miR-140抑制卵巢癌細(xì)胞增殖促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡及靶向抑制CMTM6表達(dá)

楊俊，祝徳，段智慧，張子月*

（1巴中市中心醫(yī)院，巴中 636000；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院老年科，四川 610036）

卵巢癌是女性生殖器官中常見的三大惡性腫瘤之一，每年因卵巢癌病死的婦女就有14萬(wàn)[1,2]。因此迫切需要尋找針對(duì)卵巢癌相關(guān)早期診斷方法，為卵巢癌的早期診斷提供相應(yīng)的理論依據(jù)。MicroRNA是真核生物中一類小分子非編碼RNA，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[3-5]。有研究報(bào)道，miR-140在膽管癌[6]、胰腺癌[7]、乳腺癌[8]等多種腫瘤中起著重要的作用。然而，miR-140在卵巢癌中的表達(dá)模式及對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，尚不清楚。趨化素樣因子超家族6（chemokine-like factor superfamily 6，CMTM6）廣泛存在于人體正常組織中，主要存在于細(xì)胞膜上和參與胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的胞內(nèi)體上[9]。Guan[10]等通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和全基因組分析發(fā)現(xiàn)，CMTM6能夠調(diào)控T細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的殺傷，提示CMTM6可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體-配體1（programmed death receptor ligand 1，PD-L1）在人三陰性乳腺癌[11]細(xì)胞中高表達(dá)。進(jìn)一步有研究表明，CMTM6與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，共同調(diào)控著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。目前關(guān)于miR-140是否可能通過(guò)調(diào)控CMTM6表達(dá)影響卵巢癌進(jìn)展尚不清楚，因此，本研究將探究miR-140是否調(diào)控CMTM6及PD-L1的表達(dá)及其與卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系，為明確miR-140在卵巢癌中發(fā)揮的作用提供線索。

材料與方法

1 試劑與儀器設(shè)備

人源卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（貨號(hào)：40384840451）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：SH30809.01）、胎牛血清（貨號(hào)：SH30080.03）、0.25%的胰酶消化液（貨號(hào)：SH30042.01）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：23250）、MTT檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：4890-025-K）購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：556547）購(gòu)自美國(guó)BD公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：CA1170）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KGA7037-1）購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KA3784）購(gòu)自上海群己生物科技有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（貨號(hào)：11668027）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；對(duì)照miR-140 inhibitor（Inhibitor NC）、miR-140 inhibitors（Inhibitor）、對(duì)照miR-140 mimic（Mimic NC）、miR-140 mimics（Mimic）、pcDNA3.0-CMTM6質(zhì) 粒 由 生工生物有限公司合成。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（Perfect Real Time）（貨號(hào)：RR047AA）、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（貨號(hào)：RR820A）購(gòu)自日本TAKARA公司；兔抗人CMTM6（貨號(hào)：Ab198284）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，兔抗人PD-L1（貨號(hào)：#15165）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；兔抗人c-Myc（貨號(hào)：MAB3696）、兔抗人cyclin D1（貨號(hào)：MAB4314）、鼠抗人Bcl-2（貨號(hào)：AF810）、鼠抗人Bax（貨號(hào)：AF820）、鼠抗人Caspase-3（貨號(hào)：AF835）購(gòu)于美國(guó)R&D；GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；FACSCanto II流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司；酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀購(gòu)自芬蘭雷勃Multiskan MK-3；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Invitrogen凝膠成像儀購(gòu)自賽默飛。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞置于10% FBS RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，每隔兩天換一次液，細(xì)胞融合度為80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3 分組與處理方法

將SKOV3細(xì)胞以1×106cell/mL密度接種1 mL于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后分6組：空白對(duì)照組（Con）、Inhibitor-NC組、miR-140 inhibitor（Inhibitor）組、Mimic-NC 組、miR-140 mimic （Mimic）組、miR-140 mimic+pcDNA3.0-CMTM6（Mimic+CMTM6）組，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4 MTT法及EdU染色測(cè)定細(xì)胞增殖

MTT法：按方法3處理細(xì)胞，以1×105cell/mL接種100 μL于96孔板，4 8h后按照MTT試劑盒說(shuō)明書在每孔細(xì)胞中加入150 μL MTT試劑，孵育4 h，去除上清液加入100 μL二甲基亞砜，待沉淀溶解后在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度（optical density，OD）。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD×100%。

EdU染色：將各組SKOV3細(xì)胞接種在24孔板培養(yǎng)，24 h后加入適量EdU試劑，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)細(xì)胞EdU陽(yáng)性率：EdU陽(yáng)性率（%）=（陽(yáng)性EdU細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目）×100%。

5 流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)：Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。按方法3處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒的說(shuō)明書，分別在細(xì)胞中先添加FITC-AnnexinV 5 μL 再添加 PI 5 μL，然后室溫避光反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

TUNEL染色：將各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，多聚甲醛（4%）固定細(xì)胞后PBS洗滌， 含0.1% Triton X-100的PBS孵育2 min，于熒光顯微鏡下觀察，綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核（DAPI），凋亡指數(shù)（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

6 RT-qPCR檢測(cè)SKOV3細(xì)胞CMTM6、PD-L1 mRNA表達(dá)水平

按方法3處理細(xì)胞，24 h后用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并通過(guò)SYBR Green試劑盒檢測(cè)CMTM6、PD-L1的 mRNA表達(dá)水平。循環(huán)條件如下：95 ℃ 10 min，然后 94 ℃ 10 s，58 ℃ 25 s和72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)，然后72℃ 10 s。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

7 Western blot檢測(cè)CMTM6、PD-L1、增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平

按方法3處理細(xì)胞，24 h后用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌3次，細(xì)胞刮將細(xì)胞收集到2 mL的EP管加入蛋白酶抑制劑RAPI裂解液，冰上裂解15 min，13000 r/min離心10 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白變性5 min，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，封閉1 h，加入CMTM6（1∶1000）、PD-L1（1∶1000）、c-Myc（1∶1000）、cyclin D1（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase-3（1∶ 1000）、GAPDH（1∶ 1000） 抗體，4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）孵育1 h，ECL底物顯色，Invitrogen凝膠成像儀成像，Image J軟件測(cè)定蛋白條帶光密度值，以目的蛋白條帶光密度與內(nèi)參蛋白光密度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

8 雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)miR-140與CMTM6的靶向關(guān)系

應(yīng)用TargetScan網(wǎng)站確定miR-140與CMTM6結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增CMTM6上與miR-140序列相結(jié)合的3’-UTR片段，構(gòu)建pmirGLO-CMTM6-wt野生型載體，經(jīng)基因突變技術(shù)突變結(jié)合位點(diǎn)以構(gòu)建pmirGLOCMTM6-mut突變型載體；將兩個(gè)重組載體分別與miR-140 mimic、對(duì)照miR（miR-NC）共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，分為CMTM6-WT+Mimic組、CMTM6-WT+miR-NC組、CMTM6-Mut+Mimic組、CMTM6-Mut+miR-NC組，48 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定SKOV3細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 沉默miR-140促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖

為了明確miR-140是否與卵巢癌細(xì)胞活力和增殖有關(guān)，分析了沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示：與Con組相比，inhibitor-NC組miR-140表達(dá)、細(xì)胞存活率、EdU陽(yáng)性率、c-Myc、cyclin D1水平?jīng)]有顯著變化，而miR-140 inhibitor組miR-140表達(dá)顯著降低，SKOV3細(xì)胞活力、EdU陽(yáng)性率明顯增加，c-Myc、cyclin D1等增殖相關(guān)蛋白水平也顯著增加（表2，圖1、2）。

表2 沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞活力、增殖相關(guān)蛋白水平和增殖能力影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.2 Statistical analysis for the effect of silencing miR-140 on the viability, the levels of proliferation-related proteins and the proliferation ability of SKOV3 cells

圖1 沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響。A，SKOV3細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè)；B，SKOV3細(xì)胞增殖能力的代表性EdU染色檢測(cè)Fig.1 Effect of miR-140 inhibitor on proliferation of SKOV3 cells.A, representative Western blot detection for the levels of proliferation-related proteins in the SKOV3 cells; B, representative detection by EdU staining for proliferation of SKOV3 cells

2 沉默miR-140表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞凋亡

對(duì)miR-140表達(dá)水平與卵巢癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系分析顯示：與對(duì)照組相比，Inhibitor-NC組凋亡率、凋亡指數(shù)、Bcl-2、Bax、Caspase-3沒有顯著變化，Inhibitor組細(xì)胞凋亡率、凋亡指數(shù)和Bax、Caspase-3水平顯著降低，Bcl-2水平顯著升高（圖2，表3）。

圖2 沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。A，細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；B，細(xì)胞凋亡的TUNEL染色檢測(cè)；C，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的Western blot檢測(cè)Fig.2 Effect of miR-140 inhibitor on apoptosis of SKOV3 cells.A, detection of apoptosis by Annexin V-FITC / PI flow cytometry; B, detection of apoptosis by TUNEL staining; C, detection of apoptosis related proteins by Western blot

表3 沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.3 Statistical analysis for the effect of miR-140 inhibitor on apoptosis of SKOV3 cells

3 沉默miR-140上調(diào)SKOV3細(xì)胞CMTM6和PDL1 表達(dá)

CMTM6和PD-L1參與多種癌癥的發(fā)生[10-12]，為了了解miR-140是否通過(guò)調(diào)控CMTM6及PD-L1影響卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡，應(yīng)用Western blot和qRTPCR檢測(cè)了沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)CMTM6和PD-L1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Inhibitor-NC組CMTM6和PD-L1 蛋白和mRNA水平無(wú)顯著變化，而inhibitor組CMTM6和PD-L1 蛋白和mRNA水平顯著增加（圖3），即沉默miR-140使SKOV3細(xì)胞CMTM6和PD-L1的表達(dá)增加，提示miR-140能調(diào)節(jié)CMTM6及PD-L1的表達(dá)。

圖3 沉默miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞CMTM6和PD-L1 表達(dá)的影響。A，CMTM6和PD-L1水平的代表性Western blot檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B，CMTM6和PD-L1 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)；與對(duì)照組相比：aP＜0.05Fig.3.Effect of miR-140 inhibitor on the expression of CMTM6 and PD-L1 in the SKOV3 cells.A, aP＜0.05 compared with control group.A, representative Western blot detection and statistical analysis of the level of CMTM6 and PD-L1; B, qRT-PCR assay for mRNA expression of CMTM6 and PD-L1; aP＜0.05, compared with the control group

4 過(guò)表達(dá)CMTM6減弱miR-140過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制

進(jìn)一步對(duì)CMTM6在miR-140影響SKOV3細(xì)胞增殖中的作用檢測(cè)顯示：Mimic-NC組miR-140表達(dá)、細(xì)胞活力、c-Myc、cyclin D1增殖蛋白水平和EdU陽(yáng)性率與對(duì)照組沒有顯著差異；與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)miR-140的Mimic組miR-140表達(dá)顯著增加，SKOV3細(xì)胞活力、EdU陽(yáng)性率明顯降低，c-Myc、cyclin D1增殖相關(guān)蛋白水平也顯著降低，miR-140過(guò)表達(dá)所致的這些變化可被過(guò)表達(dá)CMTM6明顯減弱（表4，圖4）。

表4 過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞活力、增殖相關(guān)蛋白水平和增殖能力影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.4 Statistical analysis for the effect of smiR-140-overexpression on the viability, the levels of proliferation-related proteins and the proliferation ability of SKOV3 cell

圖4 過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響。A，SKOV3細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè)；B，SKOV3細(xì)胞增殖的代表性EdU染色檢測(cè)（比例尺，50 μm）Fig.4 Effect of miR-140-overexpression on the proliferation of SKOV3 cells.Representative Western blot detection for the levels of proliferation-related proteins in the SKOV3 cells; B, detection by EdU staining for the proliferation of SKOV3 cells; scale bar, 50 μm

5 過(guò)表達(dá)CMTM6抑制miR-140過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的促進(jìn)

對(duì)CMTM6在miR-140影響SKOV3細(xì)胞凋亡中的作用檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，Mimic-NC組凋亡率、凋亡指數(shù)、Bcl-2、Bax、Caspase-3沒有顯著變化，過(guò)表達(dá)miR-140 （Mimic組）細(xì)胞凋亡率、凋亡指數(shù)、Bax、Caspase-3顯著升高，Bcl-2顯著降低；與Mimic組相比，Mimic+ CMTM6組凋亡率、凋亡指數(shù)、Bax、Caspase-3顯著降低，Bcl-2顯著升高，即過(guò)表達(dá)CMTM6能顯著抑制過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的促進(jìn)（圖5，表5）

圖5 過(guò)表達(dá)CMTM6對(duì)miR-140過(guò)表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡作用的影響。A，細(xì)胞凋亡的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析；B，凋亡相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot檢測(cè)；C，細(xì)胞凋亡的代表性TUNEL染色（比例尺，100 μm）Fig.5 Effect of overexpression of CMTM6 on overexpression of miR-140’s promoting effect on apoptosis of SKOV3 cells

表5 過(guò)表達(dá)CMTM6對(duì)miR-140過(guò)表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡作用影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.5 Statistical analysis for effect of overexpression of CMTM6 on overexpression of miR-140’s promoting effect on apoptosis of SKOV3 cells

6 過(guò)表達(dá)CMTM6減少miR-140過(guò)表達(dá)對(duì)PD-L1表達(dá)的抑制

為了明確miR-140是否通過(guò)CMTM6影響PDL1的表達(dá)，繼而檢測(cè)了過(guò)表達(dá)CMTM6對(duì)過(guò)表達(dá)miR-140的SKOV3細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響。Western blot檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，Mimic-NC組中CMTM6和PD-L1水平?jīng)]有顯著變化，Mimic組中CMTM6和PD-L1水平顯著降低；而與Mimic組相比，Mimic+ CMTM6組中CMTM6和PD-L1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（圖6A）。qRT-PCR檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，Mimic-NC組中CMTM6和PD-L1 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，Mimic組中CMTM6和PD-L1 mRNA表達(dá)水平顯著降低；而與Mimic組相比，Mimic+ CMTM6組中CMTM6和PDL1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（圖6B）。

圖6 CMTM6在miR-140過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞PD-L1表達(dá)影響中的作用檢測(cè)。A，CMTM6和PD- L1水平的Western blot檢測(cè)；A1，CMTM6和PD- L1水平的代表性 Westernblot檢測(cè)結(jié)果；A2，CMTM6和PD- L1水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B，qRT-PCR檢測(cè)CMTM6和PD- L1 mRNA水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Con相比，aP＜0.05；與Mimic組相比，bP＜0.05；n=6Fig.6 Detection for the role of CMTM6 in the effect of overexpression of miR-140 on PD-L1 expression in SKOV3 cells.A, representative Western blot examination of the levels of CMTM6 and PD-L1; B, statistical analysis for the levels of CMTM6 and PD-L1; aP＜0.05, compared with control group;bP＜0.05, compared with miR-140 mimics group; n=6

7 miR-140靶向抑制CMTM6表達(dá)

TargetScan預(yù)測(cè)顯示：miR-140和CMTM6間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖7A）。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示：miR-140 mimics能顯著抑制野生型CMTM6表達(dá)，對(duì)突變型CMTM6的表達(dá)無(wú)明顯影響（圖7B），證明miR-140能靶向抑制CMTM6的表達(dá)。

圖7 miR-140對(duì)CMTM6靶向作用分析。A，miR-140與CMTM6靶向結(jié)合位點(diǎn)的TargetScan預(yù)測(cè)；B，miR-140對(duì)CMTM6靶向作用的雙熒光素酶報(bào)告基因分析；與Mimic-NC組比較，aP＜0.05；n=6。Fig.7 Analysis of the targeting effect of miR-140 on CMTM6.A, TargetScan prediction of targeted binding sites of miR-140 and CMTM6; B, analysis of double luciferase reporter gene for the targeting effect of miR-140 on CMTM6; aP＜0.05, compared with Mimic-NC group; n=6.

討 論

卵巢癌在女性生殖器官腫瘤中被認(rèn)為是最致命的婦科腫瘤疾病，由于早期發(fā)病不容易察覺，并且診斷困難，導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率較高[13]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展針對(duì)卵巢癌的治療有些改善，但是卵巢癌治療效果不理想及預(yù)后較差。因此尋找新的靶點(diǎn)對(duì)于提高卵巢癌的治療效果非常重要。

microRNA是由長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸組成的一類小分子非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，它通過(guò)調(diào)控重要的靶基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中參與腫瘤的調(diào)節(jié)。miR-140最初被發(fā)現(xiàn)在軟骨組織中，編碼該基因位于16號(hào)染色體上[14]。有研究表明，過(guò)表達(dá)miR-140

可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲從而抑制肺癌發(fā)生發(fā)展[15]；miR-140通過(guò)靶向抑制YES1基因的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[16]；miR-140通過(guò)調(diào)控自噬及Smad2的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的存活及侵襲能力[17]；沉默miR-140能夠促進(jìn)早期乳腺癌癌癥干細(xì)胞的形成[18]，然而，miR-140對(duì)乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-140表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2水平，抑制細(xì)胞凋亡、Bax、Caspase-3蛋白水平。該結(jié)果表明，miR-140表達(dá)沉默促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為；而過(guò)表達(dá)miR-140能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及下調(diào)c-Myc、cyclin D1、Bcl-2蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白水平。這說(shuō)明miR-140過(guò)表達(dá)可能有助于抑制SKOV3細(xì)胞的惡性增殖，可能通過(guò)某些機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

腫瘤的發(fā)生和免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系。PDL1在多種腫瘤細(xì)胞的表面表達(dá)上調(diào)，包括卵巢癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤等，與受體PD-1結(jié)合能對(duì)T細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、免疫效能的發(fā)生產(chǎn)生抑制作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[19,20]。因此阻斷PD-L1與受體PD-1結(jié)合已經(jīng)成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。CMTM6存在于不同的細(xì)胞器上，它在不同的腫瘤組織中表達(dá)的水平有差異，在肝癌、卵巢癌組織中高表達(dá)，而在肺癌、腎癌組織中呈低表達(dá)。Burr[21]等通過(guò)用全基因組研究發(fā)現(xiàn)，CMTM6可以與PD-L1結(jié)合并在細(xì)胞表面進(jìn)行停留，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，說(shuō)明CMTM6對(duì)PD-L1的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。但是他們是如何進(jìn)行調(diào)控的我們目前的研究還不是很清楚，也不確定CMTM6在腫瘤中處于一種什么樣的狀態(tài)。Mezzadral[22]等通過(guò)基因敲除CMTM6觀察到，敲除CMTM6能抑制PD-L1泛素化起到保護(hù)PD-L1的作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-140表達(dá)可促進(jìn)CMTM6及PD-L1表達(dá)，而miR-140過(guò)表達(dá)可顯著抑制CMTM6及PD-L1表達(dá)，該結(jié)果表明miR-140對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的影響可能與其調(diào)控CMTM6表達(dá)有關(guān)?；诖?，本研究通過(guò)對(duì)其驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，CMTM6高表達(dá)可促進(jìn)PD-L1表達(dá)，同時(shí)也促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡；本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了CMTM6與miR-140的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，CMTM6是miR-140的靶基因，這說(shuō)明miR-140過(guò)表達(dá)可能通過(guò)負(fù)調(diào)控CMTM6來(lái)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、凋亡及PD-L1的表達(dá)。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-140可能通過(guò)抑制CMTM6表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)PD-L1的表達(dá)。本研究不僅對(duì)miR-140與CMTM6的靶向關(guān)系進(jìn)行了研究，還對(duì)卵巢癌的發(fā)生機(jī)制研究具有重要意義。然而，miR-140通過(guò)調(diào)控CMTM6來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及PD-L1表達(dá)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。