牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物檢測研究進展

岳婷婷，閆磊, ，閆躍飛, ，高娜，任小麗，皇超英，潘磊，侯玉芳，張震,

（1.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定有限公司，鄭州 450000；2.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心，鄭州 450000）

β-內(nèi)酰胺類藥物(Beta-lactam)是一類廣譜抗菌藥，也是自然界發(fā)現(xiàn)最早的抗生素。其不僅包含青霉素類藥物，還有頭孢菌素類（四代）、單酰胺環(huán)類（氨曲南）、碳青霉烯類（亞胺培南）等，此類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，是現(xiàn)有的抗生素中使用最廣泛的一類。其抗菌機理為繁殖期殺菌藥，對多數(shù)革蘭氏陽性和陰性菌引起的疾病，如乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、口蹄疫、酮病、蹄病[1]、牛流行熱等有很好的療效，對各種螺旋體和放線菌疾病也有很強的抑制作用。隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，市售乳制品種類也逐漸增加，隨之而來的是一系列質(zhì)量安全問題，其中，個別養(yǎng)殖戶對藥物的過度使用、非法添加、代謝殘留等問題對奶業(yè)發(fā)展造成了一定的影響。因此，對牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量進行監(jiān)管很有必要。

1 β-內(nèi)酰胺類藥物在奶牛中的應(yīng)用現(xiàn)狀

Van Boeckel等[2]對2000年和2010年全球抗生素消費量的研究發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類藥物在全國各地使用廣泛且頻繁。從2012-2017年抗生素銷售量并對該數(shù)據(jù)進行監(jiān)測分析發(fā)現(xiàn)，2012-2015年抗生素的總消費量從16.07DID增加到17.44DID（DID代表1 000名居民每天抗生素的消耗量），然后在2017年下降到11.35DID。其中青霉素是最常用的抗生素類，占總DID的36.32%[3]。

國內(nèi)外有很多報道使用β-內(nèi)酰胺類藥物來治療奶牛疾病，如靳菊賢使用480萬單位青霉素鈉輔以5g硫酸鏈霉素進行肌內(nèi)注射來治療牛流行性熱[4]；章建喜等人分別通過子宮注射和輸液兩種方式使用青霉素來治療奶牛子宮內(nèi)膜炎[5]。經(jīng)統(tǒng)計，我國部分地區(qū)奶牛場最常用β-內(nèi)酰胺類包括氨芐西林、阿莫西林、青霉素、頭孢噻呋等[6～13]。

2 β-內(nèi)酰胺類藥物作用機理

β-內(nèi)酰胺類藥物主要是在細胞繁殖期起殺菌作用[14]，其作用機制主要是干擾細菌細胞壁的合成。β-內(nèi)酰胺類藥物的結(jié)構(gòu)與細胞壁的成分黏肽結(jié)構(gòu)中的D-丙氨酰-D丙氨酸近似，可與后者競爭轉(zhuǎn)肽酶，阻礙黏肽的形成，造成細胞壁的缺損，使細菌失去細胞壁的滲透屏障，對細菌起到殺滅作用。

3 β-內(nèi)酰胺類藥物殘留帶來的危害

過敏反應(yīng)是β-內(nèi)酰胺類藥物帶來的最常見危害之一，發(fā)生率最高可達5%～10%，主要表現(xiàn)為皮疹、血管性水腫，最嚴(yán)重者為過敏性休克，搶救不及時甚至?xí)斐伤劳觥?/p>

除了引發(fā)毒性，β-內(nèi)酰胺類藥物的過度使用也是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，已經(jīng)引發(fā)了多種菌株的耐藥性。Seligsohn等人使用加州實驗法（CMT）、細菌培養(yǎng)法和MALDI-TOF質(zhì)譜分析法對來自肯尼亞的798份牛奶樣品進行了篩選，對分離出的菌株進行藥敏試驗發(fā)現(xiàn)均對多種β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，只有部分金黃色葡萄球菌較敏感[15]。Yu等人從我國東北地區(qū)收集的奶樣[16]，Ren等人從新疆南部收集的奶樣[17]，Josef Bolte等人從德國北部收集的奶樣[18]，F(xiàn)ikru Gizaw等人從埃塞俄比亞奧羅米亞中部五個地區(qū)屠宰場和奶牛場收集的奶樣，進行藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，分離出的菌株對青霉素等均具有顯著耐藥性[19]。

4 牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測方法

4.1 微生物檢測法

β-內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測方法有很多，微生物檢測法是較為經(jīng)典的方法。主要分為微生物抑制試驗、氯化三苯四氮唑法和微生物受體檢驗法三種[20～22]。其基本原理主要是利用是否出現(xiàn)抑菌圈或者根據(jù)細菌與指示劑的顏色變化來判定是否存在β-內(nèi)酰胺類藥物殘留。這種方法成本較低，但是靈敏度差，操作簡單但是費時費力。

1944年，F(xiàn)oster和Wood Ruff創(chuàng)建管碟法，在此方法基礎(chǔ)上，Mee Wes和Mlosevic發(fā)現(xiàn)使用藤黃八迭球菌來檢測青霉素效果更好。1955年時，Neel和Calbert提出使用氯化三苯四氮唑法檢測牛乳中青霉素含量[23]。在1989年，李青等人在使用氯化三苯四氮唑（TTC）試驗來測定乳中有無青霉素殘留時發(fā)現(xiàn)[24]，當(dāng)樣品所含青霉素濃度低于0.003IU/mL時，用TTC法進行檢測結(jié)果均為陰性。除了方法本身的靈敏度，這可能跟制備菌液的用量和濃度等相關(guān)。孫晶瑋等人在進行研究時發(fā)現(xiàn)[25]在制備菌液時，隨著接種量的減少，青霉素得檢出量也隨之降低。而接種量過高，會容易引起假陰性結(jié)果發(fā)生。不僅如此，菌活力的大小也有可能影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[26]。

4.2 免疫分析法

免疫分析法[27]具有靈敏度高、特異性強、處理量大等優(yōu)點，可以快速檢測出牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物是否超標(biāo)。其基本原理是抗原抗體的競爭性結(jié)合，常用方法為酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）、熒光免疫測定法(FIA)和放射免疫法。ELISA試劑盒檢測與其他方法相比，由于用量小、前處理簡單、檢測時間短，而被牧場和企業(yè)廣泛用于檢測青霉素類藥物殘留。

但是免疫分析法影響因素較多，隨著檢測時間的變化極可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性，僅能夠用于半定量檢測，與儀器分析法相比靈敏度略差。且試劑盒一次最多只能同時檢測幾種藥物，不能夠覆蓋整類藥物。

4.3 儀器分析法

儀器分析法借助了色譜的良好分離效能、高靈敏度和精確度，達到了定量檢測的水平。目前能夠定量且應(yīng)用最廣泛的還是與紫外(UV)、熒光、二級管陣列等檢測器或質(zhì)譜聯(lián)用的液相色譜分析法。

4.3.1 液相色譜法

液相色譜分析以液體為流動相，色譜柱為固定相，由于化合物極性的不同在柱內(nèi)被分離后，進入不同類型的檢測器進行檢測。由于其具有高靈敏度、高分離度，從而應(yīng)用范圍廣，超過70%的有機化合物均適用于此法。

Noorfatimah Yahaya等人[28]合成了COU-2，并將其用作分散微固相中的吸附劑，用于高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）分析牛奶中的三種β-內(nèi)酰胺類藥物。該方法檢測限為2.0～3.3ng/mL，回收率達到了80.3～99.5%。Victoria Samanidou等人[29]使用織物相吸附萃?。‵PSE）作為提取介質(zhì)代替了樣品前處理中的蒸發(fā)溶劑和氮吹等耗時耗力的步驟，結(jié)合液相色譜二極管陣列檢測對氨芐青霉素、氯沙西林、雙氯西林、奧沙西林進行了分析，確定該方法定量限（芐青霉素除外）小于歐洲法規(guī)設(shè)定的最大殘留限量（MRL）。

4.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

隨著科技的進步，儀器性能的提高也是日新月異，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)憑借更高的靈敏度和精確度已成為了檢測食品安全最常用的方法之一。GB/T 21315-2007、GB/T 22975-2008和SN/T 2050-2008等均對牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物液質(zhì)殘留檢測方法進行了規(guī)范。由于儀器、試劑耗材等型號、品牌的不同在流速和進樣量的選擇上略有不同[30～32]，各種方法回收率也各有差異。經(jīng)過驗證，多數(shù)方法回收率基本集中在60%～75%。回收率低的原因有很多，可能是固相萃取柱損耗、色譜柱分離效果不好、提取試劑選擇不當(dāng)?shù)鹊取ouise[33]、Delia[34]、Luca[35]、王浩[36]、王承平[37]等人通過多種嘗試，回收率有明顯提高。

現(xiàn)在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用已經(jīng)是一項成熟的技術(shù)，但是由于牛奶基質(zhì)中存在很多脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，需經(jīng)過一系列的提取、分離、凈化步驟才能進行檢測。因此前處理工作較為復(fù)雜，且該設(shè)備體積較大、價格昂貴，在小型企業(yè)或牧場難以推行，僅適用于部門檢驗檢測部門。

4.4 其他方法

除此之外還有一些新技術(shù)如表面等離子體共振（SPR）生物傳感器和蛋白質(zhì)芯片（Protein chip）技術(shù)，分別是應(yīng)用了免疫學(xué)原理與根據(jù)生物分子特性建立的技術(shù)。

Miura等人于1981年就開始研究使用酶免疫傳感器檢測牛奶中的青霉素殘留。隨著電子信息科技的發(fā)展，生物傳感器的研究也更加多樣化。為了測定β-內(nèi)酰氨類抗生素，Setford等人研究了一種受體結(jié)合蛋白電流親合傳感器，Gustavsson等人開發(fā)了基于一種羧基肽酶的微生物受體蛋白生物傳感器技術(shù)[38]，Thavarungkul等人研制了一種非標(biāo)記型的阻抗免疫生物傳感器。多種結(jié)果均表明該法對β-內(nèi)酰胺類藥物具有很高的靈敏性[39]。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種新興的生物檢測技術(shù)，金娜等人基于免疫競爭的原理，建立了呋喃唑酮代謝物的檢測方法。事實證明，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)也可以用于進行獸藥殘留檢測[40]。

但是這些依靠新興技術(shù)開發(fā)的檢測方法目前尚不成熟，還處于研究階段，并不能被廣泛使用。

5 總結(jié)

β-內(nèi)酰胺類藥物的使用范圍廣泛，耐藥性嚴(yán)重，現(xiàn)在關(guān)于β-內(nèi)酰胺類藥物檢測方法主要包括：微生物法、免疫分析法和儀器分析法三類。微生物法操作繁瑣、肉眼觀察誤差大；免疫分析法不能定量，易出現(xiàn)假陽性或假陰性；儀器分析法由于試劑耗材、提取方法、凈化過程、儀器型號等的不同，最終回收率也有很大差異?，F(xiàn)代化儀器更新速度快、靈敏度更高，在現(xiàn)有條件的基礎(chǔ)上，為簡便操作流程、提高操作效率，有必要建立一種較為簡便的前處理步驟，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立更加靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法，為牧場常用的β-內(nèi)酰胺類藥物如氨芐西林、阿莫西林、雙氯西林、苯唑西林、頭孢氨芐等在牛奶中的殘留檢測提供新思路。