廣東省鳳尾蕨屬植物抗白血病藥物研究

曾德貴，馮東輝

（1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳518020；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518107）

鳳尾蕨屬植物為傳統(tǒng)中藥材，目前已發(fā)現(xiàn)300余種該屬植物，我國(guó)約有66種，有24種可入藥［1］。半邊旗Pteris semipinnataL、劍葉鳳尾蕨Pteris ensiformisBurm、刺齒鳳尾蕨Pteris disparkze、蜈蚣草Pteris vittata和井欄邊草Pteris multifida是廣東地區(qū)常見的鳳尾蕨屬植物，具有清熱利濕、利尿、消食、殺蟲等功效，民間常用于治療疳瘡、濕疹、蛇蟲咬傷等［2］。半邊旗的水提物和醇提物抗腫瘤作用好，且無明顯毒性［3］，其作為民間常用中草藥被收載為廣東地區(qū)地方習(xí)用藥材標(biāo)準(zhǔn)品種，其余4種藥用植物的抗腫瘤研究在國(guó)內(nèi)外均少見報(bào)道。為了充分利用廣東地區(qū)的中草藥資源，本研究中探討了這5種藥物對(duì)人早幼粒白血病HL?60細(xì)胞株（簡(jiǎn)稱HL?60細(xì)胞）和人慢性髓樣白血病K562細(xì)胞株（簡(jiǎn)稱K562細(xì)胞）的生長(zhǎng)抑制作用，以開發(fā)新的抗白血病藥物。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：371型CO2孵箱、ST 40R型超速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；ME104E型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.001 g）；Malab WT100?2型水浴箱（杭州米歐儀器有限公司）；索氏提取器（北玻股份有限公司，規(guī)格為50 mL）；37XB型倒置生物顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）。

試藥：半邊旗、劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草均采自廣東湛江湖光巖地區(qū)，井欄邊草采自廣東省廣州市郊，經(jīng)廣東省中藥研究所曾慶錢主任中藥師鑒定均為正品；RPMI?1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)為1737734）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)為20190202）；甲醇、乙醇、二甲基亞砜均為分析純。

細(xì)胞：HL?60細(xì)胞（上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）；K562細(xì)胞（廣州市腫瘤研究所）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：將HL?60細(xì)胞和K562細(xì)胞置含10%滅活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI?1640完全培養(yǎng)基中，置溫度為37℃、飽和相對(duì)濕度為0.05%的CO2孵箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞數(shù)達(dá)1×109個(gè)/L前用完全培養(yǎng)基重新懸浮，并以1∶3細(xì)胞數(shù)的比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

供試品溶液制備：取半邊旗、劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草、井欄邊草各2 g，剪碎，過80目篩，制成粗粉，分別置索氏提取器中，加入95%乙醇適量，回流提取6 h，提取液用甲醇定容至50 mL容量瓶中；并以6 000 r/min的速率離心15 min，分別準(zhǔn)確量取10 mL，50℃水浴至甲醇蒸干，加入二甲基亞砜，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0 g/L的系列供試品溶液。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL?60細(xì)胞和K562細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基稀釋至（1.0～2.0）×108個(gè)/L，分別裝入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，每孔細(xì)胞分別加入1 μL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，另吸取1μL二甲基亞砜作為對(duì)照（供試品質(zhì)量濃度為0 g/L），做3～6個(gè)平行孔，將細(xì)胞置溫度為37℃、飽和相對(duì)濕度為0.05%的CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，分別取出，用臺(tái)盼藍(lán)染色，3 min內(nèi)用計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，采用37XB型倒置生物顯微鏡觀察，死細(xì)胞顯淡藍(lán)色；活細(xì)胞拒染，顏色無明顯變化。以公式［細(xì)胞存活率（%）=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%］計(jì)算細(xì)胞活存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

由表1可知，5種鳳尾蕨屬植物對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用；半邊旗對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，其次為蜈蚣草。

表1 5種鳳尾蕨屬植物對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用比較Tab.1 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of K562 cells

2.2 對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

由表2可知，5種鳳尾蕨屬植物對(duì)HL?60細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用；半邊旗和刺齒鳳尾蕨對(duì)HL?60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)，試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)兩者的作用差異不顯著，而劍葉鳳尾蕨和蜈蚣草的抑制作用較弱。

表2 5種鳳尾蕨屬植物對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用比較Tab.2 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of HL-60 cells

3 討論

半邊旗中二萜類有效成分pteisolic acid G（PAG）可提高Bax/Bcl?2基因和蛋白質(zhì)的比值，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡［4］；5F（11α?羥基?15?氧?16?烯?貝殼杉烷?19?酸）可有效減少酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠血清中一氧化氮、腫瘤壞死因子?α、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、單核細(xì)胞趨化蛋白1的含量，從而減輕炎性反應(yīng)［5］。半邊旗主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA與RNA和蛋白質(zhì)合成［6?7］，阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期［8］，起到殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

藥用植物親緣學(xué)研究結(jié)果表明，親緣關(guān)系近的植物含有結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)相似化學(xué)成分的生理活性多相似［9］，根據(jù)該原理從鳳尾蕨屬其他種類植物中尋找具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的對(duì)映貝殼杉烷型二萜類藥物。本研究結(jié)果表明，與半邊旗同屬的鳳尾蕨屬植物劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草和井欄邊草也具有抗白血病作用，但半邊旗和刺齒鳳尾蕨對(duì)HL?60細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，4.0 g/L半邊旗和刺齒鳳尾蕨乙醇提取物中，HL?60細(xì)胞的存活率均為0；半邊旗和蜈蚣草對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，4.0 g/L半邊旗和蜈蚣草乙醇提取物中，K562細(xì)胞的存活率分別為0和7.70%。

綜上所述，5種鳳尾蕨屬植物均可抑制HL?60細(xì)胞和K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)HL?60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于K562細(xì)胞；除半邊旗外，刺齒鳳尾蕨和蜈蚣草可能是潛在的抗白血病藥物。