西瓜新炭疽病病原菌分子鑒定及其生物學(xué)特性初探

黃 蔚，崔麗紅，謝王超，肖國強

（1湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南湘西 416000；2永順縣高坪鄉(xiāng)農(nóng)技和農(nóng)村合作經(jīng)濟服務(wù)站，湖南永順 416000）

0 引言

西瓜炭疽病是西瓜栽培中的重要病害，保護地、露地均普遍發(fā)生。近10年來，隨著國家扶貧力度的加大，湖南湘西自治州西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但同時西瓜炭疽病病害也日趨嚴重。據(jù)筆者2016—2018年連續(xù)3年田間調(diào)查，湘西自治州每年西瓜種植地炭疽病發(fā)病率高達40%～60%，特別是重茬地，達100%，經(jīng)濟損失高達50%。目前，國內(nèi)外對西瓜炭疽病的研究多集中在病害發(fā)生規(guī)律和致病性方面，多采用形態(tài)學(xué)和田間觀察的方法進行分類鑒定，普遍認為瓜類炭疽病(Colletorichum orbiculare)是引起西瓜炭疽病的致病菌[1-3]。但2018年筆者從湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園里采集西瓜炭疽病病葉中，首次發(fā)現(xiàn)炭疽屬的膠孢炭疽病也可使西瓜致病。為探究其對西瓜的致病機理，對其進行生物學(xué)特性研究和初探，旨在為其引起的病害提供防治依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

西瓜炭疽病標樣2019年7月采于湖南省吉首市湘西職院科技園西瓜試驗地內(nèi)（原作物為黃桃），品種‘早春紅玉’。

1.2 病原菌分離純化

將所采集的病葉先用自來水沖洗干凈，再用8‰次氯酸鈉浸泡3 min，無菌水沖洗3遍。吸干水分后，再用已滅菌的剪刀剪取病葉病健交界處1 cm×1 cm的小片，而后置于PDA平板上，放于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)。3天后挑取菌落邊緣的白色菌絲再次培養(yǎng)。待7天后菌落較大時用打孔器（已滅菌）打取Φ=6 mm的菌塊，放入50%甘油（已滅菌），于-80℃的超低冰箱保存，以供生物學(xué)研究和18S rDNA-ITS分子鑒定[4]。

1.3 病害癥狀描述

于2019年7月采集西瓜炭疽病病葉時觀察記載其田間危害癥狀。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 病原菌形態(tài)特征觀察 將純化后的C913病原菌菌株接種于PDA平板，28℃恒溫培養(yǎng)，7天后采用十字交叉法測量菌塊直徑。待15天產(chǎn)孢后，采用Neubauer血球計數(shù)法測量其大小和數(shù)量，并在電子顯微鏡下其觀察分生孢子形態(tài)。

1.4.2 柯赫氏法則驗證 采集健康的‘早春紅玉’西瓜葉片，先用水沖洗3～5 min，自然干后用75%酒精表面消毒30 s，無菌水清洗3次，而后將已滅菌的藥棉包扎葉柄處。以水瓊脂為對照，用無菌打孔器(Φ=6 mm)打取C913菌株菌塊10片以備用。

用一次性針頭(Φ=1.2 mm)將西瓜葉片背面劃傷，然后將已打取好的C913菌塊接種到葉片上，每葉片接種1處，共接種10片。而后置于L//D=16 h//8 h、白天35℃/黑暗25℃、濕度為90%的人工氣候箱中，3天后觀察葉片發(fā)病癥狀并測量病斑直徑。

1.4.3 病原菌18r DNA-ITS序列分析及進化樹構(gòu)建 采用真菌通用引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)對病原菌的ITS和5.818S rDNA進行PCR擴增。反應(yīng)體系25μL：0.5μLTemplate（基因組DNA20～50ng/μL），2.5 μL 10×Buffer(withMg2+)，1 μLdNTP（各2.5mmol/L），0.2 μLTaq酶 ，0.5 μL F(10 μmol/L)，0.5 μL R(10 μmol/L)，19.3 μL ddH2O。擴增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min，最終4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank的Nr數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，提取比對結(jié)果中前86株菌的18S rDNA序列，用Mage 7.0分析自帶的Clustal W程序進行序列比對，將結(jié)果采用鄰接法(neighbourjoining，N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。替換模型選擇Kimura 2-parameter model，Bootstrap replications設(shè)置為1000。

1.4.4 病原菌對桃、梨的致病性鑒定 采集試驗地旁邊健康的桃葉（品種‘黃桃’）、梨葉（品種‘金秋梨’）。致病性鑒定同1.4.2。

1.5 病菌生物學(xué)特性測定

1.5.1 溫度對C913菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 用滅菌過的打孔器(Φ=6 mm)打取菌塊，置于PDA培養(yǎng)基，設(shè)置10、15、20、25、28、34、37℃共7個溫度梯度。采用1.4.1的方法測定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。28℃恒溫培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)，7天后采用1.4.1的方法測定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.5.2 pH對C913菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 用滅菌過的打孔器(Φ=6 mm)打取菌塊，置于PDA培養(yǎng)基，設(shè)置pH 5、6、7、8、9、10、11共7個梯度。采用1.4.1的方法測定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。28℃恒溫培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)，7天后采用1.4.1的方法測定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)量孢。

1.5.3 碳源、氮源對C913菌絲生長的影響 以水瓊脂為對照，Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制碳源培養(yǎng)基時分別將Czapek中的蔗糖等量替換為乳糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘露醇；配制氮源培養(yǎng)基時分別用谷氨酸、蛋白胨、甘氨酸、(NH4)2SO4等量替換Czapek中的NaNO3。每處理5次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)，7天后用直尺測量菌落直徑大小[5-7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

該病危害西瓜葉片時，開始出現(xiàn)水漬狀小斑點，后逐漸為褐色病斑，大小不一的近圓形或不規(guī)則病斑，邊緣有明顯的淡黃色暈圈包圍病斑，后期病斑從中心凹陷直至穿透（圖1）。發(fā)病嚴重且空氣濕度較大時，在西瓜葉病斑背面附有橘紅色孢子。

圖1 西瓜炭疽病病葉癥狀（田間采集）

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌形態(tài)特征 在PDA平板上培養(yǎng)5天后，該病原菌菌落呈圓形，菌絲絨毛狀（圖2），排列整齊，初為白色，后漸為灰白色。15天后，以菌落為中心，輪狀排列分生孢子盤，并有橘紅色分生孢子團（圖3）。圓柱形分生孢子，兩端鈍圓，單胞，中間有隔，大小(9.8～17.5)μm× (4.5～5.9)μm（圖4）。參照《真菌鑒定手冊》[8]及《植物病原真菌學(xué)》[9]，鑒定C913原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloesporioides。

圖2 C913菌落（正面）

圖3 C913分生孢子團

圖4 C913病原菌分生孢子顯微形態(tài)特征

2.2.2 柯赫氏法則證病結(jié)果 采用刺傷接種法，將分離純化法得到的C913病原菌接種到健康的西瓜葉片上后，發(fā)現(xiàn)接種葉片所發(fā)病癥與各自在田間的病片一致，接種部位先有近圓形的褐色小斑點出現(xiàn)，后逐漸擴大且有少許白色粉狀物出現(xiàn)，7天后有明顯的橘紅色孢子（圖5）。表明分離的真菌符合柯赫氏法則，即所得真菌是西瓜炭疽病的病原菌。

圖5 C913病原菌接種西瓜離體葉片7天后癥狀

2.2.3 病原菌18S rDNA-ITS序列分析測定 經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳，利用真菌18S rDNA通用引物NS1/NS6，進行PCR擴增，獲得長度約為1300 bp的片段（如圖6所示）。將獲得的序列測序并上傳到NCBI進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株C913的18S rDNA序列與GenBank中收錄的膠孢炭疽菌（登錄號分別為MT763957.1、AJ391908.1、DQ916151.1和MK299420.1）相似性達到100%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株C913與親緣關(guān)系最近的4株菌均為Colletotrichumsp.，其中2株為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides且處于同一個大的分支，而與炭疽菌屬內(nèi)其他真菌的遺傳關(guān)系較遠（圖7）。18S rDNA系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，菌株C913很可能為膠孢炭疽菌[10]。

圖6 C913病原菌的18S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖7 C913菌株的18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.2.4 病原菌對桃、梨的致病性鑒定 將分離純化法得到的C913病原菌采用刺傷接種法接種到健康的桃、梨葉片上（L//D=16 h//8 h，白天35℃/黑暗25℃，濕度為90%的人工氣候箱中）。發(fā)現(xiàn)接種葉片所發(fā)病癥與各自在田間的病癥一致，接種后2天桃葉片病斑8 mm、梨葉片病斑10 mm，且病斑上均有少量白色粉狀物，接種4天后病斑明顯擴大，并伴有明顯的橘紅色孢子（圖8）。說明從西瓜病葉上分離出的膠孢炭疽病菌C913不僅可使桃致病，也可使梨致病。這可能是西瓜地旁邊種植的桃葉或梨葉受膠孢炭疽病侵害后，其孢子飄到西瓜葉上，導(dǎo)致西瓜產(chǎn)生了病害，也有可能是原有試驗地所栽的桃殘留下來的膠孢炭疽病引起的病害。

圖8 桃離體葉片接C913后4天（左）和梨離體葉片接種C913后4天（右）的癥狀

2.3 病菌生物學(xué)特性測定結(jié)果

2.3.1 溫度對C913菌絲生長、產(chǎn)孢量的影響 試驗結(jié)果表明，溫度對C913膠孢炭疽菌的菌絲生長和產(chǎn)孢量影響明顯（圖9）。其菌絲在溫度為10～37℃時均能生長正常，但25℃時菌絲生長速度最快，菌落直徑為78.28 mm，其次為28℃，菌落直徑為71.60 mm，而小于10℃或大于37℃時較慢。溫度28℃時C913產(chǎn)孢量最多，其次為25℃和31℃，而小于20℃或大于34℃時不產(chǎn)孢。這表明C913菌絲生長、孢子生長最適溫度分別為20～31、25～31℃。

圖9 不同溫度對C913菌株生長和產(chǎn)孢量的影響

2.3.2 pH對C913菌絲生長、產(chǎn)孢量的影響 試驗結(jié)果表明，pH的大小對C913膠孢炭疽菌的菌絲生長和產(chǎn)孢量影響明顯（圖10），菌絲孢子在pH 5～11條件下均能生長，其中，pH 6時菌絲生長最快，菌落直徑最大，為84.62 mm，但與pH 7～10時的菌絲生長相差不大，表明C913膠孢炭疽菌的菌絲最適pH 6～10；pH 9時，C913膠孢炭疽菌的產(chǎn)孢量最多，為2.285×107個/皿，明顯高于其他pH的產(chǎn)孢量，這表明C913膠孢炭疽菌的產(chǎn)孢最適為pH 9。

圖10 不同pH培養(yǎng)基對C913菌株菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.3.3 碳源、氮源對C913膠孢炭疽菌菌絲生長的影響從表1可知，碳源、氮源對C913膠孢炭疽菌的菌絲生長影響較大（表1）。其中，以葡萄糖、蔗糖作為碳源培養(yǎng)基，其菌落直徑極顯著高于其他處理，分別為63.4、62.2 mm；甘露醇、果糖、麥芽糖也顯著高于對照瓊脂，菌落直徑分別為57.5、60.9、52.7 mm，而乳糖明顯不利于其菌絲生長 (P＜0.01)，為 33.1 mm，比對照少19.06%。蛋白胨作為氮源極顯著高于其他氮源，菌落直徑為65.5 mm，其次為硝酸鈉，菌落直徑為52.9 mm，而硫酸銨對菌絲生長有抑制作用，其菌落直徑依次為蛋白胨＞NaNO3＞甘氨酸＞谷氨酸＞瓊脂＞(NH4)2SO4。

表1 不同碳源、氮源對C913膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

3 討論與結(jié)論

西瓜炭疽病是全球西瓜產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害，其研究主要為形態(tài)學(xué)和致病性鑒定。唐建輝[1]、唐爽爽[2]、羅婷[3]、Jenkins[11]等的研究結(jié)果表明，西瓜炭疽病致病菌為瓜類炭疽菌(Colletorichum orbiculare)。本試驗通過田間觀察，結(jié)合室內(nèi)孢子形態(tài)觀察和18S rDNA-ITS測序結(jié)果，確定所采集的西瓜炭疽病病葉致病菌為膠孢炭疽病。將該菌株離體接種至桃、梨葉片，發(fā)現(xiàn)能同時使桃葉、梨葉致病。這說明C913不僅可使西瓜發(fā)病，也可使桃梨發(fā)病，這是國內(nèi)外研究者所沒有報道過的。關(guān)于膠孢炭疽病，前人研究較多，如胡永亮[12]研究表明膠孢炭疽病是鐵皮石斛炭疽病的致病菌。余鳳玉[5]認為膠孢炭疽病是春羽葉斑病的致病菌。李河[13]通過形態(tài)學(xué)觀察和ITS-CAL-GAPDH序列分析，認為油茶炭疽病除膠孢炭疽病外，還有其他病菌。本試驗中所采集的病葉，致病菌可能與環(huán)境有關(guān)，因為此地原為黃桃的種植地，后改為西瓜試驗地，有可能是殘留的黃桃膠孢炭疽病引起的。同時，西瓜病葉采集時間為7月初，此時試驗地周邊的桃、梨葉片受到膠孢炭疽病的危害較重，也有可能是其孢子飄到了西瓜葉片上導(dǎo)致了西瓜炭疽病。

本試驗結(jié)果表明，膠孢炭疽病能使西瓜產(chǎn)生病害，所分離得到的菌株C913菌絲生長最適溫度為20～31℃，孢子生長最適溫度為25～31℃。在pH 5～11條件菌絲孢子均能生長，pH 6時菌絲生長最好，pH 9時最適產(chǎn)孢。C913膠孢炭疽菌對不同碳源的利用能力不同，其中以葡萄糖、蔗糖為碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑極顯著高于其他碳源，而以乳糖為碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑明顯不利于菌絲生長(P＜0.01)，比對照少19.06%。以蛋白胨為氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑極顯著高于其他氮源，而以硫酸銨為氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑對菌絲生長有抑制作用，其菌落直徑依次為蛋白胨＞NaNO3＞甘氨酸＞谷氨酸＞瓊脂＞(NH4)2SO4。

本研究病原的采集范圍較窄，材料僅來源于試驗基地，其他種植地區(qū)尚未進行，且病原材料僅限于西瓜病葉，缺少西瓜蔓和果實材料的研究。對所得的C913菌株僅進行了形態(tài)學(xué)觀察、18S rDNA-ITS分子鑒定和生物學(xué)特性初探。下一步將繼續(xù)擴大病原材料鑒定范圍和病原的組織部位，繼續(xù)探究其致病機理，以期為西瓜炭疽病的防控及抗性育種提供理論依據(jù)。