蛋白抗體，與中和試驗的符合率非常好，適合大量血清樣品的高通量檢測[25]。范晴等[26]建立了檢測BVDV抗原的捕獲ELISA方法，與RT-PCR的符合率為100%，可用于BVDV抗原的檢測。

3.3 分子生物學檢測

3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

根據(jù)已知的BVDV的保守基因序列設計引物，RTPCR可高度靈敏、特異快速地檢測病毒RNA；或利用不同基因型中保守序列的差異分別設計引物，對BVDV進行基因分型。王偉利等[27]根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設計特異性引物用于建立檢測BVDV的RT-PCR方法，結(jié)果顯示與病毒分離試驗的符合率達100%。根據(jù)BVDV1型和BVDV2型5’UTR序列的差異，分別設計特異性引物，建立可同時檢測BVDV1型和BVDV2型的RT-PCR方法，可用于BVDV的快速分型檢測[28]。

3.3.2 實時熒光定量RT-PCR

實時熒光定量RT-PCR檢測方法與RT-PCR檢測方法相比，具有特異性高、敏感性強、快速和重復性好等優(yōu)點，可以對BVDV進行早期診斷，及時發(fā)現(xiàn)病源，且可以實現(xiàn)快速、準確檢測。陳其兵等[29]根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設計特異性引物和探針，優(yōu)化建立了熒光定量RT-PCR檢測方法。

3.3.3 熒光環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)（RT-LAMP）

熒光環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)用于BVDV的檢測，靈敏度高、特異性好，且具有成本低、快速的優(yōu)點，尤其適用于現(xiàn)場檢測，為BVDV的檢測提供了新的技術(shù)方法，對BVDV的有效防制具有重要意義。國內(nèi)學者根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設計了多條特異性引物，建立了BVDV的RT-LAMP快速檢測方法[30,31]，為該病的檢測增添了光彩。

4 防控措施

流行性腹瀉是世界養(yǎng)牛業(yè)的一種重要疫病，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，很多發(fā)達國家非常重視本病的防控和凈化。目前，發(fā)達國家對BVD的防控策略主要分為兩種：一種是不使用疫苗的“篩查-淘汰”策略，這一策略需要嚴格的生物安全管理，適合低密度養(yǎng)牛地區(qū)，已在北歐的瑞典、挪威等一些國家取得了成功。另一種是使用疫苗的“免疫-淘汰”策略，適合高密度養(yǎng)牛地區(qū)，已在美國和德國取得成功。借鑒發(fā)達國家防控BVD的成功經(jīng)驗，制定符合我國國情的防控策略，已成為控制BVD的當務之急?；谖覈壳癇VDV的感染狀態(tài)，“免疫-淘汰”策略更適合我國當前牛場的BVDV控制[32]。

4.1 疫苗免疫

國外防控經(jīng)驗證明，疫苗免疫在防控和凈化BVDV中發(fā)揮了有效的作用，是防控本病的一個重要手段。鑒于我國各地牛群BVDV感染很普遍且血清抗體陽性率很高，用疫苗高密度全群免疫，可以提升整體抗體水平，阻斷牛群個體間的傳播途徑，有效遏制BVDV的循環(huán)感染。

4.2 定期監(jiān)測

定期對牛群進行監(jiān)測，可以全面了解牛群感染與免疫狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰病牛，控制傳染源。同時可便于調(diào)整并完善免疫方案，確保最佳免疫效果。

4.3 淘汰持續(xù)性感染牛（PI牛）

PI牛是BVDV的最主要傳染源，及早篩查發(fā)現(xiàn)并淘汰PI牛，對本病的防控具有重要意義。其是有效控制和凈化BVDV的最佳方法，是保障牛群長期安全的關鍵措施。

4.4 加強生物安全工作

要加強飼養(yǎng)管理，實施嚴格的生物安全措施，全面提高防疫管理水平，嚴格控制牛只的移動，加強牛只的檢疫和管理，堅持自繁自養(yǎng)，做好引種、引精工作，切斷BVDV的外來傳播途徑。通過對各個環(huán)節(jié)的嚴格控制，最終達到控制和凈化BVD的目的。